植物组织培养常见问题及对策

植物组织培养常见问题及对策

摘要：本文从植物组织培养中常见的问题污染、玻璃化、褐化、生根难、炼苗难等问题进行阐述，并提出相应的解决办法，为以后的组培奠定基础。

关键词：组织培养；问题；对策

Plant tissue culture common problems and countermeasures Abstract: this article from the plant tissue culture of common problem pollution vitrification Browning tried hard to take root seedlings paper describes problems, and puts forward the corresponding solutions for the future of tissue, lay the foundation Keywords: tissue culture; Problem; countermeasures

引言

植物组织培养技术，作为现代生物技术的一个重要手段，已在工厂化育苗、种苗脱毒复壮、遗传育种、种质资源的保存与交换等领域得到了广泛应用。在近几年开展植物组培快繁技术研究和生产过程中，发现有几个问题较常见，有时会严重影响工作效率和进展，降低组培快繁的经济效益。现将这些问题及解决对策总结如下。

1污染

组织培养是在无菌条件下进行的，在培养过程中若有微生物污染，组培将无法进行。对于工厂化育苗来说，污染往往是影响生产任务按时完成的主要原因。1．1产生污染的因素

1．1．1外植体

通常多年生的木本材料比1—2年生的草本材料带菌多；老的材料比嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多；带泥土的材料比清洁的带菌多。18中以雨季的材料带菌多，1 d中以中午阳光最强时的材料带菌少。

1．1．2培养基

高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况，以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。

1．1．3操作环节

接种室是否清洁、干燥、密封，是否经常用紫外线灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否熟练。

1．1．4培养环境

培养室要求清洁、密闭，每天用70％酒精喷雾除菌、降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌，如有空气过滤装置效果更好。培养室相对湿度太高时，污染加重。1．2防止和克服污染的措施

1．2．1接菌室的灭菌

在每次接种前半个小时，用20％的新洁尔擦洗室内设备、工作台面，再用紫外线灯照射20 min。使用前还可以喷洒70％的乙醇，使空气中灰尘迅速下降。在进行组培时。除了培养基、接种材料、器皿和用具保证无菌外，同时在接种时还需要严格进行无菌操作[8]。

1．2．2植物材料的选择及防止污染

由于不同的植物材料品种，不同的取材部位、取材大小、取材年龄以及取材肘期，其带菌量不同，为此在取材时应仔细选择，以减少污染的发生[4]。一般在春季采集生长健壮的材料为佳，在连续晴天的中午取材，选取洁净、生长旺盛的部位，现取现灭菌。以木本植物为培养材料时，要采取一些预防措施，尽量避免材料带菌。如外植体生长环境较脏，可在室内或无菌条件下对枝条进行液体培养催芽，即用刷子沾少量的洗衣粉或肥皂稀溶液把枝条刷洗干净，进行水培或者液体培养，选择新抽生的嫩枝或者嫩芽作为外植体，可降低污染率。或者在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，可有效减少污染。

2 玻璃化

2．1玻璃化苗的特征和危害

在进行组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢水渍状或呈水晶状透明或半透明；整个植株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。这种现象称为“玻璃化”，这种苗称为玻璃化苗[8]。玻璃化苗中因体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低，角质层、栅栏

组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低、组织畸形、器官功能不全、分化能力降低、生根困难、移栽后很难成活。玻璃化苗在植物组培中很普遍，有时多达50％以上，严重影响繁殖率，造成人、财、物的极大浪费。

2．2玻璃化苗的成因

琼脂和蔗糖浓度与玻璃化苗的比例呈负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃化苗的比率越低。培养基的水势影响玻璃苗的形成，液体培养是导致玻璃化的主要原因，只要降低培养容器的相对湿度，就可以降低玻璃化苗的比例，试管苗玻璃化可能是培养材料对培养基内水分状态不适应的一种生理变态。培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化呈正相关，乙烯对玻璃化的影响，与改变组织的生理生化及纤维结构有关。玻璃化苗也是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的，密闭的封口材料是导致玻璃化的原因之一。

2．3防止和克服玻璃化苗的措施

2．3．1增加培养基硬度

在固体培养时，适当增加琼脂的浓度，并提高琼脂的纯度，都可增加培养基的硬度，从而造成细胞吸水阻遏，降低玻璃化。

2．3．2适当提高蔗糖浓度

提高培养基的糖浓度，可提高渗透压，降低培养基的渗透势，减少培养材料水分的获得。

2．3．3改善培养瓶的通气条件

用有透气口的封口膜封瓶口或者用有透气垫的瓶盖封瓶口。

2．3．3培养温度及光照条件的调节

适当降低培养瓶内温度和增加自然光照，能促进木质化，抑制玻璃化。2．3．4调节培养物质

增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe元素的含量，降低N和Cl元素的比例，特别是降低氨态氮的浓度，提高硝态氮的含量。

2．3．5降低BA或者其他细胞分裂素的浓度

降低BA或者其他细胞分裂素的浓度是克服和减少玻璃化苗的重要措施。2．3．6添加物

在培养基中添加活性碳、马铃薯汁、间苯三酚等可有效地减轻和防止玻璃化，

定期检查操作台，定期对培养室消毒。

3 褐化

3.1发生形式

细胞受胁迫条件或其他不利条件影响而死亡或细胞发生自然死亡；材料伤口分泌的酚类物质，在多酚氧化酶作用下氧化为醌类物质形成的。

3.2影响因素

外植体、培养基、pH值、培养条件、其他。

3.3解决途径

3.3.1选取适宜的外植体。

一般木本植物的酚类化合物较草本高，组培时木本植物更易褐化；外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也越易褐化，成龄材料一般比幼龄材料褐化严重；切口越大，酚类物质的被氧化面积也越大，褐化程度就会越严重；由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生长季节不同，一般在生长季节含较多的酚类化合物，在取材部位上存在幼嫩茎尖较其他部位褐化程度严重。

3.3.2选取适宜的培养基

(1)利用抗氧化剂、吸附剂。抗氧化剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用，减少褐变。目前常用的抗氧化剂有硫代硫酸钠、植酸(PA)、抗坏血酸(Vc)、过氧化氢、半胱氨酸等，吸收剂有活性炭(AC)和PVP(聚已烯吡喀烷酮)。抗氧化剂要注意分次使用，应注意有些抗氧化剂会对培养物产生毒害作用，要避免长期在含这些抗氧化剂的培养基中培养，如果先期褐变得到了控制，就应该从培养基中除去抗氧化剂。杨薇红等在亚洲百合接种前用50mg/LVc浸泡外植体2h及在之后的继代培养中加入150mg/LPVP以抑制组培苗褐变现象的发生[11]。张红对库拉索芦荟组培中的褐变现象，培养基中加入活性炭500.0mg/L，环境温度控制在25℃有利于减轻褐变[12]。

(2)琼脂量的减少、较低的pH值利于减少褐变。

(3)培养基中适宜的细胞分裂素浓度可以减轻或抑制褐变。这在很多植物的