RAW264.7小鼠巨噬细胞protocol

RAW264.7细胞株的相关信息

ATCC:美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写

收到冷冻管细胞的处理方式

1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)。

2. 收到T25 flask细胞的处理方式

于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。

2.1. 检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

2.2. 将原封之T25 flask 静置于37℃， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让

运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。

2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。

RAW264.7细胞株的Cell Culture

一、RAW264.7细胞培养的特点

1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。贴壁特别牢固。

2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。

3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。

4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。

5、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。

二、RAW264.7细胞传代

1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉，然后用D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰

2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml， 37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。（值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感）

3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小

4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶

三、RAW264.7细胞冻存及复苏

（一）细胞冻存

1. 配制冻存培养液；（通用的为培养基：血清：DMSO=7：2：1，但其中的血清可进行调整，如上面的仁兄用的4：5：1，比例过高）

2. 取对数生长期的细胞（冻存前一天换液），用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；

3. 离心1000rpm，5min；

4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml（不超过冻存管容量的80%）；

6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（具体操作为4°C 20min，-20°C30min，-70℃过夜，转入液氮中）

（二）细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。（1min 以内溶解完毕，不能将口进入水面下）

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3. 离心， 1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；(复苏时细胞密度稍大，可提高复苏效率)

5. 次日更换一次培养液，继续培养。（可更换一半培养液，避免跨度太大，影响细胞状态）

（三）接种

四、RAW264.7细胞形态不好时的处理方法

1.倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。

2.把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。

3.如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。

不明之处：培养之前，一切与细胞接触的玻璃器皿和器具都要进行过去热源处理。（200-250℃烘烤4-6h）？？

RAW264.7细胞株Cell Culture的材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱

7. 液氮冰箱

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头、直头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 胶塞

4. 移液管（10ml）

5. 15ml离心管

6. 冻存管（1～2ml）