外周血DNA抽提(酚-氯仿法)

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酚氯仿法提取DNA的原理

作者: 渭水凡夫(站内联系TA)发布: 2013-04-06最近在博客上看到的一篇可以作为入门级《分子生物学十万个为什么》和大家分享一下用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。

缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。

2. 不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。

将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。

加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。

加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。

最后用95%乙醇沉淀DNA。

溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。

加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。

酚氯仿法提取dna注意事项

酚-氯仿法提取DNA时，需要注意以下几点：
1. 在吸取基因组DNA时，需要使用专用的粗口吸头，避免使用普通的吸头，因为这可能会切断或损坏DNA。

2. 在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上，以保持其低温状态。

3. 加缓冲液后，可以轻轻晃动或轻弹试管，以加速DNA的溶解。

4. 加入缓冲液后，可以置于4度过夜，这样也有助于溶解DNA。

5. 将DNA溶液在65度下温育10分钟，可以灭活DNase，防止其降解DNA。

6. 在抽提过程中，如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，这时可以增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。

7. 在酚抽提过程中，如果上清液太粘稠而无法进行水相转移，可以加入适量TES稀释后再抽提。

8. 氯仿的作用是克服酚的缺陷，加快有机相与液相的分层，最后用氯仿抽提出DNA。

由于酚易溶于氯仿中，可以快速去掉核酸溶液中的微量酚。

9. 加入异戊醇能减小分子表面张力，减少抽提流程中的泡沫发生。

通常选用氯仿与异戊醇为24:1的比例，异戊醇可
以帮助分相，使离心后的上层水相、下层有机溶剂相、中层变性蛋白相保持稳定的层次。

以上信息仅供参考，建议咨询专业人士获取准确信息。

酚-氯仿抽提DNA

方法一细菌沉淀加入567μlTE溶液(10mmol/L Tris- HCl , 1mmol/L EDTA, pH810) 重悬,加入10%SDS30μl 和20mg/ml 蛋白酶K3μl , 于37 ℃温育1h,加入5mol/LNaCL100μl , CTAB/NaCl 80μl 溶液, 于65 ℃温育10min,加入等体积的氯仿/异戊醇, 混匀, 4 ℃12000g/min离心5min。

将上清液转入另1个离心管中加等体积的酚/氯仿/异戊醇, 混匀, 4 ℃12000g/min 离心5min,提取上清置于另一管中, 加入0.6体积异丙醇, 轻柔混合, 4℃12000g/min离心5min, 弃上清加入70%乙醇洗涤1min, 离心, 弃上清, 将沉淀的DNA溶于100μl 的无菌去离子水中, - 20℃保存备用方法二取 1.5 mL 培养至对数生长期的菌液于 2.0 mL 的离心管中，8 000 r/min 离心5 min，弃上清；加入600 μL 消化液（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，1% SDS，200μg/mL蛋白酶K，20μg/mL RNase A），37℃消化30 min ；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25 /24/ 1）混合液，轻摇10 min，12 000 r/min 离心 5 min，取上清，重复抽提1次；加入等体积的氯仿/异戊醇（24 /1）混合液抽提 1 次；加入1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠和 2 倍体积的冰乙醇混匀，静置10 min，12 000 r/min 离心10 min，弃上清；沉淀加入 1 mL 70%乙醇洗涤2次，每次8 000 r/min 离心 5 min，弃乙醇，待沉淀中残余乙醇挥发后，加入50μL 超纯水溶解DNA。

4℃保存备用。

方法三将预处理后所得沉淀加入300μL细胞裂解液（主要成分：10mmol/L Tris-HCl 缓冲液、1mol /L 氢氧化钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、生理盐水、0.2%十二烷基硫酸钠），振荡混匀，于100℃加热15min。

外周血DNA提取技术

外周血DNA提取技术方法一：1. 标本预处理：将1ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml 磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min,倾去含裂解红细胞上清。

重复一次。

用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2. 消化：上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。

50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。

保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3. 酚抽提纯化DNA：上述反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。

5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。

重复酚抽提一次。

加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。

重复一次。

4. 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。

用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。

重复一次。

室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。

加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24小时。

5. DNA的浓度测定及纯度判定：取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。

按下面公式计算浓度：DNA浓度(ug/ul)= A260*50*稀释倍数/1000DNA纯度的判定：A260/A280 比值应介于1.7-2.0之间。

方法二：分别采集外周静脉血5ml，2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝待用(要求采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶)。

酚氯仿法提取DNA原理及方法

酚氯仿法提取DNA原理及方法酚氯仿法是一种常用的DNA提取方法，其原理是利用酚氯仿溶液对细胞和细胞碎片进行破碎，然后通过离心分离DNA。

以下是详细的步骤：1.细胞裂解：将待提取DNA的样本（细胞、组织等）加入含有酚氯仿的裂解缓冲液中，将溶液均匀混合。

酚氯仿是一种有机溶剂，能够破坏细胞膜和核膜，使细胞释放出DNA。

2.蛋白质沉淀：加入混合溶液中的蛋白质会和酚氯仿相互分离，形成一个物理屏障。

离心沉淀后，由于DNA密度比蛋白质低，DNA会上浮到上层，而蛋白质则沉淀在下层。

3.DNA沉淀：将上层液体转移到新的离心管中，加入同等体积的冷乙醇或异丙醇，然后轻轻振荡以促使DNA沉淀。

酒精能够与DNA相互作用，使DNA分子变得更加疏水，从而沉淀下来。

4.清洗：离心沉淀后，将上清液倒掉，加入70%乙醇洗涤沉淀。

乙醇通过去除残留的酚氯仿和其他杂质，使沉淀的DNA纯化。

5. 溶解：将洗涤后的DNA沉淀干燥或用适量的缓冲液溶解，最常用的是TE缓冲液（含有10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA），以便后续的DNA浓度测定和实验操作。

总结来说，酚氯仿法利用酚氯仿溶液破坏细胞膜和核膜，将DNA从细胞中释放出来。

离心分离蛋白质和DNA，然后通过酒精沉淀和乙醇洗涤纯化提取的DNA。

这种方法简单快速，并且能够获得较纯的DNA样品。

不过，酚氯仿法在提取DNA时会同时提取到RNA和蛋白质，因此在一些需要高纯度DNA的实验中可能不适用。

在使用酚氯仿法提取DNA时，还需要注意避免DNA的降解，避免污染和交叉污染，以及正确保存提取的DNA样品。

血样DNA提取方法

酚-氯仿法从全血中分离DNA二、操作步骤第一阶段：裂解与消化1、冰冻的血样在室温水浴中融化；2、将2 mL全血转入一个无菌的2 mL离心管中；3、4 ℃12000rpm离心10 min；4、弃掉液体，保留沉淀，加入1.5 mL的PBS缓冲液，涡旋震荡使沉淀悬浮起来，冰上温和摇动15 min；(2、将1 mL全血转入一个无菌的2 mL离心管中；3、加入等体积（1 mL）的PBS缓冲液，温和摇动15 min；)5、4 ℃12000rpm(3500 g)离心10 min，弃掉液体，保留沉淀；6、重复步骤4、5一次；至上清液透明，沉淀无色；6、用蓝枪头将沉淀捣碎，呈絮状（关键步骤，越碎越好）；7、离心管中加DNA提取液500μL-1 mL, 37 ℃水浴1 h,加蛋白酶K 3 μL -6 μL；（终浓度为60 μg/mL），混匀；8、在恒温水浴箱中37 ℃（55 ℃）温育过夜（16 h左右），至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；10、反应液冷却至室温，加入1 mL的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20 min；11、4 ℃，12000 rpm离心10 min；12、将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中；13、加入0.5 mL的饱和酚和0.5 mL的氯仿，放置冰上温和摇动20 min；14、4 ℃，12000 rpm离心10 min；15、将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中；16、加入1 mL的氯仿，放置冰上温和摇动20 min；17、4 ℃，12000 rpm离心10 min；18、将上层水相用移液器移到1.5mL离心管中；19、加入1mL预冷无水乙醇（−20 ℃），轻轻口底摇晃多次至DNA析出，然后−20 ℃放置30 min（-20或-40均可）；20、用玻璃钩将DNA团钩出转入一新的灭菌离心管中，或4 ℃，12000 g离心10 min，弃去乙醇；或者4 ℃，12000 rpm离心10 min，弃去乙醇；21、加入70% 乙醇1 mL，温和摇动10 min；22、4 ℃，12000 rpm离心10 min，弃乙醇，重复漂洗一次（用移液枪将管底剩余酒精吸出）；23、真空干燥或室温下使乙醇挥发干净；或者，室温放置30min，60℃烘箱30s，使乙醇挥发干净；24、根据DNA的量，加入超纯水50-300 μL，4 ℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80 ℃保存。

酚氯仿抽提

酚氯仿抽提一、DNA抽提试剂：1.酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）；2.3M NaAc（pH 5.2）；3.80%乙醇。

步骤：1. 样品加去离子水至总体积100 μL；2．加入100 μl已配好的酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），充分震荡后，10,000 rpm离心10 min；3. 转移上清于新的离心管中，按体积的1/10加入3M NaAc（pH5.2），按体积的2倍加入100%乙醇，轻轻混匀后，-20 ︒C静至至少30 min沉淀DNA；4. 4 ˚C，12,000 rpm离心10 min，弃去上清；5. 1 mL的80%乙醇洗沉淀，10,000 rpm离心2 min；6. 弃去乙醇，风干后，加入适量去离子水或TE溶解质粒。

二、RNA抽提试剂：1.水饱和酚；2.氯仿；3.3M NaAc（pH 5.2，DEPC水配制）；4.75%乙醇（DEPC水配制）。

步骤：1. 加入DEPC水至总体积为100 μL；2. 加入水饱和酚/氯仿(1:1)，室温混匀；3. 4°C, 12, 000 rpm, 15 min；转移上清至新的离心管中；4. 加入等体积的氯仿，4 ︒C, 12, 000 rpm, 15 min, 取上清；5. 加入上清体积1/10的3M NaAc（pH5.2, DEPC水配制）和2.5倍体积的100%的乙醇，-80 ︒C沉淀过夜；6. 4 ︒C离心，12, 000 rpm, 30 min；7. 去上清，加入100 μL 75%乙醇(DEPC水配制)，洗涤沉淀；8. 12, 000 rpm 离心5 min，去乙醇；风干，溶于适量DEPC水中，-20 ︒C保存。

酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理

酚氯仿法提取DNA主要步骤：1.将动物组织放在1.5ml的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。

每个梯度脱水时间为5-10min2.将组织放入研钵中，加入适量DNA裂解液（300μl），研磨后再加入300μlDNA裂解液冲洗研磨棒。

3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10μl蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56℃,5h）。

4.加入等体积的Tris饱和酚（500μl），摇匀（10min）。

5.离心：12000R，7min，4℃。

离心后分成上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质。

6.吸取上层液体加入新的离心管。

7.配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。

8.在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl，摇匀10min。

9.离心：12000R，7min，4℃。

10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl（氯仿：异戊醇=24:1）。

11.离心：12000R，7min，4℃。

12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的100%的酒精。

-20℃过夜。

13.将样品取出，12000R，7min，4℃离心。

14.弃上清，留白色沉淀（DNA），加400μl的75%的经过-20℃冷冻的酒精，反复吹打溶解。

15.重复第14步骤2次（用75%酒精洗三次）。

16.提取DNA完成。

溴氯仿法提取DNA的原理：用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。

缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。

2. 不能完全抑制RNase 的活性。

酚氯仿抽提dna原理

酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿（Phenol-Chloroform）抽提DNA是一种常用的DNA 提取方法。

其原理是基于酚在酸性条件下具有与DNA高度亲和性的特点，可以将DNA从细胞溶液中抽提出来。

具体的步骤如下：
1. 细胞溶解：首先将待提取DNA的细胞样品加入适量的细胞裂解缓冲液中，通过机械或化学方法使细胞壁破裂，释放出细胞内的DNA。

2. 酚抽提：加入相同体积的酚溶液，并进行充分混合。

酚能与DNA形成复合物，并与其他细胞组分（如蛋白质和脂质）发生分层，形成一个DNA上层和一个下层。

3. 脱水：将抽提产物转移至新管中，加入酒精或异丙醇，通过离心将DNA沉淀下来。

脱水过程可以去除溶液中的多余酚，提高DNA沉淀的纯度。

4. 酯化：将DNA沉淀物溶解在适量的TE缓冲液（含有EDTA和Tris）中，经过一定的时间酯化，使DNA变得更为稳定。

5. 沉淀：通过低温离心将DNA沉淀下来，去除上清液。

6. 洗涤：用70%的乙醇洗涤并去除残余的盐、酚和脏物质。

洗涤过程中，可以多次进行离心和上清液倒掉操作。

7. 干燥：最后，将DNA输送液置于干燥器中或者自然风干，以去除溶剂中的残留物质，得到纯度较高的DNA。

通过酚氯仿抽提DNA的方法，可以从复杂的细胞中提取出高质量、高纯度的DNA，以供后续分子生物学研究使用。

自己整理外周血DNA 提取-酚氯仿法

DNA 提取实验目的：外周血DNA提取实验试剂：1×RBC裂解液、1×细胞核裂解液、20%SDS、蛋白酶K、Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、70%酒精、TE缓冲液实验耗材：15ml、1.5ml离心管、枪头实验流程：1.将EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入15ml离心管中，加满1×RBC裂解液，充分混匀（上下颠倒100次），冰上静置30min，直至溶液变透明，离心机4℃3000rp离心12min，去上清液，留白色沉淀（约3-4ml），再次重复上述步骤。

2.在沉淀（2-3ml）中加入1×细胞核裂解液3ml，20%SDS 150-200μL，混匀至粘稠透明状，再加入20mg/ml的蛋白酶K 25-35μL，充分混匀后，37℃50rpm的恒温摇床过夜。

3.加入等体积的Tris饱和酚（约6ml）反复充分摇匀后，置离心机4℃3000rp离心10min4.将上清移至另一离心管中，加入等体积的酚/氯仿（各3ml左右），混匀，室温下离心10min5.再次将上清液移至另一离心管中，加入2倍体积（约10ml）的无水乙醇，轻轻摇晃上下倒转混匀，可析出白色沉淀物（gDNA），离心20℃3000rp 5min 6.用1000μL移液器小心吸出gDNA置于1.5ml的灭菌Ep管中，用70%的酒精漂洗2次，离心4℃10000rp 5min7.用gDNA溶解于200μL TE缓冲液中8.用10μL移液器取2μL TE缓冲液滴入紫外线分光光度计，调零，然后再取2μL直接读数。

9.测量好DNA的浓度后，将gDNA稀释至50ng/μL，用200μL无菌EP管分装，每管分装50μL置-80℃冰箱保存10.DNA的浓度测定及纯度判定：取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE做空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。

按下面公式计算浓度：DNA浓度(ug/ul)= A260*50*稀释倍数/1000 DNA纯度的判定：A260/A280 比值应介于1.7-2.0之间。

基因组DNA的提取方法—酚

基因组DNA的提取方法—酚-氯仿抽提法1. 将95% 酒精浸泡过的标本取出，用吸水纸吸去标本表面的乙醇，用1×TE Buffer浸泡两次，每次20min。

2. 解剖取个体胸部肌肉组织约0.02g，将组织转入1.5mL离心管加入1mL液氮使其迅速冻结, 用玻璃棒迅速有力地将团状组织研磨成细粉末。

3. 加入500uL消化液（消化液成分为NaCl 0.1mol/L, Tris-HCl 0.3mol/L, EDTA 0.01mol/L, SDS 1%, Proteimase K 200ug/mL），于56℃恒稳水浴中消化8-10小时, 每隔两小时摇晃一次。

4. 消化结束后，加入等体积的饱和酚（pH7.6），用封口胶封好，置于混匀器上约12小时，离心10分钟（10000r/m）。

5. 取上清液于另一新的EP管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），缓慢抽提20分钟，离心10分钟（10000r/m）。

6. 取上清液于另一新的EP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），缓慢抽提20分钟，离心10分钟（10000r/m）。

7. 取上清液于另一新的EP管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃放置2小时。

8. 离心后，DNA沉积于管底，用70%的预冷的乙醇洗涤2次，37℃烘干。

烘干的DNA溶于TE中，4℃保存。

9. 于基因组DNA中加入终浓度为50ug/mL的RNase（每次使用前90℃灭活10min），于37℃消化1.0-1.5hr。

10. 用0.8%的琼脂糖凝胶检测，取3μL DNA样品及2μL Load-buffer (含溴酚蓝和缓冲液)，加入点样孔。

实验所用Marker是 DNA（EcoR/HindIII），100V电压电泳90分钟。

凝胶成象分析仪进行检测。

11. 用紫外可见分光光度计测定DNA的OD值，判定DNA纯度和浓度。

酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理

酚氯仿法提‎取DNA主‎要步骤：1.将动物组织‎放在1.5ml的离‎心管中，分别用75‎%、50%酒精和纯水‎梯度脱酒精‎。

每个梯度脱‎水时间为5‎-10min‎2.将组织放入‎研钵中，加入适量D‎N A裂解液‎（300μl‎），研磨后再加‎入300μ‎l DNA裂‎解液冲洗研‎磨棒。

3.将研磨好的‎组织液用移‎液枪加到1‎.5ml离心‎管，在管中加1‎0μl蛋白‎酶K，用封口带将‎离心管封口‎，放入摇床（56℃,5h）。

4.加入等体积‎的Tris‎饱和酚（500μl‎），摇匀（10min‎）。

5.离心：12000‎R，7min，4℃。

离心后分成‎上中下三层‎，上层为DN‎A，中层为蛋白‎质，下层为有机‎质。

6.吸取上层液‎体加入新的‎离心管。

7.配制Tri‎s饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。

8.在含有上清‎液的离心管‎中加入Tr‎i s饱和酚‎、氯仿和异戊‎醇混合液4‎50μl，摇匀10m‎i n。

9.离心：12000‎R，7min，4℃。

10.吸取上清液‎加到新的离‎心管，加入等体积‎的氯仿和异‎戊醇混合液‎400μl‎（氯仿：异戊醇=24:1）。

11.离心：12000‎R，7min，4℃。

12.吸取上清液‎加入新的离‎心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的10‎0%的酒精。

-20℃过夜。

13.将样品取出‎，12000‎R，7min，4℃离心。

14.弃上清，留白色沉淀‎（DNA），加400μ‎l的75%的经过-20℃冷冻的酒精‎，反复吹打溶‎解。

15.重复第14‎步骤2次（用75%酒精洗三次‎）。

16.提取DNA‎完成。

溴氯仿法提‎取DNA的‎原理：用酚抽提细‎胞DNA时‎，有什么作用‎？使蛋白质变‎性，同时抑制了‎D Nase‎的降解作用‎。

用苯酚处理‎匀浆液时，由于蛋白与‎D NA联结键已断‎，蛋白分子表‎面又含有很‎多极性基团‎与苯酚相似‎相溶。

蛋白分子溶‎于酚相，而DNA 溶‎于水相。

DNA提取方法和步骤

DNA提取方法和步骤一、常见的DNA提取方法：1. 酚/氯仿法（Phenol/Chloroform Extraction）：通过使用酚/氯仿等有机溶剂来分离DNA分子。

2. 盐水法（Salting out）：通过使用高盐浓度来析出DNA分子。

3. 硅胶柱法（Silica-based purification）：通过与硅胶矩阵相互作用，从混合溶液中纯化DNA。

4. 高盐法（High salt method）：通过使用高盐浓度来沉淀DNA。

5. CTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide method）：通过使用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）来分离DNA。

二、通用的DNA提取步骤：1.样本收集：从所需生物体（如植物组织、动物组织、血液等）中收集样本。

样本的品质对提取后的DNA质量影响很大，因此需要保证样本的新鲜度和完整性。

2.细胞破碎：将收集到的样本进行细胞破碎，使DNA从细胞的内部释放出来。

这可以通过机械方法（搅拌、刮擦等）、溶解酶或离心等方法来实现。

3. 除去蛋白质和RNA：加入蛋白酶等酶解蛋白质，使其降解分解。

同时，也可以加入RNase酶降解RNA，以免在提取过程中受到污染。

4.DNA沉淀：加入盐溶液以增加DNA的溶解性，然后加入酒精来沉淀DNA分子。

酒精的加入可以调节盐溶液中Na+和DNA的酒精沉淀剂（如异丙醇或乙醇）的比例，从而沉淀出DNA。

5.洗涤：将沉淀下的DNA溶于适当的缓冲液中，以去除沉淀剂、盐等杂质。

6. 保存：最后，将DNA保存在适当的缓冲液中，如TE缓冲液（Tris-EDTA），并在低温下存储。

三、酚/氯仿法DNA提取步骤：1.细胞破碎：将细胞或组织加入到含有裂解缓冲液的试管中，使用机械方法（高速离心、搅拌等）或酶解来破碎细胞膜。

2.调整pH值：加入适量的酚/氯仿溶液，并快速倒转试管数次，使试管中的溶液充分混合。

酚会与细胞残渣中的蛋白质结合形成亲水性复合物，而氯仿可以帮助去除蛋白质。

酚氯仿法提取DNA实验报告

酚氯仿法和试剂盒法提取DNA实验报告一、实验目的实验原理：酚氯仿法：先从全血中分离白细胞，再通过蛋白酶K消化，通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸晶使DNA分子完整地分离出来。

氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出来再向萃取液中加入适量乙醇晶可使DNA析出。

氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。

而DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA二、实验用品试剂：1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0), 0.5M EDTA（pH8.0），5M NaCl TES（15mM Tris, 15mM EDTA，15mM NaCl）Tris饱和酚（PH8.0）氯仿/异戊醇（V/V=24/1）10％SDS5mg/ml Protease K70％乙醇、无水乙醇TE缓冲液（pH8.0）：10mM T ris-Cl（PH8.0）1mM E DTA(PH8.0)10mg/mL 溴化乙锭（EB）耗材：仪器：低温离心机、移液枪一套，低温冰箱，恒温水浴锅、紫外分光光度计（Eppendorf）。

三、实验步骤4.1取血样：实验人员相互取血样5ml.（用品：采血管、采血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸）4.2血液样品的预处理：分取2ml 血样加入到离心管A中用于酚氯仿法提取DNA。

1) 破除RBC：用移液器将采血管中剩余的3ml血样中的血凝块取出转移到组织匀浆器中研磨粉碎，再移入50ml 离心管B中，再加入5倍体积无菌水，颠倒混匀，冰上静置十分钟，用于试剂盒法提取DNA。

酚氯仿抽提dna原理

酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿抽提DNA原理是一种常用的DNA提取方法，通过该
方法可以从复杂的生物样品中高效地提取纯度较高的DNA样本。

其原理主要包括以下几个步骤：
1. 细胞破碎：首先将待提取的生物样品经过离心等操作，去除无关细胞和组织，然后使用细胞裂解缓冲液将目标细胞破碎，使细胞内部的DNA释放出来。

2. 蛋白酶处理：在细胞裂解的过程中，蛋白酶会释放出来，为了去除其对DNA的影响，可以加入蛋白酶抑制剂来保护DNA。

此步骤的目的是降解蛋白质，同时保持DNA的完整性。

3. 混合酚氯仿：将细胞裂解液与等体积的氯仿混合，产生两相体系。

氯仿主要用来分离DNA和其他细胞成分，如脂质、蛋
白质等。

在混合过程中，DNA溶于水相，而其他成分溶于有
机相。

这样，通过离心使两相分离。

DNA会聚集在水相中。

4. DNA沉淀：将水相转移到新的离心管中，加入冷酒精或异
丙醇，使DNA沉淀出来。

酒精或异丙醇中的离子会中和
DNA上的电荷，从而使DNA不溶于水，形成可见的白色沉淀。

5. 洗涤与溶解：将DNA沉淀用无菌蒸馏水洗涤去除酒精或异
丙醇的残余，并用TE缓冲液溶解DNA，使其得以储存和进
一步应用。

通过酚氯仿抽提DNA，可以将DNA从细胞中高效地提取出
来，纯度较高，适用于许多分子生物学实验和技术的应用，如PCR、酶切、测序等。

酚氯仿法提取dna注意事项 -回复

酚氯仿法提取dna注意事项-回复酚氯仿法是一种常用的DNA提取方法，适用于从多种生物样本中提取高质量的DNA，具有操作简便、成本低廉、提取效果好的优点。

然而，在进行酚氯仿法提取DNA时，有一些注意事项需要遵守，以确保提取到的DNA质量和纯度满足实验要求。

本文将一步一步回答有关这一主题的问题。

第一步：准备实验材料在进行酚氯仿法提取DNA之前，需要准备好以下实验材料:- 酚氯仿：用于沉淀DNA，可以购买现成的酚氯仿溶液。

- 氯仿：用于去除蛋白质等杂质。

- 去离子水：用于配制实验缓冲液和洗涤试剂。

- 各种缓冲液：例如Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液等，用于维持溶液的pH 值、维持DNA的稳定性等。

- 乙醇、异丙醇：用于洗涤、沉淀DNA等步骤。

- 高速离心管、离心机：用于离心沉淀DNA。

- 热板：用于DNA溶解步骤中的加热。

- 显微镜：用于观察DNA的溶解情况。

第二步：取样从待提取DNA的生物样本中取样时，需要注意以下几点:- 样本应选择新鲜的、含有丰富DNA的组织或细胞。

- 取样时应尽量避免污染，使用无菌工具，避免有外源DNA的干扰。

第三步：细胞破碎将取得的样本放入离心管中，加入破碎液并充分混匀。

常用的细胞破碎液包括含有洗涤剂（例如SDS或Triton X-100）和蛋白酶K的缓冲液。

注意事项如下：- 破碎液应加入足够量，以确保细胞完全破裂。

- 破碎液的温度和pH值应适宜，通常为室温和中性pH值。

第四步：离心将混合后的细胞溶液进行离心，去除细胞碎片和细胞核。

注意事项如下：- 离心条件应根据细胞大小和沉淀速度进行调整，通常为1,200-2,000 rpm，5-10分钟。

- 应尽量避免将上清液中的沉淀物和底物混合。

第五步：提取DNA将上清液转移到新的离心管中，加入酚氯仿并混合。

注意事项如下：- 酚氯仿的添加量应为样本体积的1/5-1/10，用于沉淀DNA。

- 混合时应充分摇匀，以便酚氯仿与上清液充分接触。

酚-氯仿抽提DNA

DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。

本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。

二、材料以方法1、材料：培养菌体2、仪器设备：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪3、试剂：细胞裂解液100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 500 mM NaCl 1.25% SDS(PH 7.5) 饱和酚氯仿/异戊醇酚/氯仿/异戊醇无水乙醇70％乙醇异丙醇 3 M NaAc(pH5.2) RNase 50×TE缓冲液电泳载样缓冲液三、操作步骤（1）培养菌体（2）加入10 ml裂解液，1/10体积酚，于65℃下20－30 min，然后加入等体积的氯仿，轻摇（3）12000－15000rpm离心15 min（4）取上淸液，加入等体积氯仿，轻摇，12000－15000rpm离心15 min（5）取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃）（6）加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2)，置于室温下10 min（7）12000－15000rpm离心10 min（8）倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀（9）加入2倍体积无水乙醇（10）12000－15000rpm离心10 min（11）倒弃液体留下沉淀，真空干燥（12）复溶于2 ml TE（13）加入RNase，65℃或37℃处理10－30 min（14）加等体积酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000－15000rpm离心10 min（15）取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃）（16）加入1/10体积的3 M NaAc(PH5.2)，置于室温下10 min（17）12000－15000rpm离心10 min（18）倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀（19）真空干燥沉淀（20）复溶于0.5－1.0 ml的TE或水中，分装成小体积，4℃或-20℃保存。

血液中DNA提取的原理

血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。

因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞；第二，白细胞裂解：使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三，除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中；第四，在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。

取材取外周血5ml，EDTA抗凝1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液；2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml 细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml;Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌,用时加10-20ml3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；5.如裂解不完全可重复步骤2和3；6.重悬细胞，用于后续实验；提取DNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行.酚氯仿方法提取DNA在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。

2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。

血液DNA提取方法-传统法

血液genomic DNA提取及检测方法酚仿抽提法1. 裂解细胞（消化）（1）在1.5 ml EP管中分别加入30-40μl的新鲜ACD抗凝血样；（2）在每个EP管中加入700μl细胞裂解液，充分混匀10min;（3）加入30μl的蛋白酶K（终浓度为20mg/ml），振荡10min;（4）55℃，220转/min，水浴振荡过夜消化。

2. DNA提取（1）将消化后的血液加入600μl的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12 000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μl上清液至干净的离心管中；（2）重复步骤1，提取效果更好；（3）加入600μl的酚仿（Tris饱和酚：氯仿=1:1），缓慢颠倒离心管10min，然后12 000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μl上清液至干净的离心管中；（4）加入600μl的氯仿异戊醇（氯仿：异戊醇=24:1），缓慢颠倒离心管10min，然后12 000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取300μl上清液至干净的离心管中；（5）加入1000μl的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动；（6）用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μl 70%乙醇的离心管中洗涤，8000 rpm，离心3-5min，弃上清；或者8000 rpm，离心3-5min，倒掉上清，再加入300μl 70%乙醇洗涤8000 rpm，离心3-5min，弃上清；（7）将乙醇倒干净，室温下让乙醇挥发，晾干2-3h;（8）加入100μl ddH2O溶解DNA（或者适量TE缓冲液），溶解好的DNA，4℃过夜保存。

然后置于-20℃长期保存。

3. DNA质量和浓度检测（1）用NanoDrop2000测量DNA浓度及OD值，OD260/OD280=1.8-2.0，较好。

（2）用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

备注：1. 提前配置好酚仿、氯仿异戊醇、proteinase K;2. EP管编号备用。