SDSPAGE原理步骤详细介绍含图片
SDS-PAGE超详细实验步骤
SDS-PAGE超详细实验步骤1定义SDS-PAGE：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中SDS为十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate），PAGE为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electropheresis）；该电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。
1.1试验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质的静电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
1.2试验相关设备与试剂配制1.2.1相关设备(1)电泳仪(2)凝胶成像仪(3)干浴器(4)微型离心机(5)电泳槽1.2.2试剂配制(1)染色液：用量筒分别量取250ml甲醇或乙醇、80ml乙酸；用电子天平称取考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml蓝盖瓶中（加入顺序为考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸），用纯化水补足至1000ml，充分混合均匀后进行用滤纸过滤，收集滤液备用。
（当过滤速度变慢时及时更换滤纸，快速过完，不可隔夜以免影响染色效果）(2)脱色液：用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml纯化水加入烧杯中，待溶液混合均匀后加入蓝盖瓶中。
(3)1X电泳缓冲液：分别用量筒量取10X电泳缓冲液100ml、900ml纯化水加入烧杯中，混合均匀既得。
（注：以上甲醇、乙醇、乙酸均用分析级试剂，纯度>95.0%）1.3电泳试验步骤1.3.1电泳胶配制（配方如表1）：表1分离胶浓度(10ml) 6%(ml) 8%(ml) 10%(ml) 12%(ml) 15%(ml) 去离子水 5.4 4.7 4.1 3.4 2.4 30%Acrylamide mix 2.0 2.7 3.3 4.0 5.04X Resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.110%APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1TEMED 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 表2堆积胶(ml) (ml)去离子水 6.930%Acrylamide mix 1.78X Stacking-gel buffer 1.2510%SDS 0.110%APS 0.1TEMED 0.01按照表1配方将所需浓度的分离胶配置好（加入顺序由上到下），加入到电泳胶配胶板中（约3/4配胶版高度），加入5mm高的纯化水，等待30-60min使分离胶凝固（可微微倾斜看胶面是否凝固聚合）。
sdspage分离蛋白质原理
sdspage分离蛋白质原理
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离技术，其原理基于聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS（十二烷基硫酸钠）的作用。
首先，将待分离的蛋白质样品加入SDS溶液中，SDS可以与
蛋白质发生非共价键结合，使蛋白质的电荷变得均匀，且带有负电荷。
这样，蛋白质在电场作用下会向阳极迁移。
接下来，将试样加载到聚丙烯酰胺凝胶孔中，聚丙烯酰胺凝胶中存在着连续的网络结构，该网络由交联的聚丙烯酰胺聚合物构成。
蛋白质在电场作用下会通过孔道中的凝胶网络逐渐迁移，迁移速度取决于其分子量，分子量较大的蛋白质迁移速度较慢，分子量较小的蛋白质迁移速度较快。
最后，当电泳进行一段时间后，蛋白质样品会在凝胶中分离成多个带状区域，每个带状区域代表了一种或多种分子量相近的蛋白质。
为了可视化蛋白质，可以通过染色或免疫检测方法进行进一步分析。
总结起来，SDS-PAGE通过使用SDS使蛋白质带有负电荷，
然后在聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据蛋白质分子量的差异来分离蛋白质。
这种技术广泛应用于蛋白质分析和分离，用于探索蛋白质结构和功能，以及研究蛋白质相互作用。
sds page原理
sds page原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它的原理基于蛋白质的电荷和分子质量差异。
SDS-PAGE的原理如下：
1. 蛋白质样品：将待分析的蛋白质样品在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液中加热处理，使蛋白质变性为线性形式，并与SDS以1:1的比例结合。
SDS 能够给蛋白质提供一个负电荷，使蛋白质呈均一的负电荷比例。
2. 准备Gel：制备一个由聚丙烯酰胺和交联剂组成的Gel胶。
在聚丙烯酰胺中添加过氧化物，使其发生聚合反应。
这样形成了一系列大小孔隙的网状结构。
3. Gel电泳：将含有SDS的蛋白质样品通过吸附在Gel上的孔隙中。
加上直流电压，在电场作用下，蛋白质会随着电泳迁移。
负电荷较多的蛋白质迁移较快，负电荷较少的蛋白质迁移较慢，从而实现了蛋白质的分离。
4. 染色和可视化：经过电泳分离后，使用染色剂（如Coomassie蓝）对蛋白质进行染色，目的是使蛋白质能够在胶上可视化。
通过比较样品和标记的分子量标准品的黑色条带，可以测量和估算待测蛋白质的分子量。
总结：SDS-PAGE通过对蛋白质样品中的蛋白质进行处理和分离，使其呈现出
电荷和分子质量的差异性。
这一方法在蛋白质的分子量分析、鉴定和纯化过程中被广泛应用。
SDSPAGE-原理和方法
1
样品制备
将蛋白质样品加入SDS洗涤溶液，并
凝胶制备
2
加热变性。
制备聚丙烯酰胺凝胶，并加入
TEMED和过硫酸铵。
3
电泳
将样品加载到凝胶槽中，施加电场进 行电泳分离。
SDSPAGE的实验材料和仪器
材料
SDS洗涤溶液、聚丙烯酰胺凝胶、TEMED、 过硫酸铵等。
仪器
电泳槽、电源、显色剂。
SDSPAGE的优缺点
优点
简单易行、灵敏度高、分辨率好。
缺点
只适用于单一参数（分子质量）的分离。
结论和展望
SDSPAGE作为一种常用蛋白质分离技术，具有广泛的应用前景。未来的发展 方向是提高分辨率、扩大分离范围、提高自动化程度。
SDSPAGE的数据分析和结果解 释
通过比较不同样品的蛋白条带迁移距离、形状和密度，可以判断蛋白质的分 子质量、纯度和含量。
SDSPAGE的应用领域和意义
1 生物医学研究
用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用。
2 医学诊断
3 生物工程
用于检测蛋白质异常，如肿瘤标志物的检测。
用于蛋白质表达、纯化和检测。
SDSPAGE-原理和方法
SDSPAGE是一种常用的蛋白质分离和定量技术，利用电泳原理将蛋白质按照 分子质量大小分离出来。本节将介绍SDSPAGE的原理、步骤和方法、实验材 料和仪器、数据分析和结果解释、应用领域和意义以及其优缺点。
SDSPAGE的定义和原理
SDSPAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种电泳技术，使用聚 丙烯酰胺凝胶和SDS洗涤溶液，以分子质量为基准将蛋白质分离和定量。
(新)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
样品制备：
蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相 对一致的非折叠衍生物。 四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品 和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟， 3000rpm离心数秒，每人取10ul加样。
电泳
连接电泳仪，选择电压为40伏，蓝色指示剂移动 至凝胶底部即停止电泳。 取出玻璃板，用保鲜膜包好，置冰箱待明日做蛋 白印渍（Western－Blotting）。
5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离 胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置 30分钟。 6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻 璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体， 插入斜楔板。 两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上 槽。 7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入 Tris－甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶 部，并赶走底层的气泡。
制备顺序为先灌制分离胶，然后在分离胶上灌制 浓缩胶： （四人一组） 1. 在两块玻璃板间夹以垫条，用手夹住玻璃板放入 电泳槽主体内，缺口朝外，再插入斜楔板。 2. 拿一小烧杯，按下表加入各试剂： （12％分离胶） 单体溶液 4ml 分离胶缓冲液（pH8.8） 2.5ml 超纯水 3.3ml 10％SDS 100ul 10％TEMED 30ul 10%过硫酸铵 70ul
3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间， 灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱 和异丁醇，静置约15分钟。 4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗 瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各 试剂： （4％浓缩胶） 单体溶液 0.4ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 0.38ml 超纯水 2.15ml 10％SDS 30ul 10％TEMED 15ul 10%过硫酸铵 30ul
SDS-PAGE 原理 步骤 详细介绍 含图片ppt课件
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3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
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（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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分离胶聚合之后
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不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度
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（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
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1
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在
SDS-PAGE原理及结果分析技巧ppt课件
电泳的应用
测定分子量
蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值 线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可 在标准曲线上求得其分子量。
注意：①SDS单体的浓度，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为 1:4或1:3； ②样品缓冲液的离子强度；③二硫键是否完全被还原，许多蛋白质是由 亚基或两条以上肽链组成的，这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的 分子量；④使用软件分析需要图片调正；⑤上样量少，条带越宽分析偏差（偏小） 越大。
不连续系统具有对样品的浓缩效应
• • • • pH值的不连续 缓冲液离子成分的不连续 电位梯度的不连续 凝胶浓度的不连续以及电压的不连续.
加样
—
浓缩胶
加电场， 样品浓缩 在界面上 (5%, pH6.8)
分离胶
(8-15%, pH8.8)Fra bibliotek电泳结束
+
电泳的应用
测定蛋白质分子量（亚基）；结合凝胶过滤层析 可用来测定蛋白质的分子量和聚合状态 分析纯度 测定蛋白质的含量 蛋白质水解分析 鉴定修饰（糖基化） 分离纯化 结合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别 蛋白质相互作用
PAGE 电泳原理
分子筛效应: 分子大小和形状 电荷效应：大部分的蛋白质在pH8.3电泳缓冲液的条件下
带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢
（强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散，并带上大量负电荷， 导致本身电荷差别消失，因此SDS-PAGE分离蛋白主要依 赖分子大小，而非电荷或形状）
SDS-PAGE原 理及结果分析 技巧
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。
SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。
2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。
通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。
3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。
较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。
4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。
通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。
总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。
sds-page
一、实验目的：1.1理解SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的基本原理。
1.2掌握分子电泳的基本步骤，掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。
二、实验内容和原理：2.1电泳（electrophoresis）：是指带电颗粒在电场中向着与它电性相反的电极移动的现象。
许多重要的生物分子都含有可电离基团（如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等），在非等电点条件下可解离成带有电荷分子，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。
可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。
2.2影响带电粒子在电场中泳动的因素：①生物分子的性质：待分离生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显影响。
②缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。
溶液pH值距离等电点愈远，生物分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。
当缓冲液pH大于等电点时，生物分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电点时，生物分子带正电荷，电泳时向负极移动。
③电场强度：电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。
一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。
但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。
降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物分子扩散增加，同样影响分离效果。
所以电泳实验中要选择适当的电场强度。
④电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。
由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。
这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。
当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。
sds-page原理
sds-page原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离和分析方法，其原理可以分为以下几个步骤：
1. 准备样品：将待分析的蛋白质样品溶解在含有SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（如二巯基乙醇）的缓冲液中。
SDS
可以使蛋白质变为带有负电荷的线性形式，并破坏蛋白质之间的非共价相互作用；还原剂可以断裂蛋白质之间的二硫键。
2. 准备凝胶：通常使用聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）作为凝胶材料，用于形成一个互联的三维网络结构。
通过改变凝胶的浓度和聚合物化学交联程度来调控凝胶的孔径大小。
3. 装配电泳装置：将经聚合的凝胶放置在电泳槽中，同时使凝胶与正、负极电极接触。
在前导缓冲液中加入迁移染色前蛋白样品。
4. 进行电泳：将电场通电，带电的蛋白质在电场力的作用下从凝胶上端迁移至下端。
由于SDS使蛋白质带有负电荷，所以蛋白质的迁移速率与其分子量反相关，分子量越大的蛋白质迁移速度越慢。
5. 染色和可视化：在电泳结束后，可以使用染色剂（如Coomassie蓝染剂）对蛋白质进行染色，可以直观地看到不同蛋白质的迁移情况。
还可以使用特异性的抗体进行免疫染色，以检测特定蛋白质的存在与否。
6. 分析和解释：通过测量蛋白质迁移距离和与已知分子量标准品的比较，可以确定待测蛋白质的相对分子量。
根据蛋白质在凝胶上的迁移位置，可以推测其可能的结构和功能。
总之，SDS-PAGE利用SDS破坏非共价相互作用，并使蛋白质带有负电荷，通过电场作用下的迁移速率差异，实现对蛋白质的分离和分析。
SDS-PAGE 原理 步骤 详细介绍 含图片ppt课件
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二、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate
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三、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同
3
一、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离
子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基 的电泳迁移率主要取决于亚基分子量 的大小，而电荷因素可以被忽略
4
1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
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2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal） 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂
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（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
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3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线 形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部 分冷却不好
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（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引
起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的 “三明治”底部有气泡或靠近隔片的 凝胶聚合不完全
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 平板电泳
垂直电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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sds-page的分离原理
sds-page的分离原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离技术，其分离原理主要基于蛋白质的大小和电荷差异。
具体而言，SDS-PAGE包括以下几个步骤：
准备样品：将待分离的蛋白质样品加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（如2-巯基乙醇）的缓冲液中。
SDS可以使蛋白质带负电荷，并且通过断裂蛋白质的二级和三级结构，使其获得线性结构以便于分离。
加载样品：将经过处理的样品加载到聚丙烯酰胺凝胶的样品孔中。
电泳：应用电场使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移，通常正极位于凝胶底部，负极位于顶部。
由于SDS提供了负电荷，蛋白质在电场作用下向阳极迁移。
同时，凝胶的孔径大小可以根据需要进行调整，以便不同大小的蛋白质能够得到有效分离。
分离：由于蛋白质的迁移速度与其分子量呈反比关系，较小的蛋白质在电泳过程中移动得更快，而较大的蛋白质则移动得较慢。
这样，在电泳过程中，蛋白质会被分离成一个个带状区域，形成所
谓的蛋白质条带。
可视化：完成电泳后，可以使用染色剂（如Coomassie蓝染剂）对凝胶进行染色，使蛋白质条带可见。
通过测量蛋白质条带的迁移距离和参考标准物质的迁移距离，可以计算出待分离蛋白质的相对分子量。
总之，SDS-PAGE利用SDS和电泳技术，根据蛋白质的大小和电荷差异，实现了对蛋白质的分离与分子量的估计。
SDS-PAGE原理、方法详解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。
用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。
丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。
丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量时必须戴手套和面具。
）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。
配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。
4℃保存。
（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。
配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理(共20张)
第10页，共20页。
浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩 胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。在上下电泳槽内 充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连 续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为 H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl 和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依 次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为 慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。 电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋 白质和慢离子在快离子后面加速(jiā sù)移动。在快离子和慢离子之间形成—个稳 定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间， 因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成—条狭窄带。这种浓缩效应可使 蛋白质浓缩数百倍。
SDS-PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理之欧阳法创编
SDS－PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？①溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。
为了保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4或1∶3。
②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。
所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。
③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。
Sample buffer中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。
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使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂
▪ SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚或组成它们的多肽键 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大 超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异
（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳
定的pH范围，凡不与SDS发生相互作 用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的 选择对蛋白质的分离和电泳的速度是 非常关键的
电泳缓冲液的种类： 1、磷酸缓冲液 2、Tris-醋酸钠缓冲系统 3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍 4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品 5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液 6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量
二、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate
三、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子 之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原 有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合 而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物
③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一
般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不 需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋 白并没有完全被去折叠
（4） 电泳 （5） 固定
（6） 染色 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含 有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基 黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团 上
蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 胶束基本上是相同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白
质的电荷密度，只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓 度的选择会直接影响分辨率。
不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度
（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合 到亚基上而给出相对迁移率和分子量 对数的线性关系。
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球型
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
SH基团，而得到窄的电泳带
（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起
的，特别是当凝胶和玻璃板组成的 “三明治”底部有气泡或靠近隔片的 凝胶聚合不完全
（3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。
（4）“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。
（5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引
起
（6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略
1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal）
②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银
（银离子）还原成金属银，以使银颗 粒沉积在蛋白带上
（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形， 说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷 却不好
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以