第二章-基因工程制药_PPT幻灯片

传统生物药物由于来源及制备上的困难、价 格等因素的影响，此外在制备过程可能受到 的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、 疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工 程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的 优势。
应用基因工程技术可十分方便且有效地解决 上述提到的问题，从量、质上都可以得到改 进，且可以创造的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体 内能表达产生所要蛋白产物。
生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于 细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA 分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所 需目的基因的DNA片段。到目前为止，人们用这种方法已分离出 40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的 基因的方法是人工合成，即基因模版合成。
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因
组建重组质粒
构建基因工程 菌或细胞
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
培养工程菌
成品检定 包装
基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成；
下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的 大规模培养一直到产品的分离纯化、质量 控制等。
2、cDNA第一链的合成
一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为 引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP；在 凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小， 探索最佳反应条件。
3、cDNA第二链的合成
先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交 链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二 链。由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形 结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。此 反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性 切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结 构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖 凝胶电泳进行测定。
逆转录酶 逆转录酶
DNA多聚酶I Klenow片段
逆转录酶
ds-cDNA
S1酶
ds-cDNA
1、mRNA的纯化
在真核细胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚腺苷 酸polyA组成的末端，长达20~250个腺苷酸，可采用 寡聚脱氧胸苷Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将 mRNA从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓 度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶 液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较 纯的mRNA。
第一节 概述
基因工程即重组DNA技术，是指对不同生物的遗传基因，根 据人们的意愿，进行基因的切割、拼接和重新组合，再转入 生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗 传特征的生物类型。世界上第一批重组DNA分子诞生于1972 年，次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠 杆菌中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。基因工程 彻底改变了传统生物科技的被动状态，使得人们可以克服物 种间的遗传障碍，定向培养或创造出自然界所没有的新的生 命形态，以满足人类社会的需要。
基因模板合成法：就是先以信使RNA为模板，反向转录出一条 DNA单链，再以互补的方式加倍成DNA双链。用这种方法人们 已先后合成了家兔、鸭和人的珠蛋白基因、羽毛角蛋白基因等。
目前克隆真核基因常用的方法有 逆转录法和化学合成法
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白 质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA， 以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA 的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆 转录酶或DNA聚合酶I作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA 序列。
第三讲 基因工程制药
第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。
一、逆转录法
➢ 1、mRNA的纯化 ➢ 2、cDNA第一链的合成 ➢ 3、cDNA第二链的合成 ➢ 4、cDNA克隆 ➢ 5鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA ss-DNA
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后 转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质 的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技 术。
基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆，构建 DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程 菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。 以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和 步骤将会随研究和生产条件的不同而改变。
下游阶段主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立， 新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发， 分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传 感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优 化控制等。
工程菌的发酵工艺需要对影响目的基因表达的因素进行 分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高 效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、 质量控制、产品保存等技术。
工程菌（或细胞）构建中重要的工具
该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和 连接酶。
目的基因进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。 基因表达系统
有原核生物和真核生物两类表达系统；选 择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白 质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分 离纯化的难易。
下游阶段在产业化中是极其重要