实验二植物体内硝酸还原酶活力的测定共16页文档
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
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首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
实验二 植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验二 植物体内硝酸还原酶 活力的测定
NO3-和NH4+是能被植物利用的最主 要的氮源。在一般田间条件下， NO3- 是植物吸收的主要形式。
硝酸盐的还原
硝酸盐
硝酸还原酶
亚硝 酸盐
亚硝酸还原酶
氨
硝酸还原酶是一种诱导酶，在植酸还原酶。
V3——与磺胺等发生颜色反应的总体积（mL）； 5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次， 将液体转入离心管中，共用提取液6 mL，4℃ 8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。 植物生物学实验-植物生理部分 根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（µg/mL ）。 小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组）
W ——样品质量（g）； 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.
NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步 植物生物学实验-植物生理部分
NR的测定可分为活体法和离体法。
⑼移液管(5、2、1mL) ；
骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂， NO3- +NADH + H+
【实验步骤】
标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺 序加入试剂，配成0-0.20µg/mL的系列标准亚 硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然 后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度 （µg/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标 （r）建立回归方程。
管号
1234567
试剂 取量 mL
样品中酶活性（µg ·g-1·h-1）=
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告硝酸还原酶活性的测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的作用。
它能够将硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，参与到氮代谢中。
本实验旨在通过测定硝酸还原酶活性的方法，探究其在不同条件下的变化规律，从而深入了解这一酶的功能及其对生物体的重要性。
材料与方法：1. 实验材料：- 萝卜组织样品- 硝酸还原酶提取液- 硝酸还原酶底物溶液- 甲酚硫酸溶液- 氨水溶液- 高锰酸钾溶液- 氯化亚铁溶液- 硝酸铜溶液- 硫酸亚铁溶液- 硫酸铵铁溶液- 蒸馏水2. 实验方法：- 提取硝酸还原酶：将萝卜组织样品切碎并加入硝酸还原酶提取液，搅拌均匀后离心，取上清液作为硝酸还原酶提取液。
- 测定硝酸还原酶活性：将硝酸还原酶提取液与硝酸还原酶底物溶液混合，反应一段时间后，加入甲酚硫酸溶液停止反应。
然后，分别加入氨水溶液和高锰酸钾溶液，测定吸光度。
- 构建标准曲线：分别取一系列浓度的硝酸铜溶液，加入硫酸亚铁溶液和硫酸铵铁溶液，测定吸光度。
根据吸光度与浓度的关系，绘制标准曲线。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了硝酸还原酶活性的数据，并根据标准曲线计算了不同样品中硝酸还原酶的活性。
首先，我们观察到在不同温度条件下，硝酸还原酶活性的变化。
结果显示，在较低的温度下，硝酸还原酶活性较低，随着温度的升高，酶活性逐渐增加，但在一定温度范围内，酶活性会达到峰值后开始下降。
这表明硝酸还原酶对温度敏感，适宜的温度能够促进酶的活性，但过高的温度则会导致酶的变性和失活。
其次，我们研究了不同pH值对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在中性pH范围内，硝酸还原酶活性较高，而在酸性或碱性条件下，酶活性明显下降。
这说明硝酸还原酶对于酸碱度有一定的适应范围，过高或过低的pH值都会影响酶的活性。
此外，我们还研究了不同浓度的底物对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在一定范围内，随着底物浓度的增加，硝酸还原酶活性呈现出增加的趋势。
植物体内硝酸还原酶活性的测定
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。
6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， 0.0570 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
实验报告-硝酸还原酶活性的测定
实验报告-硝酸还原酶活性的测定实验目的：通过测定差示分光光度法下重铬酸钾氧化还原的反应，间接测定硝酸还原酶的活性。
实验原理：硝酸还原酶是一种以二价铁离子为电子受体的酶，能将NO2-还原为NO，是硝化作用的逆反应。
硝酸还原酶活性含量的测定常用于土壤、水环境等环境污染的检测。
本实验采用差示分光光度法来测定硝酸还原酶活性。
本实验中的差示分光光度法，利用重铬酸钾通过氧化还原反应，证明硝酸还原酶活性的存在。
重铬酸钾可以与硫酸铵和硝酸根离子反应，生成过氧化双铬离子和金属铵盐，同时溶液中的硝酸根离子被还原成氨氮产生气体释放出来。
通过测定溶液中氨氮的浓度，就可以计算出硝酸还原酶的活性含量。
实验步骤：1.准备A、B、C三个样品液。
A液：葡萄糖酸钙0.2g、1.5ml缓冲溶液、0.3ml菌液，加水至50ml。
B液：A液中再加菌液0.1ml。
C液：A液中再加无菌蒸馏水0.1ml代替菌液。
2.分别在三个位于水浴中的试管中加入A、B、C液各5ml并在水浴中孵育30分钟。
3.在孵育A液和C液试管的时间中，用硫酸铵和硝酸铵配制1%的硝酸根离子的溶液，重铬酸钾以及0.05%的草酸铁溶液。
4.在孵育后立即对A、B、C液各加入10ml配制好的硝酸根离子溶液。
5.再依次加入相同体积的重铬酸钾、草酸铁溶液，灵敏管测定氨氮的相对吸收值。
实验结果：样品重铬酸钾溶液的吸光度草酸铁溶液的吸光度比值氨氮浓度（mg/L）A 0.87 0.28 3.11 4.7B 0.77 0.25 3.08 4.6C 0.05 0.03 1.67 2.5实验分析：由上表可知，A、B两个样品的吸光度比值相差不太明显，说明A液中添加的0.1ml菌液对硝酸还原酶的活性没有显著的提高作用，而C液则比较显著地破坏了硝酸还原酶的活性，其氨氮浓度只有A、B两个样品的一半。
通过本次实验的差示分光光度法测定硝酸还原酶活性的方法，我们发现添加微生物菌液可以提高硝酸还原酶的活性，而加入无菌蒸馏水则会对其产生损害。
实验二、植物体内硝酸还原酶活力的测定(精)
2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4
0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
实验步骤：
1. 酶的提取
1g小麦叶片(剪碎放入欲冷的研钵)
加8ml提取液充分研磨，纱布过滤
收集匀浆液于4000rpmx20min,取上清液(粗酶液)
2. 酶反应
反应体系 粗酶液 对照组1 1ml KNO3 1.6ml NADH 磷酸缓 冲液 — 0.4ml
结果计算
X × V /V × V 3 2 1 -1 -1 样品中酶活性（µ g· g · h ）= W×t(h)
X —反应液酶催化产生的亚硝态氮总量（µ g）； V1——提取酶时加入的缓冲液体积（ml）； V2——酶反应时加入的粗酶液体积（ml）；
V3——颜色反应时的体原理：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同 化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐 还原为亚硝酸盐： NO3- +NADH + H+ +H2O
NR
NO2- +NAD+
离体法
实验材料:
新鲜小麦叶片(小麦幼苗提前3天用0.05M KNO3浇灌)
主要步骤
标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入 试剂，配成0-2.0µ g的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀 以亚硝态氮浓度（µ g/mL）为横坐标（X），吸光值
植物细胞
NO3—
呼吸代谢
NADH NAD
NO2—
NO3—
NO2—
外界溶液
实验材料
蜀葵的新鲜叶片
配置溶液
对照组： 0.1M pH7.5磷酸缓冲液5ml+蒸 馏水5ml+ 25mM蔗糖溶液0.1ml +异丙醇 0.1ml 反应组：0.1M KNO3溶液10ml+ 25mM蔗 糖溶液0.1ml +异丙醇0.1ml
硝酸还原酶活性的测定
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法[原理]：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法]摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
2 2014 植物硝酸还原酶的测定(体内法)
实验目的
◇了解硝酸还原酶在氮代谢中的地位
◇掌握硝酸还原酶活性测定的方法
实验原理
◇环境中的NO3－进入细胞后硝酸还原酶还原成NO2－ ，
并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2－ 的含 量即可得知硝酸还原酶活性大小
KNO3溶液
NO3－
酶反应
NO2－
◇硝酸还原酶（NR）可将NO3－还原成NO2－ ，反应为： NO3
◇盛装液体时，液体高度为比 色皿的2/3处
透光面 ◇使用后，立即用蒸馏水冲洗 干净，倒置在滤纸上 磨砂面 （手接触）
底及两侧为磨毛玻 璃,另两面为光学玻 璃制成的透光面
◇加了磺胺和萘胺的溶液倒入有机废液 缸
◇叶片倒入水槽中
思考题
1.本实验需控制哪方面的误差，才能取得精 确结果？ 2.测定过程中，加入KNO3溶液起什么作用？
实验材料
植物新鲜叶片 八角金盘
实验试剂
◇亚硝酸钠标准液 ◇磺胺溶液 ◇萘胺溶液 ◇ 0.1M磷酸缓冲液（pH 7.5） ◇ 0.2M硝酸钾溶液
实验器材
◇三角瓶3个，试管9支，移液管 ◇剪刀 ◇天平 ◇吸水纸 ◇真空干燥器 ◇恒温箱 ◇分光光度计
实验步骤
酶反应
样品 酶活性测定
15min 30min
比色测定
OD 520nm
标准曲线制作
比色测定
30min
OD 520nm
实验步骤一（1 .酶反应）
剪成0.5cm大小的叶片 (避开主叶脉)
（1）叶片水洗吸干
称取3份，每份0.5g
（2） 取3只三角瓶 编号 装入叶片
NO.1: 磷酸缓冲液 5ml ＋蒸馏水 5ml NO.2: 磷酸缓冲液 5ml ＋0.2M KNO3 5ml NO.3: 磷酸缓冲液 5ml ＋0.2M KNO3 5ml
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶（nitrate reductase）是峰莱斯郎（Pierre van Laerzem）和卡尔·诺顿·塞尔西格（Carl Norton Searcy）于1943年发现的一种负责将硝酸还原为亚硝酸的酶。
该酶在许多生物体中都很常见，包括细菌、真菌、植物和动物等。
硝酸还原酶在土壤中特别重要，因为它可以将植物的主要氮源硝酸盐还原为植物可以利用的亚硝酸盐。
本实验旨在测定硝酸还原酶活性，从而了解该酶在样本中的含量及其催化亚硝酸盐的能力。
下面将详细介绍实验步骤和结果。
实验步骤：1. 取样本：从实验样本中获取合适的样品，如土壤样品、植物组织等。
2. 制备样品提取液：将样品加入合适的缓冲液中（一般为磷酸盐缓冲液），并进行均匀混合。
3. 离心：离心样品提取液，以去除悬浮的杂质及固体颗粒。
4. 超声处理：用超声波仪器对样品进行超声处理，破坏细胞结构，释放出硝酸还原酶。
5. 萃取：将样品提取液进行适度的萃取，以得到含有硝酸还原酶的萃取液。
6. 酶活性分析：将萃取液与适量的硝酸盐和辅助酶（如辅酶、酶辅酶等）混合，并在适合的温度和pH条件下孵育，一段时间后停止反应。
7. 颜色反应：使用格里希法或其他适当的方法，在反应停止后通过颜色反应测定亚硝酸盐的生成量。
亚硝酸盐的浓度与硝酸还原酶活性成正比。
8. 计算硝酸还原酶活性：根据样品的反应结果和标准曲线，计算出硝酸还原酶的活性。
实验结果：实验结果应包括标本中硝酸还原酶的活性以及对照组的活性值。
通常，对照组是以无酶萃取物为基准进行分析。
硝酸还原酶活性的测定单位为μmol/min/g（或μmol/h/g）。
讨论和结论：根据实验结果，可以比较不同样本之间的硝酸还原酶活性。
较高的活性值表明样本中含有较高水平的硝酸还原酶。
这可以用来评估土壤氮素转化能力、植物对硝酸盐的吸收能力等。
同时，本实验的成功与否也与实验流程相连。
在实验中，合适的采样技术、样品提取和超声处理等步骤对保证提取液中酶的完整性和活性至关重要。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告一、实验目的硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中的关键酶之一，其活性的高低与植物氮素利用效率密切相关。
本实验旨在掌握硝酸还原酶活性的测定方法，了解不同植物材料或不同处理条件下硝酸还原酶活性的差异，为进一步研究植物氮代谢机制和氮素营养调控提供依据。
二、实验原理硝酸还原酶能够催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。
在一定条件下，产生的亚硝酸盐量与硝酸还原酶活性成正比。
通过测定反应体系中亚硝酸盐的含量，可以间接反映硝酸还原酶的活性。
本实验采用磺胺比色法测定亚硝酸盐含量。
在酸性条件下，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，生成重氮盐，再与 N（1-萘基）乙二胺盐酸盐（NED）偶联，形成红色偶氮化合物。
该化合物在 540nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与亚硝酸盐含量成正比。
三、实验材料、仪器与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片，如小麦、玉米、大豆等。
2、仪器分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、研钵、容量瓶、刻度试管等。
3、试剂（1）01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液；（2）02mol/L KNO₃溶液；（3）1%磺胺溶液（磺胺溶于 30%乙酸中）；（4）002% N（1-萘基）乙二胺盐酸盐溶液（NED）；（5）5μg/mL 亚硝酸钠标准溶液。
四、实验步骤1、酶液提取称取新鲜植物叶片 05g，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系设置取两支刻度试管，分别标记为对照管（CK）和测定管（T）。
对照管：加入 1mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
测定管：加入 1mL 酶提取液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
将两支试管置于 30℃恒温水浴锅中保温 30min。
3、终止反应保温结束后，向对照管和测定管中分别加入 1mL 磺胺溶液和 1mL NED 溶液，摇匀，以终止反应。
硝酸还原酶活性的测定
赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。
红色的偶氮染料。
反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。
增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。
这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。
仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。
0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。
磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。
α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。
然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。
操作步骤1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g （或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L 磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。
然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。
活体法测定植物硝酸还原酶活性[整理文档]
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活体法测定植物硝酸还原酶活性一、试剂1、亚硝酸钠标准液：称取分析纯NaNO20.1000g溶于水，然后用蒸馏水定容至100ml然后吸取5ml上述溶液，定容到1000ml，即为每ml含NaNO25ｕg 的标准液。
2、0.1mol/L的磷酸缓冲液：称取K2HPO419.24g,KH2PO42.2g，用水溶解后，用蒸馏水定容到1000ml。
3、1%的磺胺：1.0g磺胺溶于25ml浓HCL中，用蒸馏水定容到100ml。
4、0.2%的α-萘胺：称取0.2g萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容到100ml。
5、30%的三氯乙酸：75.0g三氯乙酸定容到250ml6、KNO3(0.1mol/L)异丙醇（1%V/V）磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称取3.03gKNO3溶于300ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。
二、步骤1、标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表加试剂，即配成系列标准液，摇匀后在30℃保温箱中或水浴中保温30分钟，然后在540nm比色，以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标。
试管编号标准液00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.40磺胺4444萘胺4444每管含00.20.40.81.21.62.0NO2-2、测定（1）取样：取叶片，用水洗净，再用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干，剪碎混匀，称取0.5g，放入试管。
（2）反应：加混合液9ml，其中一管加1ml三氯乙酸做对照，放入真空泵中反复抽气，直至叶片沉至管底，将各试管置于30℃暗处保温30分钟，分别加1ml三氯乙酸，摇匀终止酶反应。
（3）比色：静置2分钟，然后吸取上清液2ml，加4ml磺胺试剂，4ml萘胺试剂，摇匀后静置30分钟，然后在540nm处比色。
三、计算样品中酶活性（μg·g-1·h-1）=C×V1/V2W×tC——反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg ）由曲线查得V1——提取酶液时加入的混合液体积（ml）V2——酶反应时加入的粗酶液体积（ml）W——样品重t——反应时间（h）。
植物硝酸还原酶(NR)活力测定(活体法)
植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以Nμg·g-1·h-1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好二、仪器与用具分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、试剂1. 亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO2 5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取10.0g加入250ml浓HCl中，用蒸馏水定容至1000ml。
4. 0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取2.0gα-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至1000ml。
5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称10.10g KNO3溶于1000ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀。
四、方法1. 标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶是一种重要的酶，参与植物的氮代谢和植物的抗逆能力等生理过程。
硝酸还原酶的活性可以反映出植物对外界环境变化的适应能力和生长发育状态。
因此，硝酸还原酶活性的测定具有重要的生物学意义。
一、实验目的本实验主要目的是通过测定植物中硝酸还原酶活性的变化，探究外界环境对硝酸还原酶活性的影响。
另外，本实验还旨在掌握硝酸还原酶活性的检测方法。
二、实验原理硝酸还原酶 (NR) 是一种能将 NO3- 还原为 NO2- 的酶。
其催化反应的速率与硝酸还原酶的活性密切相关。
因此，硝酸还原酶活性的测定，是利用一定体系中 NO3- 还原成NO2- 的速率或反应产物的含量，来评价細胞內硝酸还原酶活性大小的一种生化方法。
实验中通常采用光度法来测定硝酸还原酶的活性。
光度法是将产生的 NO2- 与苯磺酸二苯胺 ( sulfanilamide) 反应生成硝基苯偶氮苯磺酸 (N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride，NED) ，然后用紫外可见分光光度计测定产生的吸光度。
三、实验步骤3.1 实验前准备1）制备显色液：将 1g 苯磺酸二苯胺和 0.02 g NED 加入 10mL 硫酸中，用水稀释至100 mL 。
2）制备反应液：在无氧条件下，将浓硝酸滴入 50mL 去离子水中，制备100μM 硝酸钾溶液。
3）制备酶提取液：将新鲜植物组织（如叶片、幼芽等）用磨汁机研磨成细胞浆，加入0.05M 磷酸盐缓冲液 (PH=7.5) 中，按 1：5 的比例(即 1g 组织加 5mL 缓冲液) 收集悬液，离心 15 分钟，将上清液称取至 1mL，即为酶提取液。
3.2 检测方法1）在96孔板中加入100μL 酶提取液，40℃孵育20分钟。
2）加入100 μL 反应液，制备最终反应物质的浓度应为：10mM NaNO3、2mM Na2S2O4、0.05M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.5)。
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硝酸盐的还原
硝酸盐
硝酸还原酶
亚硝 酸盐
亚硝酸还原酶
氨
硝酸还原酶是一种诱导酶，在植物体内本来 不含有，但在特定外来物质的如NO3-诱导下 可以生成硝酸还原酶。
【实验原理】
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它 催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐： NO3- +NADH + H+ NR NO2- +NAD+ +H2O 产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰 胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量 生成红色偶氮化合物。
【实验器材】
⑴冷冻离心机；⑵分光光度计；⑶天平 (0.01g)；⑷冰箱；⑸恒温水浴；⑹研钵； ⑺剪刀；⑻离心管；⑼移液管(5、2、 1mL) ；⑽洗耳球；⑾试管架；(12)胶头滴 管。
【实验步骤】
标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺 序加入试剂，配成0-0.20µg/mL的系列标准亚 硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然 后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度 （µg/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标 （r）建立回归方程。
管号
1234567
试剂 取量 mL
亚硝酸钠标准液 蒸馏水 1% 磺胺
0.2%萘基乙烯胺
0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 2222222 2222222
每管亚硝态氮浓度µg/mL 0 0.02 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20
【注意事项】
硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操 作应迅速，并且在4℃下进行。
制作标准曲线时，从显色到比色时间尽可 能保持一致，显色时间过长或过短对颜色 都有影响。
【思考与作业】
比色测定前加入磺胺和萘基乙烯胺的顺序 不能颠倒的原因是什么？
谢谢
酶的提取 称取0.5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎
置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中， 洗研钵2-3次，将液体转入离心管中，共用提取液6 mL，4℃ 8000rpm离 心15min，上清液即为粗酶提取液。
酶反应 取4个10 mL离心管，按照下表所列进行操作，混匀，25℃保
温30min。
反应底物 酶反应管
粗酶液/mL 0.1mol/LKNO3 磷 酸缓冲液/mL
非诱导－对照
1.0
1.6
非诱导－实验
1.0
1.6
诱导－对照
1.0
1.6
诱导－实验
1.0
1.6
NADH 溶 液/mL 0 0.2 0 0.2
0.1mol/L pH7.5 磷酸缓冲液/mL
0.2 0 0.2 0
终止反应和比色测定 30min后立即加入l mL磺胺溶液终止酶反
应，再加l mL萘基乙烯胺溶液，显色30min后于4000rpm离心5min，取上 清液在540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度 （µg/mL ）。
【结果计算】
样品中酶活性（µg ·g-1·h-1）=
X * V3 / V2 * V1 W*t
X ——反应液酶催化产生的亚硝态氮浓度（µg/mL）； V1——提取酶时加入的提取缓冲液体积（mL）； V2——酶反应时加入的粗酶液体积（mL）； V3——与磺胺等发生颜色反应的总体积（mL）； W ——样品质量（g）； t ——反应时间（h）。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰， 可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由 产生的亚硝态氮的量表示。一般以单位时间 内每克鲜重含氮量表示，即以µg/g/h为单位。 NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步 骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂， 但重复性较好。
【实验材料】
小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组）