一种新的微卫星PAGE显带方法

一种新的微卫星PAGE显带方法刘梦培1，田敏2，傅大立1*，傅建敏1，王彩霞2（1.国家林业局泡桐研究开发中心，河南郑州 450003；2.中国林科院亚热带林业研究所，浙江富阳 311400）摘要：文章提出了微卫星PAGE荧光染料显带法，并将其与琼脂糖凝胶荧光染料显带法与PAGE银染显带法进行了对比，结果发现该法分辨率高、快速高效、简单易行、背景清晰、兼具后两种方法的优点，是一种成功的DNA显带技术。

关键词：微卫星DNA；聚丙烯酰胺凝胶电泳；荧光染料显影；银染A new method of microsatellite PAGE bandingLIU Meng-pei1，TIAN Min2，FU Da-li1*，FU Jian-min1，WANG Cai-xia2（1.Non-timber Forestry Research and Development Center ，CAF，Zhengzhou 450003，Henan，China；2. Research Institute 0f Subtr0pical Forestry，CAF，Fuyang 311400，Zhejiang，China ）Abstract: This paper proposes microsatellite PAGE fluorescent imaging method, compared with agarose gel fluorescent imaging method and PAGE silver staining method , The results showed that the method of high resolution, fast, efficient, simple clear background, both the advantages of the latter two methods, is a successful DNA banding.Key words: microsatellite DNA；PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)；Fluorescent imaging；silver staining微卫星DNA又称简单序列重复（simple sequence repeats，SSR )，是由1-6个碱基多次串联重复组成的核苷酸序列，在基因组间广泛分布，具有共显性、重复性好、多态性高、扩增结果稳定、检测手段简便易行等优点[1]，成功应用在物种的遗传多样性（genetic diversity）[2、3]、遗传图谱构建（genetic mapping）[4、5]、系谱分析（Pedigree analysis）[6、7]、遗传育种（Genetics and Breeding）[8、9]等方面。

微卫星DNA条带的鉴别常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）银染法，PAGE由Raymends和Weintraub 1959年创建，具有不易扩散、灵敏度高、分辨率高等优点[10]。

银染技术是其常用的显影方法，常用的有Bassam银染法[11]、Sanguinetti银染法以及在其基础上改良的一系列银染法，但银染法缺陷是步骤繁琐、耗时长、背景模糊、条带不清等，极易造成DNA 条带错判，从而产生分析误差。

许多研究者针对这些问题做了大量研究，但只能达到改良的效果，并不能从根本上解决问题。

本研究提出了微卫星PAGE的荧光染料显影法，试图从一个新的思路解决PAGE显带的问题。

1 材料和方法1.1 材料1杏属不同品种幼嫩叶片；SSR引物UDP98-405，正向引物序列：5′-ACGTGATGAACTGACACCCA-3′，反向引物序列：5′-CCTACCGTCTCGTTTCTGAG-3′；GelRed核酸荧光染料。

1 基金项目：国家十一五科技支撑项目资助（2006BAD01A1703-2）作者简介：刘梦培（1984—），女，中国林业科学研究院硕士研究生，研究方向：林木遗传育种。

Email：mengpei0402@＊通讯作者：傅大立，男，博士，中国林业科学研究院研究员，从事林木种质资源与遗传育种研究1.2 PCR反应体系和程序PCR反应体系总体积20μL，其中10×PCR Buffer 2.0μL、25mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTPs MiX 0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL、DNA模板0.5μL、ddH2O 14.6μL。

PCR反应在Bio-Rad C1000T M Thermal Cycler型号的扩增仪上进行。

ISSR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

试验于中国林科院亚热带林业研究所植物细胞工程实验室内完成。

1.3琼脂糖凝胶电泳显带PCR产物在浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上分离。

核酸荧光染料采用GelRed ，采用前染的方法，GelRed 核酸荧光染料加到溴酚蓝上样缓冲液中，4μL PCR产物与2μL含有gelred的溴酚蓝上样缓冲液PCR管中混合均匀，取3μL上样，80V电压下电泳1.5h。

电泳结束后，直接放入上海FR-200A全自动紫外与可见分析装置拍照和分析。

剩余PCR 产物等分2管，分别进行改良PAGE银染法和PAGE荧光染料显影法试验。

1.4 改良的微卫星PAGE凝胶银染法显带PCR产物在8%（29:1）聚丙烯酰胺凝胶上分离，胶片大小为195mm（长）x120mm（宽）x1mm（厚），8μLPCR产物与2μL溴酚蓝上样缓冲液在PCR管中混合均匀，取3μL上样，120V 电压下电泳3h。

电泳结束后，自来水冲洗玻璃板双面，预冷，剥下凝胶，固定液（0.5%冰醋酸、10%无水乙醇）中固定20min，ddH2O洗涤2次，银染液（0.15%硝酸银）中渗透15min，ddH2O洗涤2次，显影液(1.5%氢氧化钠、1%甲醛)中显影10-15min，直至出现清晰的DNA条带为止，显影后立刻用ddH2O洗涤1次，全自动紫外与可见分析装置拍照和分析。

1.5 PAGE凝胶荧光染料显影法显带凝胶配制同1.4，核酸荧光染料采用GelRed ，同琼脂糖凝胶电泳前染方法一样， 8μL PCR 产物与2μL含有gelred的溴酚蓝上样缓冲液PCR管中混合均匀，取3μL上样，120V电压下电泳3h。

电泳结束后，自来水冲洗玻璃板双面，预冷，剥下凝胶，清水冲洗后，直接放入全自动紫外与可见分析装置拍照和分析。

2 结果与分析2.1 琼脂糖凝胶电泳法图1琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig. 1 Results of agarose gel electrophoresis test1-66分别代表杏属的66个品种。

琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，目的条带清晰明亮，大小在100bp左右，无非特异性扩增条带。

由于琼脂糖凝胶电泳分辨率低，只能区分约相差100bp的DNA片段，所以琼脂糖凝胶电泳结果只能显示出一条清晰的目的条带，无法判定品种间差异。

2.2 改良的微卫星PAGE银染法银染结果如图2所示，图片背景、分辨率、目的条带相对清晰，指纹图谱可以有效进行鉴定品种间差异。

但由于银染步骤繁琐，固定、银染、显影时间难以掌握，部分物种仍出现染色深、背景模糊的现象，如品种1、5、42、53、54的指纹图谱，也出现主带跟非特异性条带区分不明显的现象，如品种29、33、46、51、56、57的指纹图谱。

图2改良银染方法显影结果Fig. 2 Results of improved silver-stained method2.3 PAGE凝胶荧光染料显影法PAGE凝胶荧光染料显色结果如图4，我们可以看出，每一品种显色的条带同银染结果完全一致，并且图片背景、分辨率、目的条带清晰度比PAGE凝胶银染图片更高，甚至那些微弱的非特异性条带同银染结果也完全一致，但这种染色方法主带与非特异性条带区分更加明显。

关键是PAGE凝胶荧光染料显色法简单易行，不会出现时间控制不好导致染色深或染色失败的现象。

图3 凝胶荧光染料法显影结果Fig. 3 Results of gel fluorescent imaging method3讨论DNA显带通常使用的技术有Southern杂交、琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳[13]。

Southern 杂交存在使用放射性同位素具有放射性污染的缺陷，很少被人使用。

琼脂糖凝胶电泳可快速分别、纯化和判定DNA，但其分辨率低，无法区分微卫星DNA条带。

本文研究结果也正好说明了这一点。

聚丙烯酰胺凝胶电泳因其分辨率高（理论上可以分开长度相差0.1%的DNA分子），以银染技术代替同位素放射技术而独占优势，在微卫星分子标记分析方面应用广泛。

但其银染技术有步骤繁琐、耗时长、显色时间不易控制、背景模糊等缺陷，普通的银染技术需要2-3h，本实验采用改良的银染技术也需要30min-60min。

相比之下，PAGE荧光染料显带法独具优势，既具有琼脂糖凝胶电泳快速分别、纯化和判定DNA的优点，又具有PAGE分辨率高的优点，简单易行，快速高效，是一种值得推广的显带技术。

近些年关于银染技术的改良进行了大量研究，关海涛等[14]比较了Bassam和银染法Sanguinett银染法显影效果；梁宏伟等[15]对缩短银染时间进行了研究；杜爽等[15]对聚丙烯酰胺凝胶的种类、浓度及其银染方法进行了优化；许丽等[16]对银染温度和显色温度进行了研究。

但PAGE原理是利用银离子和核苷酸结合，在碱性环境下甲醛能使阴离子还原从而使凝胶中的DNA得以显现。

所以不可能避免步骤繁琐、背景不清晰、甲醛危害等这些问题。

另外操作过程中，银染后漂洗过度可能造成DNA带不清晰或无带，AgNO3浓度高、银染时间长、银染后漂洗时间短、显色时间长有可能造成凝胶背景发黄、颜色过深，摇晃不均匀又可能造成显影不均匀等等，这些问题是银染技术很难避免的缺陷。

琼脂糖电泳能快速分离、纯化和判定DNA，优势在于核酸荧光染料的利用，如EB、SYBR 系列染料、UltraPower核酸染料、GelRed和GelGreen等，原理是荧光染料以非共价键的方式与DNA/RNA结合，在紫外线的照射下发出明亮的橙色荧光，达到DNA条带显示。

利用相同的原理，在PAGE凝胶中使用核酸荧光染料，同样可达到高分辨率、快速判定DNA的目的。

而这一方法至今没人采用。

张玉魁等[17]认为EB毒性大，PAGE会淬灭EB的荧光，使EB检测的灵敏度降低。