RNA干扰技术基本原理与应用ppt

RdRp（RNA dependent RNA polymerase）
使异常的RNA转变为dsRNA 参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增 siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp， 形成大量的dsRNA
RNAi的主要过程
效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成 RISC的激活：ATP依赖的解双链过程 在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别）， RISC特异性切 割、降解靶mRNA，导致基 因表达失活
RNAi的发现和发展历程
1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现 反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制 不清 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实 验 “共抑制(co-suppresion)”
RNAi的发现和发展历程
1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达 实 验 首次发现 RNA干扰现象 1998年 Andrew Fire和Craig Mello 发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA 可高效、特异地抑制基因的表达 Nature1998； 391: 806-11 正式提出RNA干扰的概念
RNA干扰技术基本原理 与应用
什么是RNA干扰
RNA干扰(RNA interference，RNAi),又称
转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性 同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使 目的基因的不表达或表达水平下降.
/Stu/shilin/rnai.html /sirna.pl /rnai/ /rnaidesigner/ :9331/RNAi/html/rnai. html
siRNA的制备方法
体外制备方法 化学合成siRNA 体外转录获取siRNA 利用Dicer或 RNaseⅢ消化长的dsRNA成 siRNA
化学合成法制备siRNA
优点： 纯度高 合成量不受限 能被标记 缺点：价格昂贵、合成周期长 用途：已经找到最有效的siRNA的情况下， 需要大量siRNA进行研究
.磷酸钙共沉淀 电穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 机械法 ：显微注射和基因枪 阳离子脂质体试剂
提高转染效率的方法
纯化的siRNA 避免使用抗生素 避免RNA酶污染 较低传代数的细胞 合适的转染试剂 合适的阳性对照 荧光标记的siRNA
RNAi技术的应用
基因组功能研究的新方法 研究信号传导通路的新途径 开展基因治疗的新策略 （抗病毒、抗肿瘤 等） 筛选药物靶点的新工具
RNAi的发现和发展历程
1999年 Tuschl等 报道在哺乳动物中也存在RNAi 2001 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性的 阻断效应，并发现体内分解dsRNA 为 siRNAs (short/small interfering RNA) 的 DICER 酶
RNAi的发现和发展历程
siRNA载体
依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III) ，操纵一 段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表 达。 人源U6启动子 鼠源的U6启动子 人H1启 动子 pol III可在细胞中表达许多的小分子RNA， 通过添加一串（3~6个）U来终止转录的 需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单 链再克隆到载体中
CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点 Barcode：每个shRNA独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择 Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列
siRNA
shRNA
使用代价
持久性 宿主类型 设计
高
最多2周 细胞系 复杂的设计方法
相对较低
可选择获得稳定整合的细胞 原代细胞，胚胎干细胞、细 胞系 完成
获取
应用 检测方法 研究领域
需要合成
瞬时转染 Western杂交、表型分 析RT-PCR、芯片检测 细胞培养
完成
瞬时转染、稳定转染、病毒 侵染 Western杂交、表型分析、 RT-PCR、芯片检测 细胞培养&体内研究
siRNA转染细胞
细胞中内源性dsRNA的形成
基因组中DNA 反向重复序列的转录产物 同时转录反义和正义RNA 病毒RNA 复制中间体 以单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依 赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA
Dicer酶
RNAase III超家族成员。结构中包括一个 螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一 个双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200~500nt的dsRNA作用效果最好，能 降解成25nt左右的siRNA 广泛存在
阴性对照序列的设计
特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且 行BLAST基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG 在特异性siRNA引入1~2个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG
目标序列筛选的相关网站
表达载体法制备siRNA
优点：可以进行较长期研究。载体可以在 细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久 缺点：需要进行克隆，周期长，质粒载体 表达效率较低 用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的 方法
基于PCR的siRNA表达框架(SECs)
组成：RNA pol III启动子 发夹结构siRNA RNA pol III终止位点 制备：PCR ，无需克隆和测序
siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶 共同点 特异性 靶向性
siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶 不同点 独特的双链结构 需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等协同 因子 siRNA 本身无催化活性 在细胞内可能具有相对的稳定性 具有一定的可遗传性
RNAi的主要过程
启动阶段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异 性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割 成siRNA 长度：21-25nt 结构：3ˊ端悬垂两个未配对的碱基UU
2001、2002年连续被Science评为年度十大成就!
目前应用的基因干扰技术
DNA水平的基因干扰技术 基因敲除技术 寡核苷酸与双链DNA 杂交 采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因 子
目前应用的基因干扰技术
mRNA水平的基因干扰技术 用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源 性mRNA 设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白 质, 使mRNA 不稳定 双链RNA 干扰技术（RNAi）
用SECቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ制备siRNA
优点： 可直接由PCR得到，方法简便，时间短 在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出 最 有效的siRNA可用于构建表达载体 可以用来筛选特定研究体系中启动子和 siRNA的最适搭配
用表达框架制备siRNA
缺点： PCR产物很难转染到细胞中 不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可 能产生的误读不能被发现导致结果不理想 用途： 筛选siRNA序列 在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子
HCV表达质粒
共转染
Huh-7 细胞
HCV RNA ↓ 21倍
HCV RNA ↓ 23倍
HCV RNA 无变化
谢 谢!
RNAi技术的实验方法
siRNA的设计原则 序列大小 19-21nt ，最好以A或G开始 从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列， 作为潜在的RNAi靶位点 不要针对5‘和3’端非编码区（untranslated regions，UTRs)
RNAi技术的实验方法
siRNA的设计原则 设计2~4个序列, BLAST 比对基因序列以确 保序列设计的特异性 优先选择 GC 含量30-50%的序列 设计适当的阴性对照序列
RNAi技术抑制HIV的复制
将HIV-1编码rev的基因和同源的dsRNA共 转染到293细胞中，rev基因的表达被显著 抑制 siRNA抑制HIV rev-EGFP的表达，其抑制 率可达到90％；而反义RNA，核酶组与对 照组无显著差异
RNAi技术抑制HCV的复制
NS5B-6133 siRNA + NS3-1948 siRNA + GAPDH siRNA +
体外转录法制备siRNA
优点：简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性 好 缺点：反应规模和量始终有一定的限制 用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs
siRNA的制备方法
细胞内制备方法 依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取 siRNA 通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取 siRNA
查找已经证实的siRNA的网站
/catalog/catego ry.aspx?key=49 /techlib/tb/tb_502.htm l /mmcmanus/www/siRNAD B.html /Order_Entr y/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Publishe d
shRNA： 427 - 431 (25 March) 针对：9,610 human genes 5,563 mouse genes 构建成：28,000个shRNA表达盒(cassettes) 商品化试剂盒：Expression Arrest™ (美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司) 网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需 再耗时耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程
RNAi技术抗病毒
作用 阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录 自然界中普遍存在 在医学上的应用 RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰质炎病 毒 DNA病毒：如HBV
RNAi技术阻止HIV的入侵
Novina将针对CD4的dsRNA导入 能表达 CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 细 胞系），能使细胞表面CD4 表达减少75%； 转染后60 小时后, 再用H IV 感染, 结果发现 CD4-siRNA 转染的细胞很少有包涵体出现 其它试验的受体： CCR 5、CXCR4
2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑 2004年 Morris 等 用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：12891292
RNAi的主要特点和优势
诱导转录后水平的基因沉默 具有高度的特异性 抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间 传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化”