鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析
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ＶＰ 、 ２和 ＶＰ １ ＶＰ ３基 因的 核苷 酸 全 长 分别 为 ２１ ９ ９ 、 １７ ４ １６ ５ｂ Ｌ 。ＶＰ ６ 、 ０ ｐ７ ］ １与 Ｖ ３基 因 的核苷 酸 非重 Ｐ 叠 序列共 ５ ４ｂ （ ９ ｐ 以下 简 称 ＶＰ ３基 因） １ 。ＶＰ ３为
１ ２ １ 病毒 增 殖及鉴 定 ．．
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材料 ．
类 的主要 自主 性 细小 病 毒 ， 由它 引起 的鹅 细 小 病 毒
病 又名 小 鹅 瘟 ， 重 危 害 养 鹅 业 ［ ］ 严 １ 。ＧＰ 属 细 小 Ｖ
１１ １ 病 毒 ． ．
５株鹅 细小 病毒 分别 为 Ｓ ｈ株 （ Ｃ 四川
病 毒科 浓核 病毒 属［ ， 基 因组 ＤＮＡ 为 单 链 、 性 ４其 ］ 线 ＤＮＡ， 大小 约为 ５ ０ｋ ； ． ｂ 含有 正链 Ｄ ＮＡ 和含 有负链 ＤＮＡ 的病毒 粒 子 数 目基 本 相 等 ， 占 ５ 。ＧＰ 各 Ｏ Ｖ
将病 毒适 当稀 释后 ， 经尿
囊腔 接种 ９日龄 的非 免 疫 鸭胚 ， 收集 接 种 后 ７ ～ ２ｈ
ＧＰ 的主要 结 构 蛋 白 ， 病 毒 核 衣 壳 的 主 要 成 分 ， Ｖ 是 约 占 总 蛋 白 含 量 的 ８ ， 暴 露 于 病 毒 粒 子 表 Ｏ 且
面 ， ］ 是病 毒刺激 机 体 产 生保 护 性 抗 体 的重 要 抗 原
２ ０ｈ死 亡 的 鸭 胚 尿 囊 液 ， Ｐ Ｒ 检 测 阳 性 者 置 ４ 经 Ｃ
一
２ Ｏ℃冻存 备用 。
１ ２ ２ 引物 设计 与合 成 根 据 已发表 的 Ｇ Ｖ Ｂ株 ．． Ｐ
蛋 白 。在 自然 感 染 条 件 下 ，Ｇ Ｖ 诱 导 产 生 抗 ＶＰ Ｐ ３
的 中和抗体 ， ＶＰ 故 ３基 因是 研 制基 因工 程 疫苗 的首
关键 词 ： 细 小病 毒 ； １ 基 因 ； 隆 ； 列分析 鹅 ＶＰ ３ 克 序
中 图分 类 号 ：８ ２６ ９ ２ ￥ ５ ． ５ ． 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：Ｏ ７５ ３ （Ｏ Ｏ Ｏ—０ ５Ｏ １Ｏ —Ｏ ８ ２ １ ）８０５ 一５
鹅 细小 病毒 （ ｏ ｓ ａｖ ｖｒ ｓＧＰ 是 感染 禽 Ｇ ｏｅｐ ｒｏ ｉ ， Ｖ） ｕ
基 因组 中含 有 ２个 主要 开放 阅读 框 架 （ Ｆ ［６， ＯＲ ）５３左 －
株 ） Ｆ株 （ 山株 ） ＤＢ 、 佛 、 ３株 （ 东北株 ） Ｈ 株 （ 北株 ） 、 东
和 Ｑ 株 （ 北 株 ） 华 南农 业 大 学 兽 医 学 院传 染 病 东 由 实 验室 分离 保存 。 １ １ ２ 质 粒 和 菌株 ．． ｐ ＭＤ－８ １ Ｔ载 体购 自宝生 物 工 程 （ 连） 限公 司 ，大肠 埃 希菌 ＤＨ５ 大 有 ａ为华南 农 业 大 学兽 医学 院传 染 病实验 室保存 。 １ １ ３ 主要 试 剂 ．． Ｅ ａ Ｄ ｘＴ ｑ ＮＡ 聚合酶 购 自宝生 物 工程 （ 连 ） 限公 司 ； 大 有 ＤＮＡ 抽 提 试 剂 盒 、 回 收 （ 胶
动 物 医 学 进 展 。０ ０ ３ （ ） ５ —９ ２ １ ， １８ ：５５
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
鹅 细 小 病 毒不 同毒 株 ＶＰ 因 的克 隆 与 序 列分 析 １ ３基
韦艳 梅 ＃， 宗喜 ＃ 廖 明 ， 曹 ， 张桂 红 ， 煦 灿 ， 郑 单 芬 ， 开健 罗
小量 ） 剂盒 、 粒 （小 量 ）抽 提试 剂 盒 购 自上 海生 试 质 工生 物工 程 技术服 务 有限公 司。
１ ２ 方 法 ．
侧 ＯＲＦ（ ＯＲ 编 码 非 结 构 蛋 白 （ ） 右 侧 ＯＲＦ Ｌ Ｆ） ＮＳ ，
（ ＲＯＲ ） 码 ３ 种 结 构 蛋 白 （ Ｆ 编 ＶＰ） １ ＶＰ 和 ＶＰ 、 ２
ＶＰ ， 中编码 ＶＰ 、 ３的启 动 密 码子 ＡＴ 分别 ３其 １ ＶＰ Ｇ 位 于 ２４ ９ｂ ３ ｐ和 ３０ ３ ｐ处 ， 码 ＶＰ ３ ｂ 编 ２的启 动 密码 子 为不典 型 的 ＡＣ 位 于 ２ ７ ｐ处 。编码 ３种结 Ｇ， ８ ４ｂ 构 蛋 白的终 止 密 码 子 位 点 相 同 ， 于 ４ ６ ５ ｂ 位 ３ ｐ处 。
（ 南 农 业 大 学 兽 医学 院 ， 东 广 州 ５０ ４ ） 华 广 １ ６ ２
摘 要 ： 分别将 鹩 细 小病 毒 （ Ｐ 的 ５个 分 离株 通 过 Ｐ Ｒ技 术 ， 病毒 基 因组 Ｄ Ｇ Ｖ） Ｃ 从 ＮＡ 中扩 增 出病 毒 蛋
白 ＶＰ 和 ＶＰ １ ３非 重 叠 区的基 因片段 （ １ 基 因） 并 与 ｐ ＶＰ ３ ， ＭＤ１ － ８Ｔ质 粒载 体连 接 ， 转化到 感 受态 大肠 埃希 茵
全基 因组 核 苷 酸 游 Ｐ ：５一 Ｃ ＧＡＴＧ Ｔ Ｔ 上 １ Ｃ ＧＧ ＴＣ ＡＣ ＴＴＴ Ａ— ＴＴ
选 基 因 。为 区分 鉴 别 自然 感染 和 接 种 ＶＰ ３基 因 工
ＧＡ ３； 游 Ｐ ：５一 ＧＴ 一 下 ２ Ｃ ＴＡＴ ＡＧＡＴＧ ＴＧ Ｃ ＴＣ Ｃ Ｃ 一
程疫 苗而 产 生 的抗 体 ， 试 验 针 对 不 同 毒 株 ， 行 本 进
Ｔ ｐ Ｏ中， Ｐ Ｒ 鉴 定后 ， ｏｌ 经 Ｃ 对插 入 片段 进 行 序 列 测 定 及 分 析 。结 果 表 明 ， ５株 ＧＰ ＶＰ ３基 因全 长 均 为 Ｖ １ ５ ４ｂ ， ９ ｐ 编码 １ ８个 氨基 酸 。不 同毒株 主要 结构 蛋 白 ＶＰ ３基 因与 国外 已发 表 的鹅 细 小病 毒 Ｂ株核 苷 酸序 ９ １ 列相 似性较 高（ ３ ４ ～ ９ ． ％ ） 但毒 株 间也存在 一 定差 异 。 ９ ． ８７ ，
１ ２ １ 病毒 增 殖及鉴 定 ．．
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材料 ．
类 的主要 自主 性 细小 病 毒 ， 由它 引起 的鹅 细 小 病 毒
病 又名 小 鹅 瘟 ， 重 危 害 养 鹅 业 ［ ］ 严 １ 。ＧＰ 属 细 小 Ｖ
１１ １ 病 毒 ． ．
５株鹅 细小 病毒 分别 为 Ｓ ｈ株 （ Ｃ 四川
病 毒科 浓核 病毒 属［ ， 基 因组 ＤＮＡ 为 单 链 、 性 ４其 ］ 线 ＤＮＡ， 大小 约为 ５ ０ｋ ； ． ｂ 含有 正链 Ｄ ＮＡ 和含 有负链 ＤＮＡ 的病毒 粒 子 数 目基 本 相 等 ， 占 ５ 。ＧＰ 各 Ｏ Ｖ
将病 毒适 当稀 释后 ， 经尿
囊腔 接种 ９日龄 的非 免 疫 鸭胚 ， 收集 接 种 后 ７ ～ ２ｈ
ＧＰ 的主要 结 构 蛋 白 ， 病 毒 核 衣 壳 的 主 要 成 分 ， Ｖ 是 约 占 总 蛋 白 含 量 的 ８ ， 暴 露 于 病 毒 粒 子 表 Ｏ 且
面 ， ］ 是病 毒刺激 机 体 产 生保 护 性 抗 体 的重 要 抗 原
２ ０ｈ死 亡 的 鸭 胚 尿 囊 液 ， Ｐ Ｒ 检 测 阳 性 者 置 ４ 经 Ｃ
一
２ Ｏ℃冻存 备用 。
１ ２ ２ 引物 设计 与合 成 根 据 已发表 的 Ｇ Ｖ Ｂ株 ．． Ｐ
蛋 白 。在 自然 感 染 条 件 下 ，Ｇ Ｖ 诱 导 产 生 抗 ＶＰ Ｐ ３
的 中和抗体 ， ＶＰ 故 ３基 因是 研 制基 因工 程 疫苗 的首
关键 词 ： 细 小病 毒 ； １ 基 因 ； 隆 ； 列分析 鹅 ＶＰ ３ 克 序
中 图分 类 号 ：８ ２６ ９ ２ ￥ ５ ． ５ ． 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：Ｏ ７５ ３ （Ｏ Ｏ Ｏ—０ ５Ｏ １Ｏ —Ｏ ８ ２ １ ）８０５ 一５
鹅 细小 病毒 （ ｏ ｓ ａｖ ｖｒ ｓＧＰ 是 感染 禽 Ｇ ｏｅｐ ｒｏ ｉ ， Ｖ） ｕ
基 因组 中含 有 ２个 主要 开放 阅读 框 架 （ Ｆ ［６， ＯＲ ）５３左 －
株 ） Ｆ株 （ 山株 ） ＤＢ 、 佛 、 ３株 （ 东北株 ） Ｈ 株 （ 北株 ） 、 东
和 Ｑ 株 （ 北 株 ） 华 南农 业 大 学 兽 医 学 院传 染 病 东 由 实 验室 分离 保存 。 １ １ ２ 质 粒 和 菌株 ．． ｐ ＭＤ－８ １ Ｔ载 体购 自宝生 物 工 程 （ 连） 限公 司 ，大肠 埃 希菌 ＤＨ５ 大 有 ａ为华南 农 业 大 学兽 医学 院传 染 病实验 室保存 。 １ １ ３ 主要 试 剂 ．． Ｅ ａ Ｄ ｘＴ ｑ ＮＡ 聚合酶 购 自宝生 物 工程 （ 连 ） 限公 司 ； 大 有 ＤＮＡ 抽 提 试 剂 盒 、 回 收 （ 胶
动 物 医 学 进 展 。０ ０ ３ （ ） ５ —９ ２ １ ， １８ ：５５
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
鹅 细 小 病 毒不 同毒 株 ＶＰ 因 的克 隆 与 序 列分 析 １ ３基
韦艳 梅 ＃， 宗喜 ＃ 廖 明 ， 曹 ， 张桂 红 ， 煦 灿 ， 郑 单 芬 ， 开健 罗
小量 ） 剂盒 、 粒 （小 量 ）抽 提试 剂 盒 购 自上 海生 试 质 工生 物工 程 技术服 务 有限公 司。
１ ２ 方 法 ．
侧 ＯＲＦ（ ＯＲ 编 码 非 结 构 蛋 白 （ ） 右 侧 ＯＲＦ Ｌ Ｆ） ＮＳ ，
（ ＲＯＲ ） 码 ３ 种 结 构 蛋 白 （ Ｆ 编 ＶＰ） １ ＶＰ 和 ＶＰ 、 ２
ＶＰ ， 中编码 ＶＰ 、 ３的启 动 密 码子 ＡＴ 分别 ３其 １ ＶＰ Ｇ 位 于 ２４ ９ｂ ３ ｐ和 ３０ ３ ｐ处 ， 码 ＶＰ ３ ｂ 编 ２的启 动 密码 子 为不典 型 的 ＡＣ 位 于 ２ ７ ｐ处 。编码 ３种结 Ｇ， ８ ４ｂ 构 蛋 白的终 止 密 码 子 位 点 相 同 ， 于 ４ ６ ５ ｂ 位 ３ ｐ处 。
（ 南 农 业 大 学 兽 医学 院 ， 东 广 州 ５０ ４ ） 华 广 １ ６ ２
摘 要 ： 分别将 鹩 细 小病 毒 （ Ｐ 的 ５个 分 离株 通 过 Ｐ Ｒ技 术 ， 病毒 基 因组 Ｄ Ｇ Ｖ） Ｃ 从 ＮＡ 中扩 增 出病 毒 蛋
白 ＶＰ 和 ＶＰ １ ３非 重 叠 区的基 因片段 （ １ 基 因） 并 与 ｐ ＶＰ ３ ， ＭＤ１ － ８Ｔ质 粒载 体连 接 ， 转化到 感 受态 大肠 埃希 茵
全基 因组 核 苷 酸 游 Ｐ ：５一 Ｃ ＧＡＴＧ Ｔ Ｔ 上 １ Ｃ ＧＧ ＴＣ ＡＣ ＴＴＴ Ａ— ＴＴ
选 基 因 。为 区分 鉴 别 自然 感染 和 接 种 ＶＰ ３基 因 工
ＧＡ ３； 游 Ｐ ：５一 ＧＴ 一 下 ２ Ｃ ＴＡＴ ＡＧＡＴＧ ＴＧ Ｃ ＴＣ Ｃ Ｃ 一
程疫 苗而 产 生 的抗 体 ， 试 验 针 对 不 同 毒 株 ， 行 本 进
Ｔ ｐ Ｏ中， Ｐ Ｒ 鉴 定后 ， ｏｌ 经 Ｃ 对插 入 片段 进 行 序 列 测 定 及 分 析 。结 果 表 明 ， ５株 ＧＰ ＶＰ ３基 因全 长 均 为 Ｖ １ ５ ４ｂ ， ９ ｐ 编码 １ ８个 氨基 酸 。不 同毒株 主要 结构 蛋 白 ＶＰ ３基 因与 国外 已发 表 的鹅 细 小病 毒 Ｂ株核 苷 酸序 ９ １ 列相 似性较 高（ ３ ４ ～ ９ ． ％ ） 但毒 株 间也存在 一 定差 异 。 ９ ． ８７ ，