缺血缺氧至低龄大鼠脑少突胶质细胞的改变及脑白质损伤

缺血缺氧至低龄大鼠脑少突胶质细胞的改变及脑白质损伤和神经功能障碍相关性研究朱丽华，蒋犁东南大学医学院，南京（210009）E-mail：drzlh@摘要：目的观察3日龄大鼠缺血缺氧脑损伤后脑少突胶质细胞变化及鼠远期行为、学习记忆变化,研究早产儿脑损伤的发病机理，为干预治疗提供时间窗的实验依据。

方法选择3日龄同窝生SD 低龄新生大鼠112只随机分为实验组62只和假手术组50只。

新生大鼠在乙醚麻醉下切开颈部皮肤，假手术组仅分离左侧颈总动脉，而实验组行左侧颈总动脉结扎术,术后吸6±0.5％氮氧混合气4h，建立未成熟鼠缺血缺氧脑损伤模型,分别于损伤后24h 、48h 、72h 、11d四个时间点处死大鼠,采用组织切片苏木精－伊红染色、少突胶质细胞抗体O4 和细胞凋亡免疫组化双标记方法,观察低龄新生大鼠脑损伤的病理变化、少突胶质细胞凋亡表达及1m时行为变化，3m 时记忆学习能力改变。

结果缺血缺氧影响了低龄新生鼠的生长（体重增长缓慢、睁眼延迟）和神经行为功能缺陷、脑白质疏松、小胶质细胞增生和脑室扩大等病理变化,深部白质少突胶质细胞凋亡数在损伤后24h 、48h 、72h 较对照组增多( P < 0. 05) ,以48 h 两组差异最为显著,生后2 周两组差异无统计学意义 ( P > 0. 05) 。

结论 3 日龄低龄新生大鼠缺血缺氧脑损伤后,脑白质损伤明显，脑白质少突胶质细胞凋亡，伴生长迟缓和神经行为功能缺陷,有助于理解早产儿脑损伤发病机制和神经病理变化,并可作为研究早产儿缺血缺氧脑损伤的动物模型。

关键词：脑室周围白质损害，脑室周围白质软化，早产儿，少突胶质细胞，新生大鼠因受益于NICU 的精心救治和护理，90 %早产儿可在新生儿期存活。

在存活的早产儿中，约10 %早产儿可出现痉挛性运动缺陷即脑瘫，更有25 %－50 %早产儿主要表现为认知、行为缺陷或轻度运动障碍，这个高神经系统发病率日益受到关注，其主要与脑白质损害有关。

长期以来，无论是临床试验还是动物实验，研究焦点一直集中在缺血缺氧性脑损伤的神经元损害上，而相对忽视了对于脑白质损伤的研究，目前对于脑白质损害的研究尚处于探索阶段。

本实验预通过建立脑白质损伤大鼠模型来研究低龄新生大鼠脑室周围白质损伤发病机制及其与少突胶质细胞间的关系。

生后5天大鼠是神经元迁移的终末阶段，神经系统发育还未成熟，相当于人类的早产儿，所以，本研究采用单侧颈总动脉结扎法联合吸入6％（6％O2、94％N2）氮氧混合气4h，建立3 日龄未成熟大鼠缺血缺氧脑损伤模型，观察低龄新生大鼠脑损伤的病理变化、少突胶质细胞(oligodendrocyte ,OL)凋亡表达。

而且有必要知道是否缺血缺氧损伤在我们的发育大鼠的模型中也有长期的神经行为能力方面的变化，本实验对大鼠体重和神经行为改变作了测定。

1. 材料和方法1.1 材料实验动物清洁级3日龄(P3)SD大鼠(东南大学医学院实验动物中心提供)14窝,每窝约6～9只不等, 雌雄不拘，共112只，体重6.5～10.5g。

将同窝P3 大鼠随机分为两组: 单侧颈总动脉结扎联合吸入6％氮氧混合气4h组(实验组) 62只和仅分离左侧颈总动脉组(假手术组,即对照组)50只。

两组大鼠乙醚吸入麻醉1～2min后仰卧、四肢固定于手术台上。

取正中切口，实验组用5－0线结扎，缝合皮肤后放回原饲养环境中恢复2～3小时，然后置于2000ml密闭容器中，该容器置于37。

C恒温水域箱中，以2L/min的速度输入6％O2、94％N2混合气体，持续4小时，取出后返笼饲养。

对照组仅游离左侧颈总动脉。

术后假手术组死亡2只，试验组死亡14只，两组大鼠共96只(实验组和对照组各64只) 分别于术后24h 、48h、72h 和11d 断头取脑(每组各8只)。

切片进行苏木精－伊红染色，细胞凋亡和OL 双标记，另两组大鼠共32只(实验组和对照组各8只) 分别于术后1月、3月分别作行为学测定及三臂迷宫实验。

1.2 方法HE染色于HI 后24 h、48 h、72h、11d用0.4%戊巴比妥钠（40mg/kg）大鼠腹腔麻醉后经心脏插管，生理盐水冲洗，后灌入4%多聚甲醛，灌毕即断头取脑，外固定。

取不同冠状面于冰冻切片机切片，10um切片行常规苏木素-伊红(HE)染色。

凋亡和OL 标记O4 检测单纯少突胶质细胞标记：冰冻切片依次加入OL 标记O4 的一抗4 ℃过夜(10μg/ mL，试剂购自R&D 公司)，暗室中德克萨斯红( Texas Red ) 标记的二抗(20μg/ mL，试剂购自Vector公司) 37 ℃孵育1h。

双免疫荧光标记O4抗体和Tunel，前步骤相同，然后在暗室中再加入标记有FITC 荧光素的Tunel 反应液50μL 于37 ℃孵育1 h (试剂盒购自R&D 公司) ,荧光显微镜（Nikon，放大倍数×200）下观察脑室周围白质部位细胞凋亡情况。

每个标本连续切3 张切片进行标记，每张切片随即选取6 个视野计数，并取其平均值统计。

在不同波段下观察，再于电脑合成计算少突胶质细胞调亡率。

行为、学习、记忆测定（1） 悬吊试验一月龄大鼠双前腿抓住一水平木棒（直径约0.5cm），离开地面45cm，记录大鼠掉下的时间，并对其进行评分。

（2） 旷场试验装置为36 x 36 x 36 cm的无顶纸盒，盒底用黑线分成9个等大小方格，将大鼠置于中央方格中，观察30s内大鼠1/2以上身体从所在方格进入相邻方格及大鼠后肢性站立活动情况，并记分。

（3）三臂迷宫测试大鼠至3月左右时进行实验。

三等分迷宫系改良的“Y”臂迷宫，由3 支长度相等的臂组成，底部为可通电的铜棒，臂的末端装有小灯。

训练大鼠由暗臂(通电) 跑向亮臂(断电) 以逃避电击(即为正确)，每次随机点亮一臂，凡通电时动物直接跑向安全区为正确反应,反之为错误。

达到学会标准为连续10 次训练中有9 次正确，记录每一动物达标前所需测试数,以此作为学习快慢的客观指标。

24 h 以后检测记忆保存情况，即在连续10 次测试中正确反应保持多少，以记忆保持的百分数表示。

统计学处理应用SPSS11. 5 进行统计学处理，两样本均数比较采用t 检验，结果均以x±s 表示， P < 0.05 为差异有统计学意义。

2. 结果2.1 体重变化术后实验组大鼠有活动减少、喂养困难、体重增长缓慢等异常表现。

术前实验组和对照组体重相差不大,术后实验组平均体重增长幅度低于对照组，第4天至2周同日龄大鼠处死前体重明显低于假手术组大鼠体重（P﹤0.001），但到了1月龄时两组体重差异无统计学意义（P﹥0.05 ）(表1)。

实验组大鼠睁眼时间较对照组早，分别为P17.82±0.81，P15.38±0.62，两组时间差有统计学意义（P﹤0.05）。

表1 两组大鼠不同日龄体重比较（x±s）Tab1 Comparison of body weight in 2 groups at different days （g）P3：three days；P4：four days；P5：five days；P6：six days；P14：fourteen days；P30：thirty days2.2 病理学变化各组脑组织无肉眼可见的脑水肿，神经细胞的改变随脑损伤时间变化有差异。

实验组早期病变相对较轻，2周后损伤程度加重, 苏木精-伊红染色实验组脑室周围白质较对照组染色浅且疏松，脑室周围胼胝体及那囊组织相对疏松,缺血缺氧侧脑室较对侧及对照组扩大，但皮质病变较轻，皮层细胞结构完整，可见水肿的神经元细胞，而核固缩细胞相对较少，海马病变相对较轻，未见海马缺如。

2.3 凋亡和OL标记结果荧光显微镜下可见标记的OL程红色（激发Texas red），标记的凋亡细胞核呈现黄绿色荧光(激发FITC) 。

实验组术后24hOL未见明显减少，术后48、72 hOL数目减少，2周时实验组OL数与对照组无明显差别（表2）。

术后实验组OL凋亡数增多,以48 h 最多，2 周时两组OL凋亡数无明显差异(表3) 。

表2 两组大鼠不同日龄OL数目比较（x±s）Tab2 Comparison of the number of OLs in 2 groups at different daysP3：three days；P4：four days；P5：five days；P14：fourteen days表3 两组大鼠不同日龄OL凋亡数目比较（x±s）Tab2 Comparison of the number of OLs in 2 groups at different daysP3：three days；P4：four days；P5：five days；P14：fourteen days2.4 行为学测定1月龄时实验组大鼠悬吊试验及旷场试验评分均较对照组低（P﹤0.05），三臂迷宫试验显示试验组大鼠训练次数较对照组多（P﹤0.001），24小时后记忆保持率较对照组低（P﹤0.001）（表4）。

3. 讨论早产儿常见脑损伤主要为脑室内出血（intraventricular hemorrhage，IVH）和脑室周围白质软化（periventricular leucomalacia，PVL）。

最近几年IVH的发生率逐渐下降，PVL已上升为早产儿脑损伤的重要类型。

围产期脑缺血缺氧被认为是早产儿脑白质损伤尤其是脑室周围白质软化（PVL）的主要发病因素，早产儿脑室周围白质软化为早产儿神经系统后遗症最常见原因。

早产儿的缺血缺氧性脑损伤表现为选择性脑白质损伤，而PVL 是早产儿最常见的白质损伤形式。

血流降低和/或氧供减少将会导致脑室周围白质损伤[1]。

PVL为脑室周围白质囊性变和凝固性坏死或弥漫性白质损伤，而脑皮质损伤轻。

其发病因素主要为未成熟脑血流调控机制不成熟，脑白质在发育期血供不足和OL 的前体细胞对损伤有高度的敏感性，目前PVL 的发病机制尚未明确。

在PVL 的病因研究中,缺血缺氧被认为是最重要的因素。

长期以来由于动物模型难以建立，阻碍了PVL的进一步深入研究。

以往的7 日龄大鼠单侧颈总动脉结扎联合8％的低氧是研究足月儿缺氧缺血性脑病(HIE) 一个较经典的模型,主要的病变部位在皮质和海马神经元[2]，由于7 日龄大鼠神系统发育相当于人类足月或近足月的新生儿，其脑组织中OL 已逐渐发育成熟并发生髓鞘化, 对损伤易感性不强，而神经元却高度敏感，最终表现以神经元受损为主，白质损伤少见。

所以这对研究脑白质损伤并不合适。

生后5天大鼠是神经元迁移的终末阶段[3]，神经系统发育还未成熟,相当于人类的早产儿。