抗体工程研究及进展

* 增加亲和性、提高特异性。 * 抗体人源化（降低免疫原性）。 * 人源性抗体。 * 抗体稳定性、表达水平。 * 抗体融合蛋白（同位素、细胞介素、毒素、药物等）。 * 催化抗体。 * 抗体芯片。
工程抗体的应用
* 构建各种大小不同的抗体片段:scFv， (scFv’)2 ，Fab,
F(ab’) 2， miniantibody.

制备基因工程抗体的重要性
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基因工程抗体制备方便，既可以从杂交瘤细 胞中获得，也可以从未经免疫的脾或外周血 林巴细胞中获得 可在细菌或细胞中大量生产 可按人们意愿及需要构建全抗体或抗体片段 （如Fab，Fv），也很容易制备赋予抗体新 功能的抗体杂合蛋白 对研究抗体结构功能有较大的理论研究意义 在诊断和治疗等应用上有广泛的应用价值
嵌合单抗 GPIIb/IIIa 受体
嵌合单抗 人源化单抗 CD20 RSV
431
819 516
淋巴瘤/类风湿 RSV感染
Hercepin 人源化单抗
Remicade 嵌合单抗
HER2
TNF-α CD52
乳腺癌
炎症性肠病/类风湿 CLL
347
721 27
Campath 人源化单抗
三. 存在问题与解决策略
Mylotarg Campath® Zevalin
rabbit polyclonal 预防肾移植排斥1998 antibody (Antilymphocytes)
Humanized Mab (Anti-CD33) Humanized Mab (Anti-CD52) Murine IgG1 kappa (Radioactive formulation) 急性淋巴细胞性白血病 2000 B-CLL慢性淋巴瘤（B 细胞性）2001 淋巴瘤2002
Biogen
2003.1.30 2003.1.9
血浆α-1抗胰 Alpha 遗传性肺气肿 Therapeutic/B 蛋白酶 Antitrypsin,al axter pha-1 Corixa/Glaxo 结肠癌 Bexxar(抗 CD20) Smith Kline
2003
Avastine（抗 Genentech VEGF）
工程抗体面临的问题

鼠抗体的免疫原性 亲和力低和特异性差 大量制备
问题1：免疫原性

HAMA 半衰期短: < 20h(FcRn)
问题1的解决方案
人源化抗体（嵌合抗体，改型抗体） 人抗体

抗体人源化
一、嵌合抗体：鼠可变区+人恒定区 二、鼠CDRs+人框架区
三、鼠CDRs+人框架区（保留关键鼠残基）
Chimeric MAb (Anti-CD20) Humanized IgG1 (Anti-IL-2R)
治疗病种及批准年 淋巴瘤1997 肾移植排斥1997
生产公司 Genentech Roche
Herceptin ® Trastuzumab
Remicade infliximab Simulect ®
背景材料
二,人源性抗体库法

天然抗体库 半合成抗体库
V

V
CDR3

全合成抗体库
HAb18导向药物
抗FabC1027 抗已型脑炎单抗
肝癌
肝癌 已型脑炎
临床二期
临床前 临床前
四医大
医科院医生所 中科院遗传所
抗破伤风单抗
预防破伤风
临床前
军科院
FDA批准的部分抗体类药物2001年销售额
商业名
ReoPro
Rituxan Synagis
类型
靶抗原
适应症
PCI辅助治疗
2001全球销售额 (百万美元)
人源性抗体的制备
制备人单克隆抗体的难点

受伦理道德的限制不能免疫人。 人外周血淋巴细胞中10%为未刺激的B淋巴细胞， 含有大量的记忆细胞，难以和骨髓瘤细胞融合。


人、鼠杂交瘤不稳定，有易失去人染色体的影响
难以找到合适的骨髓瘤细胞。 制备的人单抗亲和力往往较低。 对于人自身抗原和免疫原性较低的抗原，制备人 单抗相当困难。
非何杰森淋巴瘤
2004 2 26
我国治疗性抗体研究进展（2002）
名称
OKT3
抗IL-8抗体 抗CEA嵌合抗体 CD3嵌合抗体 抗人VEGF（人源化）
治疗病种
肾移植
银屑病 胃癌 器官移植 肿瘤
研究阶段
上市
上市 申报新药 2001科技奖 2001科技奖
研制单位
武汉生物制品所
宏远逸士公司 医科院肿瘤所 北京制药二厂 武汉生物所 医科院肿瘤所
* 增加亲和性、提高特异性。 * 抗体人源化（降低免疫原性）。 * 人源性抗体。 * 抗体稳定性、表达水平。 * 抗体融合蛋白（同位素、细胞介素、毒素、药物等）。 * 催化抗体。 * 抗体芯片。
二. 治疗性抗体开发现状
治疗用抗体研制史上的几个重要里程碑

1975: 制备第一株鼠单克隆抗体 1982: 抗独特型抗体成功应用于治疗淋巴瘤 1986: FDA 批准 OKT3(鼠抗体) 1994: FDA 批准ReoPro(嵌合抗体) 1996-1999: FDA批准14种工程抗体
1
1
2002年美国已批准上市的治疗性抗体
名称
OncoScint ®
抗体类型
Murine Mab(B72.3) (Anti-TAG-72) Murine MAb (Anti--CD3) Chimeric MAb Anti GP IIb/IIIa receptor
治疗病种及批准年
结肠癌和卵巢癌 1992 肾移植1991 心脏及肝移植1993 1994溶栓 1997
工程抗体种类
根据免疫原性分类：
鼠源性 人源化 人源性
根据分子大小分类：

全抗体 小分子抗体
根据组成成分分类：

单价小分子抗体 双（多）价、双特异性抗体 抗体融合蛋白
工程抗体的应用
* 构建各种大小不同的抗体片段:scFv， (scFv’)2 ，Fab,
F(ab’) 2， miniantibody.
2002年美国已批准上市的治疗性抗体
名称 Synagis ® palivizumab 抗体类型 Humanized IgG1k (Anti-RSV virus) 治疗病种及批准年 CMV感染 1998 生产公司 Medlmmune
Thymoglobulin ® thymocyte globulin
一、 链臵换法
鼠重链 人 轻链 repertoire
分离人轻链 人重链repertoire库 转化 筛选 阳性鼠人杂合抗体
转化 筛选
阳性人抗体
背景材料
二,人源性抗体库法

天然抗体库 半合成抗体库
V

V
CDR3

全合成抗体库
V
CDR3
构建大的未经免疫的抗体repertoire噬菌体
显示库
43位未经免疫的人 （BRL15人，
—根据晶体结构
2.重要鼠残基的确定方法
(1)只根据可变区的一级序列,不需同源模建 理由:抗体具有高度同源性，结构相当类似 a.只保留与canonical结构有关的残基 b.保留框架区起调节CDRs结构的残基
（2）序列比较和同源模建相结合
a.典型方法 b.可变区‘resurfasing’法
人源化效果
人源化抗体引起免疫反应的 频率降低到12％ 以下 半衰期延长至几天，有时接近21天（人IgG 在体内的半衰期）

9个FDA批准抗体，56个正在进行临床试验的抗体 嵌合抗体: 人源化抗体 鼠抗体: 人抗体: 其它（兔，弥猴等）: 5 3 1 0 0 2 (3.5%) 35 (62.5%) 7 (12.5%) 6 6
工程抗体的应用

至2000年，FDA已批准至少16种抗体在临床 应用，包括应用于癌症治疗，移植排斥等多 个方面， 占已认证的生物制品1/5。 超过79个抗体正在进行临床I和II期试验，占 生物技术药物的1/3。

美国临床试验的和进入市场抗 体 临床试验：97/374 进入市场：16/199
自身免疫性疾病： 肿瘤及其相关疾病： 消化系统疾病： 心脏病： 感染性疾病： 神经系统疾病： 呼吸系统疾病： 皮肤病： 器官移植： 其它： 10 47 7 1 4 5 7 6 3 3 4 10
PCR
筛选 高亲和性 构建抗体repertoire库 人抗体 1.4 1010
tonsil B细胞4人，
bone marrow 24人）
特点：1、所需时间少（二周） 2、获得对自身抗原具有高亲和力的人源性抗体
全套抗体repertoire库的应用
1. 提高抗体的亲和性和特异性 2. 制备人源性 抗体 3. 筛选抗各种抗原（包括自身抗原、肿瘤抗 原等）repertoire的抗体
SangStat
Wyeth Berlex Laboratories Montville IDECP Parmaceuticals
2003年至今FDA批准上市的抗体
抗体 单抗 Xolair, Omalizumab LFA-3 单抗 LFA-3/IgG1 生产公司 Genentech 适应症 中度至严重的因敏感 引起的哮喘，经激素 治疗无效者 银屑病、牛皮癣 批准日期 2003.6.20
进行抗体工程的有利条件
1. 2. 3.
4. 5.
B细胞活化，抗体多样性及抗体亲和性成熟等重大理 论机制的进一步阐明，为抗体工程提供了理论依据。 大量抗体基因序列已测定，可以设计一套引物，通过 PCR构建抗体基因库，分离抗体基因。 大量与抗原结合或未结合的抗体及片断的三维结构 （晶体结构）已测定，为抗体改造，如提高抗原亲和 性，进行抗体人源化等提供理论依据。 免疫球蛋白结构与功能关系清楚，且不同功能的结构 域相互独立。 生物高技术不断涌现, 如噬菌体显示技术, 转基因小 鼠技术等.
CYTOGEN
CEA-Scan® technetium-99mArcitumomab Verluma® T99 nofetumomab
Immunomedics
小细胞肺癌显像1996
DuPont Merck
2002年美国已批准上市的治疗性抗体
名称 Rituxan ® Ritiximab Zenapax ® daclizumab 抗体类型
埋残基；isotype 的类型及CDR构型
（二）、关键鼠残基的保留
1、重要鼠残基确定依据 — 比较canonical结构，保留与canonical结构有关的关 键残基
— 保留包埋残基（paking residues）
—可变区亚组（sungroup）的保守氨基酸残基 —比较已知结构的抗体，确定FR中影响抗原结合的残基 —框架区残基的突变实验 —抗原结合位点三维结构的模建
生产公司
CYTOGEN
ORTHOCLONE OKT ®3 ReoPro ® Abciximab
Ortho Biotech
Centocor
ProstaScint®
MurineMAb (Prostate 前列腺腺癌1996 membrane specific antigen(PMSA))
Murine Fab´ fragment (AntiCEA) Murine MAb (Anti-small-cell lung 结肠癌1996
抗体工程研究及进展
一、抗体发展简史



多克隆抗体 单克隆抗体 工程抗体
诊断

治疗
很少用于治疗
多克隆抗体
灵敏度高
特异性差 （交叉反应）

副作用大 少数用于被动治疗 只有少数用于治疗 免疫源性 大量制备
单克隆抗体
特异性高 灵敏度低 （解决办法：多 种单抗混合）
鼠单抗局限性
制备麻烦，难以大量生产。 杂交瘤细胞稳定性差。 HAMA的产生。 半衰期短。 难以制备融合蛋白。 全抗体应用中的局限：分子量大，通透性 差； 恒定区的存在，导向特异性差。
人源化原则
1、CDR残基保持不变。
2、文献报道的重要残基保持不变，包括高风
险残基和维持LOOP结构的关键残基。
3、三维结构模建中重要残基不变，包括模建之中
的包埋残基和模建中影响CDR构型的残基。
来自百度文库

改型抗体
（一）人抗体的选择
1、轻、重链来自同一人抗体 2、“best fit” method ,轻、重链来自不同人抗体， 甚至抗体轻、重链各部分可来自于不同的人抗体 选择依据：序列同源性，尤其是框架区序列；考 虑与某一canonical结构结构相关的包
Humanized MAb (Anti- HER2)
Murine MAb (Anti-TNF alpha) Murine MAb (Anti-CD25)
乳腺癌1998
Crohn’s 病1998 类风湿1999，2001 肾移植1998
Genentech
Centocor
Novartis Pharmaceuticals