SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

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SDS-PAGE电泳实验步骤

SDS-PAGE电泳实验步骤垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋⽩质⼀、实验⽬的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋⽩质的分⼦量的原理和基本操作技术。

⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质，在⼀定的pH条件下解离⽽带电荷。

当溶液的pH⼤于蛋⽩质的等电点(pI)时，蛋⽩质本⾝带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH⼩于蛋⽩质的等电点时，蛋⽩质带正电，在电场中将向负极移动；蛋⽩质在特定电场中移动的速度取决于其本⾝所带的净电荷的多少、蛋⽩质颗粒的⼤⼩和分⼦形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由⼀定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合⽽成的三维⽹状孔结构。

本实验采⽤不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺⽤量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分⼦量的蛋⽩质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同⽽表现出不同的迁移率。

由于上层胶的孔径较⼤，不同⼤⼩的蛋⽩质分⼦在通过⼤孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进⼊⼩孔胶时，分⼦量⼤的蛋⽩质移动速度减慢，因⽽在两层凝胶的界⾯处，样品被压缩成很窄的区带。

这就是常说的浓缩效应和分⼦筛效应。

同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采⽤两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris⽤于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离⼦；CI-是前导离⼦。

在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离⼦，⽽在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离⼦的解离度，进⽽达到控制其有效迁移率之⽬的。

不同蛋⽩质具有不同的等电点，在进⼊分离胶后，各种蛋⽩质由于所带的静电荷不同，⽽有不同的迁移率。

由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分⼦筛效应及电荷效应，使不同的蛋⽩质在同⼀电场中达到有效的分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加⼊⼀定浓度的⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有⼤量的负电荷，且这种阴离⼦表⾯活性剂能使蛋⽩质变性，特别是在强还原剂如巯基⼄醇存在下，蛋⽩质分⼦内的⼆硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋⽩质分⼦与SDS充分结合，形成带负电性的蛋⽩质—SDS复合物；此时，蛋⽩质分⼦上所带的负电荷量远远超过蛋⽩质分⼦原有的电荷量，掩盖了不同蛋⽩质间所带电荷上的差异。

SDS-PAGE电泳的基础原理和试验步骤

SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤概述十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。

此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。

在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。

SDS-PAGE作用机理蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理（上样缓冲液）。

即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。

SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-（CH2）10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。

电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。

当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。

样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。

电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8的上层，pH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。

出现了pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯>Pro¯>—COO¯。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量

02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂，加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术，如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分子量的标准蛋白，可以大致测定出待测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成反比，因此可以通过计算待测蛋白与标准蛋白的相对迁移率来推算其分子量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基本结构。
移液器
精确添加试剂和溶液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。

许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。

电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

电泳过程必须在一种支持介质中进行。

最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。

但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。

凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。

最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。

蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。

“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。

这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。

在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。

可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术。

它基于分子的电荷与分子的质量之间的相互作用，通过电场驱动，将蛋白质样品分离成不同的带状条带。

该方法的工作原理可分为以下几个步骤：
1. 样品制备：将待分离的蛋白质样品与sds（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质样品在含有还原剂的缓冲液中发生变性并且呈带负电荷的复合物。

2. 样品加载：将样品加载到预制的聚丙烯酰胺凝胶槽中的样品孔中。

通过上下两个电极施加电压使样品向凝胶孔移动。

3. 分离：当电压施加后，带电的蛋白质复合物将根据其质量和电荷大小在凝胶中移动。

较小的蛋白质在电场作用下通过凝胶孔移动更快，而较大的蛋白质移动较慢。

4. 染色：在分离完成后，经过染色处理使分离出的蛋白质带呈现出可视化的条带。

常用的染色方法包括银染、共染和荧光染色等。

通过观察得到的条带模式，可以确定蛋白质的分子质量和其含量。

这种方法比较简单、经济且广泛应用于蛋白质研究领域。

《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。

本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。

1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。

2.试剂（1）水。

（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。

（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。

（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。

（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。

（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。

建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。

（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。

（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。

（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。

实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白

4、点样
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA），进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路）提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上，再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM）半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤

B. 考马斯亮蓝检测灵敏度为0.3-1 ug/蛋白带。
C. 银染检测灵敏度高100-1000倍。
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1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul
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2. 浓缩胶制备的方法
(1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液 0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10 ％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后，立即灌胶。
(2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中，然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完全后即可拔去梳子，准备电泳。
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二、试剂
A. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存于棕色瓶中，于4℃保存。
B. 4X分离胶缓冲液称取Tris 18．17g，加入10%SDS贮备液 4ml，用12mol/L HCl调pH至8，8，定容至100ml。
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3. 样品制备及电泳
(1). 样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf 管中，将混合物置于95-100℃加热5分钟，立即置于冰上，或于-20℃储存，以便再次分析时使用。
(2). 上样：样品制备好以后，即可上样电泳。先将样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验的需要加样电泳。
C. 4X浓缩胶缓冲液称取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用 l2mol/L HCI调pH至6．8，定容至100ml。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中.SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比.在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。

蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml):0。

6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周,或在－20℃保存数月。

2。

凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0。

8g，加重蒸水溶解后,定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月.3。

pH8。

9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8。

9，定容至100ml，4℃保存。

4。

pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH6。

7，定容至100ml，4℃保存.5。

TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8。

3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7。

5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。

器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul)在一个Eppendorf 管中混合。

SDSPAGE原理和流程操作步骤详解

SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（三）凝胶浓度的选择由于SDS电泳分离并不取决于蛋白
质的电荷密度，只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。
不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
三、方法 1、分类（1）根据对样品的处理方式的不同
还原SDS电泳非还原SDS电泳带有烷基化作用的还原SDS电泳
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳垂直电泳
平板电泳水平电泳
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（3）二硫键是否完全被还原当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（二）缓冲系统的选择一般情况下，在被分析的蛋白质稳
定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的
蛋白带迁移距离固定前的凝胶长度 Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝胶长度溴酚蓝迁移距离
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
2、作图以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标准曲线上读出他的分子量

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。

当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。

由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。

这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。

同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。

8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。

在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。

不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。

SDS-PAGE原理、方法详解

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

配制方法：原液使用。

应使用电泳级TEMED。

（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。

用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。

丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。

丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量时必须戴手套和面具。

）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。

配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。

4℃保存。

（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。

配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。

2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。

SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。

引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。

化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。

采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。

因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验八
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
一、பைடு நூலகம்的要求
1.学习电泳原理和技术
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原
理和操作方法
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联
剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8 ，AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
TEMED(加速剂)
Acr(单体)+Bis(交联剂)
AP(催化剂)
凝胶
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致） PAGE同时还具有浓缩效应与体系的不连续性。
四、操作步骤
固定玻板
制备分离胶制备浓缩胶加样电泳
染色和脱色
1.安装夹心式垂直板电泳槽
安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框
交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有气泡。
2、配制凝胶
7.5%分离胶（10ml） DDW 30%Acr-Bis 4.85 2.5 3%浓缩胶（5ml） 3.16 0.5
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。
将楔子插进，将底部插紧

插入梳子
加缓冲液
加样
电泳
剥胶
五、实验结果

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDSSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量
一,实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电掌握泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE , )的工作原理和操作方法
二,实验原理不同蛋白质具有不同的分子量, 不同蛋白质具有不同的分子量,并在一定的pH溶液中带有不同的电荷溶液中带有不同的电荷. 一定的溶液中带有不同的电荷.但经过SDS处理后的蛋白质,分子表面处理后的蛋白质, 经过处理后的蛋白质完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷的性质无关. 大小而与其所带电荷的性质无关.
6. 上样:将样品梳拔出,用电极缓冲液上样:将样品梳拔出, 冲洗样品孔. 冲洗样品孔.样品与样品缓冲液按一定比例混合好. 定比例混合好.用微量注射器加入加样孔,加样量为20l. 样孔,加样量为 . 7.电泳:100V恒压电泳至溴酚蓝指示剂达电泳: 电泳恒压电泳至溴酚蓝指示剂达到浓缩胶和分离胶界面, 到浓缩胶和分离胶界面,然后调电压至120V,再恒压电泳,约1.5 h,待染 ,再恒压电泳, , 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 停止电泳.取下胶板, 停止电泳.取下胶板,将胶片置于白瓷盘内. 瓷盘内.
4. 制备浓缩胶:待胶凝固后(胶与水之间有制备浓缩胶:待胶凝固后( 一清晰界面), 将水倒掉, 一清晰界面), 将水倒掉,用ddH2O冲冲洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 倒入浓缩胶插好样品梳, 倒入浓缩胶插好样品梳,注意避免气泡滞留在梳子与胶液的界面, 放置约15 留在梳子与胶液的界面,30 ℃放置约 min,直至使浓缩胶凝固. ,直至使浓缩胶凝固. 5. 电泳:将胶模装好,去胶条后,装入电泳电泳:将胶模装好,去胶条后, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板矮板在内). (矮板在内).

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE实验原理和操作步骤

S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳S D S P A G E实验原理和操作步骤The pony was revised in January 2021SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。

蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

SDSPAGE原理和流程操作步骤详解

SDSPAGE原理和流程操作步骤详解SDS-（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种电泳技术，用于分离蛋白质。

它是目前最常用的蛋白质分离方法之一、以下将详细介绍SDS-的原理和操作步骤。

一、原理SDS-利用凝胶电泳原理，在电场作用下，将蛋白质按照其分子量大小分离。

其中SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是一种阴离子表面活性剂，它会使蛋白质解离成单个多聚体，并赋予了所有蛋白质相同的电荷密度，使其仅以分子量来分离。

此外，SDS还能够疏水化蛋白质，使其保持线性构象。

二、流程操作步骤1.制备凝胶：a.准备获得所需蛋白质分子量范围内的分离凝胶（通常为8-20%)和浓缩凝胶（通常为4%）。

b.根据实验需要，自制聚丙烯酰胺凝胶，或购买预铸凝胶片。

c. 使用缓冲液（常见的是Tris-HCl缓冲液）将凝胶片激活。

d.将激活的凝胶放在垂直电泳仓中，然后在最上层加入新鲜的蒽胺溶液以形成平整的上胶液面。

2.蛋白质样品处理：a. 将样品蛋白质进行还原处理，可以使用还原剂如β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）或二巯基甘油（dithiothreitol）。

b.加入相应体积的SDS缓冲液（含有SDS和甘油），将样品加热至100°C，以使其完全变性。

c.在样品中加入跟踪染色剂，常用的有溴酚蓝。

3.加载样品：a.打开电泳仓的盖子并插入试验板。

b.将样品架（通常是细长的注射器或者微量吸管）插入样品孔中，并缓慢地向内注入样品。

c.尽量确保样品的数量均匀，然后小心地将试验板放入电泳槽中。

4.电泳：a. 确保试验板完全浸没在含有缓冲液（如Tris-Glycine缓冲液）的电泳槽中。

b.调整电泳仓的参数，如电流和电压。

c.开启电源，运行电泳，直到跟踪染色剂移动到凝胶底部。

5.凝胶染色和成像：a.将凝胶从电泳槽中取出，并进行染色。

sds-page原理

sds-page原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离
和纯化技术。

其原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子量成反比的特性。

首先，将待测蛋白质样品经过还原剂（如巯基乙醇）和SDS （十二烷基硫酸钠）处理，使蛋白质在溶液中全部变成带负电荷的复合物。

SDS具有两个主要功能：一是在蛋白质分子表
面均匀地吸附SDS分子，使蛋白质带有大量负电荷；二是通
过SDS分子的疏水尾部与蛋白质间的相互作用，使蛋白质变
为线性构象。

然后，将经过处理的样品加入含有聚丙烯酰胺的凝胶电泳胶质中。

聚丙烯酰胺经过电极电解质反应形成网状物质，构成凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶可以形成一系列孔隙，这些孔隙可以按照分子量的大小分离蛋白质。

在电泳进行时，电场的作用下，带负电的蛋白质复合物会向着电极迁移，迁移的速度与蛋白质分子量成反比。

较小分子量的蛋白质移动速度相对较快，而较大分子量的蛋白质移动速度相对较慢。

因此，蛋白质在凝胶中的分离程度与其分子量有关。

在电泳完成后，可以通过染色（如银染、荧光染等）或利用特定的蛋白质探针（如抗体或荧光标记探针）来检测和可视化分离的蛋白质。

然后，可以根据蛋白质的迁移距离和已知分子量蛋白质的迁移距离之间的关系推断待测蛋白质的分子量。

总之，SDS-PAGE通过利用电场迁移速度与蛋白质分子量之间的关系，实现了对蛋白质样品的分离与纯化。

它是一种简便、快速且广泛应用的分析方法，在生物学和生物化学领域中具有重要作用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理及步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的要求（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。

原理SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。

用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。

在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。

因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。

SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。

这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。

Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。

但在具有自由基团体系时，它们聚合。

引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。

化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。

在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。

TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。

这些因素在实际操作时都应予以控制。

光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。