微生物发酵生产醇类产品_罗明典

《生物工程进展》2001,V ol.21,N o.4
微生物发酵生产醇类产品
罗明典
摘要　本文讨论了微生物发酵产品如乙醇、甲醇、甘油、木糖醇和肌醇等的利用和开发前景,并强调了现代生物技术与常规生物技术相结合为选育高效菌株的重要性。

关键词　发酵产品　乙醇　甲醇　甘油　木糖醇　肌醇
微生物发酵在自然界具有普遍性,凡是有微生物存在的地方,特别是潮湿厌氧环境条件下细胞微生物的生命活动就显示其发酵功能和活力。

也就是说,人们通常所讲的发酵是指在厌氧条件下的糖酵解作用。

利用这条发酵途径在人工控制下有可能获得各种不同的中间代谢产物,如醇类产品是其中之一。

因此,微生物发酵工程实质上是在人工控制条件下对微生物代谢(通常为厌氧代谢)最有效的利用,或者说,是对微生物代谢产物的利用和开发。

微生物发酵有其传统的历史,在人类日常生活中与之密切相关,如酱油、醋、腐乳以及发酵食品和某些饮料等等。

而现代生物技术与发酵工业的有机结合,将对微生物发酵工业的发展起着巨大的推动作用。

现着重介绍微生物发酵生产醇类产品的研究进展。

1　发酵生产乙醇和甲醇
微生物发酵生产的乙醇、甲醇已在工业、能源、农业、医药等方面得到广泛应用,把它作为新一代绿色能源的开发已成为全世界所关注的课题,特别是利用工农业废弃有机物发酵生产乙醇也是当今环保产业———新能源开发的重要研究课题。

微生物如藻类生产燃料用乙醇已占全世界液体燃料产量的10%。

我国乙醇发酵生产有悠久历史,有发展之势。

1995年乙醇总产量330万吨,到2000年将突破450万吨。

近年广西柳州一家公司以木薯代粮生产酒精,为节约用粮做出重要贡献。

河南一家高新技术开发区正在建设年产3万吨的特级乙醇生产基地。

为提高酒精产率生物技术得到运用,在广西,采用固定化酵母生产酒精,以木薯淀粉为原料的出酒率为52%-55%(提高2%),采用固定化酵母生产乙醇工艺,1年仍保持生产菌的活性。

也有报道,采用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobile)固定化技术生产酒精优于酵母;如果将酵母与纤维二糖酶共固定化,
则可提高纤维二糖基质转化为乙醇的效率[1];混合培养方法提高酒精产量也有所应用,如利用葡萄糖的菌株与利用木糖(主要指半纤维素类)的菌株混合发酵生产乙醇的产量提高30%-38%,而单一菌株的产量只有10%,最高也只有30%[1]。

更重要的是,基因工程技术应用于乙醇生产亦取得突破,据我国台湾方面报道,将运动发酵单胞菌发酵生产酒精的关键酶基因(即pde和adhB)同时转入大肠杆菌中可达到同时进行糖化和乙醇发酵的目的。

新建构的“工程大肠杆菌”于30℃下以10%葡萄糖为底物发酵145小时,可产乙醇611%(WΠV),糖转化率达96%,此种新工艺应用于乙醇发酵生产很有潜力[2]。

也有用马克斯克鲁维酵母(K luyveromyces marxianus)在好氧条件下直接将纯D2木糖转化为乙醇的报道,每升20克木糖获乙醇最大浓度4158克Π升,产量为0125克Π克;除此以外,能以木糖发酵生产乙醇的微生物还有热带假丝酵母(Candida tropicalis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pobe)、酿酒酵母、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)[3]。

而用基因工程技术建构的“工程酿酒酵母”,以木糖为唯一碳源发酵生产乙醇(摇瓶试验),所获产量为113克Π升[4]。

至于甲醇作为一种液体燃料,有人预测,至2030年有可能取代汽车燃料,将有60%以上的汽车使用甲醇燃料以驱动,德国在这方面正处于试验之中,未来的生物技术将有可能为无污染甲醇燃料的发展做出重要贡献。

2　发酵生产丙三醇(俗称甘油)
甘油是重要的基本的多功能化工原料,在医药、涂料、纺织、印染、炸药、造纸、制革、印刷、照相、金属加工、电工材料、橡胶、化妆品、油墨、食品加工和日常生活中都有广泛的应用[5],有1700多种产品中含有甘油成分;发酵生产的甘油属天然的,无毒、无害、
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无副作用。

目前国际市场甘油年需求量达100多万吨,实际上年总产量只有它的1Π2左右,尚缺一半左右。

我国的甘油短缺,一直靠进口,目前甘油年生产能力约816万-9万吨,其中皂化法生产能力6万吨,化学合成法115万-118万吨,好氧发酵法生产能力超过1万吨,而甘油产量一直在年产2万至3万吨左右,而去年需求量估计7万至8万吨,至本世纪末需求量将达到12万吨,而实际上最多只能达到615万吨[5]。

除了油脂皂化法、油脂水解法、化学合成法生产甘油之外、发酵法生产甘油尽管有其优越性,并显示其巨大潜力,但由于生产成本高,加之低价代用品渗入和产品进入国内顷销,使国内产品售价下跌(1998年未过5000吨),致使发酵法生产甘油的进展一直缓慢。

而研究工作一直在进行着,也取得一定进展[6]。

江苏无锡轻工业大学以淀粉质原料为底物,优良耐高渗压产甘油假丝酵母(Candida glycerolgensis Zhuge.sp.nov)W L22002-5为生产菌,在含糖25%左右的条件下进行发酵生产,所获的发酵液中甘油含量达12%以上,总糖转化率为45%-53%,每天的产量为30克Π升,甘油提取率达80%以上,达到国际先进水平。

这是发酵甘油工业化生产的优良菌株之一,有其特点:(1)甘油产率高,实验室规模110-130克Π升,工业化生产达到100-110克Π升;(2)耐高渗性能在含550克Π升葡萄糖或120克Π升钠盐培养基上生长,很少杂菌污染;(3)菌体生长快、发酵速度快;(4)转化率、耗糖转化率为世界最好水平[7]。

目前在该校已建成年产1000吨甘油的发酵中试基地,已有投产4500吨Π年级的发酵制造甘油的设备[8-9]。

为适应甘油发酵生产的需要,在中国科技开发院化工开发研究所等单位也建成1000吨级发酵生产甘油的装置,连续运转1年多取得显著效果。

另外,有的单位选育另一株耐高渗压假丝酵母1Π78-1用于发酵生产甘油的报道[10]。

另一些单位有选择废酒精、玉米、甘薯干、糖蜜等为原料用来发酵生产精甘油的报道,不过其年产量不超过150-200吨左右;引人注意的是,在河南正在建设年产2000吨级甘油的生产基地。

由此可见,发酵生产甘油,应该说,在我国将会有较好发展:第一,甘油需求量大,供求矛盾较突出,要满足国内的最适需求,只有先产适用于医药级和食品级发酵甘油或许是提高生产经济效益的最佳选择。

有专家认为:这是我国发酵甘油工业生产的唯一出路[11];第二,同时也应看到,我国发酵生产甘油有几十年的历史,不断总结经验,扬我优势,吸收先进,克服不足;还应看到,我国发酵生产甘油技术处于世界前列,此项生产技术转让国外,显示出我国有一定的自我优势,坚定信心,继续前进;第三,在现有基础上巩固成果,挖掘潜力,下大力气用高科新技术改进发酵“种子”,完善发酵工艺,进一步提高生产水平,降低生产成本,确保产品质量,走一条有中国特色发酵生产甘油的新路大有希望。

3　发酵生产木糖醇
木糖醇是一种天然甜味剂,甜度高,作为一种人工增甜剂用于口香糖生产,其产品食用(嚼)可预防由肺炎球菌引发的中耳炎,以及其它用途等。

工业生产木糖醇是采用木糖化学催化加氢的方法,其设备工艺复杂,成本较高;而采用微生物发酵法生产木糖醇已展现出良好开发前景。

(1)可充分利用农业废弃物如作物秸秆等为原料进行发酵生产;(2)选育高效生产菌种(或菌株)用于生产,完全有可能实行规模生产,这两方面研究均取得进展。

稻草在广大农村较为普遍的秸杆废弃物,经酸水解成半纤维素水解产物,含65115%的木糖、24157%的葡萄糖和1017%阿拉伯糖的混含物,将它们作底物通过季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)发酵所获水解产物如木糖为45克Π升,发酵48小时糖利用率达96%,培养液中木糖醇浓度为27克Π升,木糖残糖为15%。

此项工艺具有商业应用价值[12]。

其实原料源不限于稻草,甘蔗渣也是生产木糖醇的底物,甘蔗渣经水解成半纤维素糖(葡萄糖和木糖)通过季也蒙假丝酵母发酵生产木糖醇,其浓度达到40克Π升[13]。

也有利用另一处假丝酵母FT120037发酵甘蔗渣水解产物生产木糖醇的报道,其产率为0187克Π时Π升(WΠV),在发酵过程中需要控制氧的供应量[14]。

我国建立以玉米芯水解液生产木糖醇的新工艺,以一种汉逊酵母X229(Hansenlula anomala X229)为生产菌,于含木糖5%、葡萄糖0146%及少量其它糖的玉米芯水解液的发酵罐中进行发酵生产,供氧量适中有利于木糖醇生产,溶氧量为15%时,木糖醇的产率为017克Π升・时,转化率62%[15],因此,木糖醇发酵生产过程氧的控制适中具有关键作用。

除稻草、甘蔗渣及玉米芯等可作为原料外,也有利用一种桉树(Eucalyptus grandis)(注:也可以从中生产甜味剂)半纤维素水解产物,在含30克Π升木糖、20克Π升谷糠组成固态培养基,接种季也蒙假丝酵母3克Π升,培养8小时后可产木糖醇13177克Π升[16]。

尽管产量低一些,但发酵工艺简便,其研究
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成果为木糖醇进一步工业化生产开辟新途径。

4　发酵生产肌醇
肌醇又称环己六醇(cyclohexanhex ol),也称生物活素Ⅰ,是一种具有光合及生物活性的环状糖醇(C
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H32O6),人类生活所必需。

肌醇前体物即肌醇六磷酸对结肠癌、肝癌、乳腺癌等均有疗效,用患癌鼠的试验得到证实,其作用机制在于它激活P53基因对癌症产生抑制。

这种物质在大豆、稻米、麦麸中均有它的存在。

也有以肌醇为主体原料研制成肌醇硒酸酯,可用于制备富硒的抗癌药物以及研制含肌醇的食品、饮料等均有市场潜力[17]。

为获取肌醇可充分利用通常做植物性饲料谷糠为原料,含有50-70%的植酸磷(肌醇六磷酸,IP6),同时借助某些微生物所产生的植酸酶(phytase)将其分解成肌醇和磷酸。

一般天然植酸酶产生菌菌株生产植酸酶的量较低,每毫升发酵液只有100-500单位(100-500UΠml),中国农业科学院饲料研究所姚斌研究员小组与生物技术研究所范云六院士小组经过几年的努力采用基因工程技术建构的“工程毕赤酵母”(Pichia pas2 toris),所含植酸酶基因表达产物稳定,大大提高酶的产率,经5升发酵罐试验,产量达到15000单位Π毫升(约每毫升发酵液收获5毫克植酸酶蛋白3),比一般植酸酶产生菌如黑曲霉(Aspergillus niger2963)的产量高3000倍以上;比国外报道的“工程菌”(P. pastoris)植酸酶产量高37倍以上[18]。

这项高技术研究成果的重要突破不仅为酶制剂工业的发展增添一个新成员,而且为肌醇工业化生产呈现其开发前景。

5　小结与展望
从农业废弃物为原料微生物发酵生产各种醇类产品并加快其产业化进程是值得提倡的研究与开发方向。

(1)丰富的各类有机废物的转化既有利于环境整治及环保产业的形成;又有利于通过微生物发酵途径可大量索取所需要的发酵产品如各醇类产品等;(2)此项微生物发酵生产醇类的工艺有独特的优势,原料易得,并显示生产菌的特点,一年四季可进行连续生产;采用细胞(或酶)固定化技术将更有巨大开发潜力;(3)发酵生产的产品如上面所提到的乙醇、甲醇是洁净再生新能源;这种能源有绿色能源之称。

甘油、木糖醇及肌醇也是工、农、医等方面用途较广的产品,微生物发酵生产显示其巨大优越性,因此,为适应市场多方面的需求,微生物发酵工程及其产业化的发展是其必然,而获取优化的微生物发酵醇类产品的关键还在于加强选育高产、高效、优质的生产菌种,并保持其在生产过程中的稳定性和适应性,此其一;其次,现代生物技术必须掺入整个发酵工艺流程,并与传统发酵工艺有机结合,上游种子的改造、选育或新的建构;中游工艺如细胞固定化技术,或其共固定化技术有效运用,以及下游涉及如何提高收率和产品纯度等等;上述这些研究成果正是完成醇类发酵产品工业化生产的基础,巩固已有的研究成果,继续探索和创新,醇类发酵产品的开发大有潜力,前景广阔。

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(下转第42页)
3参考《科技日报》(柯为),1997.10.9.1版
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Biological Synthesis of E nantiopure Epoxides
Wu Jin　Sun Wan2ru
(S tate K ey Laboratory of M icrobial Res ources Institute of M icrobiology Chinese Academy of Sciences Beijing　100080,China)
Abstract　Enantiopure epoxides are very im portant intermediates in organic synthesis.Biological synthesis methods of epoxides offer s ome special advantages com paring with conventional chemical methods.In this review,we focus on the biosynthesis approaches which include direct epoxidation,indirect epoxidation and enzymatic res olution methods.The re2 search achievement,recent progresses and prospect in this area was introduced com pletely.
K ey w ords　epoxides,enzymes,biosynthesis,epoxidation,chiral
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U sing Microbial Fermentation to Produce Alcohols
Luo Ming2dian
(Institute of M icrobiology,Academ ia S inica,Beijing　100080)
Abstract　In this paper the utilization and development perspective of the microbial fermentative products such as enthanol、methanol、glycerol、xylitol and inositol etc are discussed.The im portance of screening high2efficient strains by combinating current biotechnology with conventional biotechnique is em phasized.
K ey w ords　fermentative products,enthanol,methanol,glycerol,xylitol,inositol
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Advances in Studies on Bacillus thuringiensis I nsecticide
Crystal Protein by Mutagenesis
T ang Mu2jin　Y u Jian2xiu　Li Jian2hua　Pang Y i
(S tate K ey Laboratory for Biocontrol and Institute of Entom ology,Zhongshan University,G uangzhou　510275,China)
Abstract　The current research on the mechanism of the action of Bacillus thuringiensis(Bt)insecticidal crystal proteins by mutagenesis is reviewed.D omainⅠis inv olved in insertion into the membrane and affects ion channel func2 tion.D omainⅡis inv olved in receptor binding,including the reversible binding and irreversible binding.D omainⅢcan maintain the structure stability,and is maybe inv olved in ion channel function,receptor binding and insertion into the membrane.It is the captivating way of Bt im provement to alter the primary structure of Bt insecticidal crystal proteins by mutagenesis.
K ey w ords　Bacillus thuringiensis,Iinsecticidal crystal proteins,D omain,Mutagenesis
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