电泳技术的发展与应用(一)

电泳技术的发展与应用(一)

作者：张涛吴刚李丽娜刘扬

【关键词】电泳

电泳（Electrophoresis）是利用带电粒子在电场中发生移动的一种分离方法。近年来随着基因组学、蛋白质组学的发展，许多新的电泳技术也随之孕育而生。单细胞凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳、双向电泳、毛细管电泳技术的产生，使得DNA及蛋白质在分离和测量方法上有了更精确的提高。另外高效毛细管电泳技术被认为是当今分离生物分子的最重要工具，已被列为人类基因组计划首选分离DNA片段的方法。同时这些先进的电泳技术在现代生物医学研究中也起到了非常重要的作用，本文即对以上几种新的电泳技术的发展与应用加以综述。1单细胞凝胶电泳

单细胞凝胶电泳（SingleCellGelElectrophoresisAssay，SCGE）又称彗星试验（CometAssay）。它的分离原理是根据当各种内源性或外源性DNA损伤因子诱发DNA链断裂时，DNA的超螺旋结构被破坏，在细菌裂解液作用下，细胞内的蛋白质、RNA等扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量过大停留在原位。在中性条件时，残留的DNA片段可进入凝胶发生迁移，这时用碱处理或在碱性电解质条件下，DNA会发生解螺旋，释放出DNA断裂片段，由于这些DNA片段的分子量很小，在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形成彗星状的图像；而未损伤的DNA部分保持球形。在一定条件下，DNA的迁移距离（彗星尾长）和DNA的含量（荧光强度）与DNA损伤呈线性相关，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移距离可以推测出DNA的损伤程度1]。

由于SCGE具有敏感、简便、快速、低耗等优点，因此被广泛应用在DNA的损伤与修复、遗传毒理、环境监测以及氧化应激和细胞凋亡等研究中2]。例如在检测外界因素对细胞核DNA 的损伤中，SCGE有其独特之处，主要体现在它可以将各种类型的细胞的不同反应有效地反映出来3]。利用单细胞凝胶电泳法测定镍化物对人血细胞DNA的损伤，检测冰冻保存对外周血细胞DNA的损伤及检测人精子DNA链断裂等在文献中均有报道4-6]。同时SCGE在DNA 切除修复的研究中也具有重要作用7]。切除修复是人类DNA损伤修复的主要形式，利用SCGE 可进行从损伤到切除修复、合成、连接等每个步骤各个时点的观察，可用于DNA修复的分子机理探讨，所以SCGE在检测DNA损伤及修复中有其他电泳不可替代的作用。

外来理化因素对细胞DNA的损伤是引起基因突变及癌症发生的重要因素，并且诱变DNA损伤和致癌效应也是遗传毒理学研究的重要内容。建立快速灵敏的DNA损伤检测方法，对于毒性因素的检测、细胞DNA的保护都是非常有益的。SCGE不仅能提供DNA损伤信息，还可提供环境物质改变修复过程的信息；运用SCGE在活体进行遗传毒理学研究，可了解药物的毒理作用在不同组织和细胞中的分布。Pool-Zobel8]通过口服或吸入亚硝胺的方法，采用SCGE 研究药物的动物器官特异性作用，认为器官特异性基因毒性作用与器官特异性癌症密切相关。另外环境中的遗传毒物浓度一般很低，用经典的细胞学方法，如用染色体畸变实验（CA）、微核实验（MN）和姐妹染色体交换实验（SCE）进行生物监测时，很难得到明确的阳性结果，但利用SCGE检测低浓度遗传毒物具有高灵敏度，并且适用范围广，可检测各种类型组织细胞，特别是来自于直接与环境遗传毒物接触的人体细胞（如口腔黏膜细胞、鼻腔黏膜细胞、食道黏膜细胞），对T淋巴细胞与B淋巴细胞均敏感，因此SCGE这些年广泛用于环境监测9]。如Rojas等〔10〕用SCGE检测墨西哥城居民脱落的泪管上皮细胞中DNA，发现由于空气中的臭氧与碳氢化合物超标，通过观察泪管上皮细胞DNA受到损伤的程度，确定北部空气中的臭氧浓度偏高于南部地区。

细胞凋亡是细胞增殖、分化和死亡过程的重要调节机制，该机制发生紊乱与肿瘤发生密切相关。凋亡细胞在核碎裂早期出现大量DNA链缺口，在SCGE中大量DNA进入尾部，且迁移距离延长，甚至与“头部”分离，形成不同于一般损伤的特有形态。根据此形态可计算出细胞

凋亡的比例，研究细胞凋亡的机理。由于SCGE的高度敏感性而且能够直接观测单个细胞DNA 片段迁移，所以该技术在细胞凋亡检测中发挥着日益重要的作用11]。另外SCGE在肿瘤学、放射生物学、人群监测、临床诊断与治疗等方面有也具有广泛的应用前景。

2变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophresis，DGGE）是一种实用价值较高研究DNA突变的分析方法。DGGE主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。当电泳开始时，DNA 在胶中的迁移率仅与分子大小有关，一旦DNA移动到某一点，达到该DNA变性浓度位置时，DNA双链开始分开，从而降低了DNA的迁移速率。由于不同的DNA片段具有的碱基组成不同，使得变性条件产生差异，在凝胶上形成不同的条带，从而可以区分DNA突变型和野生型，可以进一步进行基因突变的分析。

另外DGGE还可与PCR联合使用，利用此项技术可以准确鉴定出单碱基替换、移框突变和少于10个碱基的缺失突变。通常先用病人的基因组DNA或者是有突变个体的DNA进行PCR 扩增，然后用DGGE进行分析。最早由DGGE筛查的人类基因是珠蛋白位点，以后又有很多位点被筛查，如生长因子Ⅷ基因、生长因子Ⅸ基因等。并且该法适用于大样本的筛查，对一些罕见突变型的筛查也十分有用。

PCR-DGGE的另一个作用是可分析突变组成即突变谱。主要是利用诱变剂体外诱变人类原始淋巴细胞株，使之生成大量的HPRT-突变体，然后进行PCR扩增，用DGGE分析。用定量PCR-DGGE方法还可以确定标本中某特异DNA序列的拷贝数。其原理是将已知拷贝数的内参照与标本中的靶基因共同扩增，然后DGGE分离两者的扩增产物，根据其比率可以确定标本中靶基因的拷贝数。

DGGE经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳（ConstantDenaturantGelElectrophresis，CDGE），瞬时温度梯度电泳（temporaltemperaturegradientelectrophoresis，TTGE）和温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）等三种类型。现在上述方法广泛应用于突变分析、遗传病的诊断和肿瘤相关基因的筛查等方面12]。

其中CDGE是由DGGE改变而来，二者的主要化学物质和基本方法相似，只是凝胶浓度由垂直DGGE来确定，用均一的变性浓度凝胶代替梯度凝胶，使得整个电泳变得更加简单快速。TTGE检测突变的能力和DGGE相接近，但却不需要变性梯度胶。基本方法是：在含有一定浓度尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，使外界的温度不断增加，这样在跑胶的过程中形成一个温度梯度。变性环境是由恒定浓度的尿素和瞬时温度梯度共同形成，这样使得全过程更加简单迅速，分辨率极高。在TGGE中，变性剂形成的梯度被温度梯度所代替，温度梯度由微处理器控制。它与DGGE相比，更加稳定可靠，使得它的应用最为广泛。我国赵永忠等13]应用TGGE成功地分析了非缺失型地中海贫血突变。Horn等14]采用TGGE方法对Ⅰ-型神经纤维瘤（NFⅠ）患者进行普查，发现了NFⅠ基因3个新突变。随着对各种遗传病和肿瘤分子病理研究的深入，人们发现的遗传病和肿瘤相关基因也会日益增多，TGGE技术也会得到更多的应用。