酚氯仿法提取DNA实验报告

酚氯仿法和试剂盒法提取DNA实验报告

一、实验目的

实验原理：酚氯仿法：先从全血中分离白细胞，再通过蛋白酶K

消化，通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白

质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化

DNA。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在

下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体

系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白

与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性

而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸

晶使DNA分子完整地分离出来。氯仿-异戊醇溶

液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出

来再向萃取液中加入适量乙醇晶可使DNA析

出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化

研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶

氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层

异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而

DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙

醇沉淀来纯化和浓缩DNA

二、实验用品

试剂：

1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0), 0.5M EDTA（pH8.0），5M NaCl TES（15mM Tris, 15mM EDTA，15mM NaCl）

Tris饱和酚（PH8.0）

氯仿/异戊醇（V/V=24/1）

10％SDS

5mg/ml Protease K

70％乙醇、无水乙醇

TE缓冲液（pH8.0）：10mM T ris-Cl（PH8.0）

1mM E DTA(PH8.0)

10mg/mL 溴化乙锭（EB）

耗材：

仪器：低温离心机、移液枪一套，低温冰箱，恒温水浴锅、紫外分光光度计（Eppendorf）。

三、实验步骤

4.1取血样：实验人员相互取血样5ml.（用品：采血管、采

血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸）

4.2血液样品的预处理：分取2ml 血样加入到离心管A中

用于酚氯仿法提取DNA。

1) 破除RBC：

用移液器将采血管中剩余的3ml血样中的血凝块取出转移到组织匀浆器中研磨粉碎，再移入50ml 离心管B中，再加入5倍体积无菌水，颠倒混匀，冰上静置十分钟，用于试剂盒法提取DNA。同样方法破除离心管A中的红细胞。

2）离心管A：4℃，3000rpm，离心10min，弃上清，留沉淀，重复低渗、离心处理一次。

3）离心管A：加入30ml 生理盐水，上下轻轻混匀以重新悬浮、洗涤WBC沉淀，4℃，3000rpm，离心10min，弃上清，留沉淀。转移到１．５ｍｌ离心管中。（注意尽可能将上清弃净，同时不要丢失WBC沉淀）

4）用Protease K消化WBC：

在离心管中加入4ml TES，立即用移液器吹打，将细胞团块吹散。

加入100%SDS 350 ul，5mg/ml Protease K 100ul，充分混匀，65℃消化6 h。

４．２试剂盒法提取ＤＮＡ

１）向离心管B加入3倍体积的Buffer RBL 轻轻涡旋或颠倒混匀，3000rpm离心10min，小心弃上清，留沉淀。２）向沉淀中加入400ul Buffer GR，并转移到1.5ml离心管中，混匀；在此基础上加入40ulProteaseK，混匀；再加入400ul Buffer GL ，颠倒混匀，剧烈旋涡震荡一分钟。

３）用塑料膜密封离心管管口，放入恒温箱中70℃10min，（延长孵育时间）至溶液清亮。

４）加入400ul无水乙醇，颠倒混匀，4℃，3000rpm，离心1 min。

５）将上步所得溶液加入到已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DL）中，8000g离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

６）向吸附柱中加入500ul BufferＧＷ１（使用前检查是否加入无水乙醇），１００００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

７）向吸附柱中加入500ul BufferＧＷ２（使用前检查是否加入无水乙醇），１００００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

８）再次１００００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，弃废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

９）将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入５０ｍｌＢｕｆｆｅｒＧＥ，１００００ｒｐｍ离心一分钟，收集ＤＮＡ溶液，－２０℃保存。

４．３酚氯仿法法ＤＮＡ提取

１）消化６ｈ后的细胞悬液中加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置１０ｍｉｎ，４℃，３０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ。

２）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置１０ｍｉｎ，４℃，３０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ。

３）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的氯仿／异戊醇（体积比２４:１），上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置１０ｍｉｎ，４℃，３０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ。

４）将上层水相转移到一个小烧杯中，加入２．５倍体积的无水乙醇，冰上放置３０ｍｉｎ，可见网状ＤＮＡ白色沉淀析出，轻旋小烧杯，网状ＤＮＡ聚集成团。

５）用ｔｉｐ头将ＤＮＡ捞出，放入１．５ｍｌ的Ｅｐ管中，用预冷的７０％乙醇洗涤一次，４℃，１００００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ，弃上清，放入－２０℃中用吸水纸片盖住Ｅｐ管口，过夜干燥。