细胞生物学设计性试验

重金属Cu2+对豆芽遗传物质的影响
摘要：
以黄豆豆芽为供试材料,以不同浓度的Cu2+为受检物质, 采用实验分析与
统计分析的方法，探讨Cu2+对黄豆豆芽细胞的微核效应。

关键词：Cu2+;重金属；遗传物质;微核率
微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体 ,染色同主核 ,其直径一般为主核的 1 /3～1 /2, 主要由外界损害因素 (生物、物理、化学 )作用细胞后 , 导致细胞染色体丢失或断裂 , 从而在胞浆中形成 1个或数个小核。

多种实验已经证实 ,微核率的大小和作用因子的剂量有一定的关系[1]。

故常用微核来检测各种理化因子对生物体潜在的遗传危害。

蚕豆根尖微核试验在1986年已被中国环保局列为一种环境生物测试的规
范方法，它作为一种环境变异的检测手段，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。

美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，并建议在全世界范围内推广。

国内外也研究了不同种类、不同浓度的重金属对植物生长的影响，还研究了利用甲醛诱变大豆根尖细胞所产生的微核效应[2]。

植物对重金属的吸收、积累及重金属对植物的生理生化特性的影响已有较多报
道 ,而其对染色体行为的影响少见报道。

本次试验就由此产生利用重金属Cu对豆芽遗传物质影响的研究。

重金属Cu2+能对豆芽产生何种影响，是否也会出现微核效应，若产生微核效应，研究其微核率。

实验方案：
一、实验原理：
环境的三致性，即指环境对生物的致畸、致癌、致突变性，是目前环境污染中最主要的问题。

三致的根本在于致突变，致畸、致癌常常是致突变的结果。

微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1／20－1／5，这就是微核（micronucleus）。

微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。

由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比。

根据植物E. haichowensis 在低浓度Cu污染的环境下（250µ mol/l），Cu似乎对种子萌发有一定的刺激作用，但是当浓度超过750µ mol/l时，萌发率就随着Cu 浓度的增加而降低了，当浓度增至2000µmol/l时，萌发率则低于40%，与对照相比降低了一半[3]。

设计相应的五个浓度梯度Cu处理，并设计一个用蒸馏水处理的对照实验组。

二、实验材料：
1．器材
光学显微镜、500ml烧杯1个、10ml试管12个、试管塞12个、发芽盒6个、洗瓶、镊子、载玻片12个、盖玻片6个、滤纸、培养皿6个、托盘或解剖盘1个。

2．材料
豆芽种子
3．试剂
硫酸铜（6mmol/l、3mmol/l、1.5mmol/l、0.75mmol/l、0.375mmol/l）
卡诺氏固定液：由3：1的乙醇和冰醋酸配制；
水解分离液：盐酸与酒精1：1混合；
改良苯酚品红染液
蒸馏水
三、实验步骤：
1、种子处理
选取30~50颗饱满的豆芽种子，洗净后在室温下用蒸馏水浸泡发芽24小时，然后移入铺有纱布的托盘内培养。

一天观察一次，当初生根长到2cm时，取发育良好的，大小与根长近似的幼根。

将选好的豆芽分别放入六个发芽盒中，每个发芽盒中放5棵豆芽，使根尖完全浸入处理水样中，室温下培养48小时后，用蒸馏水洗根尖2次，每次2min，把洗净的豆芽放在新铺滤纸的培养皿中，25℃恒温培养使根尖细胞恢复24小时，设蒸馏水处理为空白对照。

2、固定
借助于卡诺氏固定液的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。

固定时在10ml试管内放入卡诺氏固定液约5毫升，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5—1厘米的根尖5—10条，放入试管内，用塞盖紧，在室温下固定2—24小时。

3、水解分离
水解分离的作用是去除未固定的蛋白质, 同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。

取处理好的材料，放在试管内加水解分离液2毫升，室温下处理8—20分钟，倒去水解分离液，再加入固定液2毫升，进行软化5min，软化对细胞壁起腐蚀作用。

然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄能轻压碎好。

4、染色压片
改良苯酚品红染色法：切取根尖分身组织放在载玻片上纵横切成几段，放在载玻片上，覆以载玻片，用镊子柄或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压，注意不要使玻片移动，分开两玻片，滴上1—2滴染液，20—30 分钟后加上盖玻片，注意不要有气泡产生，用吸水纸吸去多余染液。

5、观察
每组根尖细胞观察至少１００个细胞，记录出现微核的细胞个数，计算微核
1.预计结果
用蒸馏水处理的豆芽根尖细胞正常。

用较高浓度硫酸铜处理的出现微核现象，且
2.实际结果
由于多种原因，实验结果不理想，我们并没有观察到微核现象，可观察到：
1)改良苯酚品红染色不明显，看不清细胞核；
2)高浓度硫酸铜（6 mmol/l,3 mmol/l）处理过的细胞，在解离固定前已经
死亡，且其内质网可能被破坏，细胞有大量小泡；
3)较低浓度硫酸铜（1.5 mmol/l,0.75 mmol/l,0.375 mmol/l）处理过的细
胞，虽未起泡也不能观察到微核现象。

附图：
浓度为6mmol/l CuSO4处理结果
浓度为3mmol/l CuSO4处理豆芽的结果
浓度为1.5mmol/l CuSO4处理豆芽的结果：
浓度为0.75mmol/l CuSO4处理豆芽的结果：
浓度为0.375mmol/l CuSO4处理豆芽的结果：
蒸馏水处理豆芽的结果：
五．分析与讨论
1. 可行性：鉴于铜离子可以使蚕豆根尖细胞产生微核效应，而大豆与蚕豆均为
都可植物，此外此外甲醇诱导大豆根尖细胞产生微核效应的可能性已经有过证实，故而我们合理猜测，铜离子亦可以是大豆根尖产生微核效应，本实验方案可行。

然而，实验中我们并未清楚地观察到微核现象，所以，也许我们的推断存在疏漏铜离子本身也许并不会导致大豆根尖产生微核效应，这是我们在实验可行性方面考虑不够周详；
2. 硫酸铜的浓度选择：毒理液浓度梯度设置不甚合理，高浓度毒理液占有梯度
太多，且6mmol/l硫酸铜浓度太高致使迅速细胞死亡，没有来得及产生微核效应，根据背景材料以及参考文献，6mmol/l这一梯度存在不合理性，比较合理浓度梯度是：0,0.5mmol/l,1 mmol/l,2 mmol/l,4 mmol/l；
3. 染色
1) 解离：解离时间为8—20分钟，鉴于气温较低，我觉得解离时间太短。

细胞膜没有被完全破坏，染剂没有完全进入细胞对细胞核进行着色，如
此，因为细胞核不清晰的关系，即使有微核效应，我们也不能够观察到；
2) 染剂：改良苯酚品红染液摆放时间较长，染色效果不好，甚至不能清楚
地看出细胞边界，后换用醋酸杨红染液，由于解离不到位细胞核也不清
晰，但是细胞边界清晰的显现出来，故我认为染剂的选择不大适当。

六．致谢
感谢**大学细胞生物学实验室提供实验材料，感谢***老师悉心指导。

参考文献
[1] 段昌群，王焕校.重金属对蚕豆的细胞遗传学毒理作用和对蚕豆根尖微核技术的探讨[J].
植物学报,1995,37(1):14-24
[2] 田秋元, 高鹏修.甲醛诱变大豆根尖细胞的微核效应研究,安徽农业科学,2005,33(9)
[3] 田生科;香薷植物对Cu、Pb的耐性积累特性及对污水中重金属的去除效率研究[D];四川农业大学;2005年
[4] 陈玉胜, 陈全战.硫对铜胁迫下大豆种子的解毒作用[J].大豆科学,2010,29(4):630-633。