人脑少突胶质细胞的培养与鉴定

b ral ol igodendrocytes in a serum - free, chem ically def ined m ed ium
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[ 5 ] Zhang SC, Lቤተ መጻሕፍቲ ባይዱndb erg C, Lip sitz D, e t a l. G enerat ion of oligoden-
军事医学科学院院刊 2005年 12月 第 29卷 第 6期
Bu ll A cad M il M ed S c,i D ec 2005; V ol 29 N o 6
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人脑少突胶质细胞的培养与鉴定
研究简报
陈 琳, 白慈贤, 张 锐, 李艳华, 高艳红, 王冬梅, 吕 施双双, 裴雪涛*
( 军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
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军事医学科学院院刊 2005年 6月 第 29卷 第 3期
3 讨论
我们获得了少 突胶 质细胞, 并 在体 外长期 传代 培养, 仍 能维持正常的细胞形 态。在细 胞培养过程中 发现, 在培养初 期, 可见有多种细胞存在, 有神 经元、星 形胶质细胞 和少突胶 质细胞等。神经元在体外培养 存活时间短, 星形胶 质细胞贴 壁快, 1~ 2 h, 且黏 附力 强, 而少 突胶 质细 胞贴 壁周 期长, 贴 壁不牢。根据细胞的不同生长 特性, 在 分离初期去 除贴壁的 细胞, 在传代的过程中, 弃去贴 壁牢的细胞, 从而获 得少突胶 质细胞。通过细胞形态、细胞超微结构 观察以及免 疫组化检 测表明, 该细胞为 少突 胶质细 胞。综上 所述, 我们 从脑 组织 中成功地分离到 较纯的 少突 胶质细 胞, 并长 期传代 培养, 该 工作为进一步研究打 下了基础。 [ 关键词 ] 少突神经胶质; 细胞, 培养的; 免疫组化 [ 中图分类号 ] Q 813111 [文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 1000-5501( 2005) 06-0595-02
2 结果
2. 1 细胞形态观察 分离培养的胚胎脑细 胞胞体 为圆 形、椭 圆型 或多角 形,
细胞伸出细长突起。核呈圆形或椭圆形 (图 1)。
图 1 少突胶质细胞形态 ( @ 48 )
2. 2 透射电镜观察 细胞浆电子密度高, 有较多 的核 糖体和 粗面 内质网, 线
粒体不规则, 内有许多管 嵴。胞核 内有较粗大的异染色质块 (图 2)。 2. 3 免疫组化检测
(本刊编辑部 )
d rogl ial p rogen itors from neu ral stem cells [ J] . J N eu rocyto,l 1998,
27( 7) : 475- 489.
(本文编辑 孙承媛 )
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# 读者 # 作者 # 编者 #
外国人名的正确书写
在我们编辑稿件 时, 发现不少作者在参考文献中著 录英、美人 的姓名时 常常发 生错误, 现 将常见 的几种错 误及正 确的著 录格式列出, 供参考。①不了解英、美人 名前姓后的习惯, 把第一个名字 当作姓, 而把姓当 作名并且 缩写, 如 将 Steven A. L eadon, 写成 Steven AL, 正确的 著录应该是 L eadon SA。②把教名当作姓, 而把真正的姓完全舍弃不写, 如将 John E. B iag low 错误地 著录为 John E, 正确的著 录应该是 B iag low JE。③把表示父子间晚辈的缩写词 Jr. , 以及 表示几代人晚辈的Ⅲ等不正确地省略, 如将 Ear l F. W a lbo rg Jr. 著录为 W a lborg EF, 正确的写法应该是 W a lbo rg EF Jr. 。
染色体数目为 46 条, 包括一 对性 染色体。 细胞 染色体 数目正常 (图 5), 表明该细胞染色体未发生畸变。
[收稿日期 ] 2005- 01- 05 [基金项目 ] 国家 / 9730 课题 ( 2001CB509906 ) ; 国 家 / 8630课
题 ( 2002AA 205051, 2003AA 205160) [作者简介 ] 陈 琳 ( 1964- ), 女, 四川省合江县人, 高级实验师。 * 通讯联系人, E-ma i:l peixt@ n ic. bm .i ac. cn
1 材料和方法
1. 1 材料 脑组织取自水囊 引产 6个月龄人胚 。低糖 Eag le DM EM
购于 G ibco公司。秋水 仙 碱、抗人 GC 单 抗为 Sigm a 公司 产 品。胰酶为 Am resco公 司产品 。胎牛 血清 由浙 江杭 州四 季 青生物工程 材料 研究所 生产。抗 人 S-100 多抗、抗 人 G FAP 多抗均购于中山生物 技术有限公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 细胞分 离培养 将水 囊引 产的 胚胎 浸于 75% 乙 醇 中消毒 5 m in, 无菌状态下取脑组织, 生理盐水 洗涤 1 ~ 2次, 去除脑膜和 血管 纤维。在 PBS 中吹 打成 细胞 悬液, 于离 心 管中室温放置 5~ 10 m in, 去除上层脂肪, 重复操作 1次。向 细胞中加入 PBS, 过 100目筛网, 去除组织团块。 1 200 r/m in 离心 5 m in, 弃 上清。加入 DM EM 完全培 养液, 按 1 @ 106个 细胞 /m l接种于 T-25 的培 养瓶 中。 37e , 5% CO2培 养箱 中 静置培养 3~ 4 h, 吸 取上层 未贴壁 细胞转移 至新培 养瓶中, 继续 培养, 培 养体系 为含 20% 胎 牛血 清的低 糖 DM EM。每 3~ 5 d换 1次液, 当 细胞 铺满 瓶 底 14 ~ 20 d时 , 用 0. 02% EDTA - 0. 25% 胰酶消化传代。 1. 2. 2 细胞生物学分析 1. 2. 2. 1 细胞形态观察 用倒置显微镜观 察。 1. 2. 2. 2 超微结构检测 用透射电镜观察 。 1. 2. 2. 3 免疫组化 鉴定 细胞爬 片, 用 4% 多聚 甲醛室 温 固定 15 m in, PBS洗涤 2次。用含 0. 1% T ritonX-100的 0. 3% H2O 2-甲醇溶液室温孵育 10 m in, 蒸馏水 洗, PBS浸泡 5 m in。 10% 山羊血清工作液室温孵育 15 m in, 去血清。加 抗体, 4e 过夜, PBS洗涤。加生物素标记的二抗, 37e , 15 m in, PBS洗 涤。加辣根过氧化物酶标 记的抗 生物素抗 体, 37e , 15 m in,
S-100蛋白主要存在于胶 质细胞 中, 特 别是 星形 胶质细 胞和少突胶质细胞。而胶质酸性蛋白 ( G FAP )是星形胶质细 胞的特异性标志蛋白。 采用免疫 组化 检测, S-100抗 体染色 为阳性, 胞浆染色 (图 3), 少突 胶质 细胞特 异性 表达 标志神 经节苷脂 ( GC )抗体 染色为 阳性, 胞核染 色 ( 图 4), GFAP 抗 体不染色, 表明分离培养 的细胞为少突胶质细胞。 2. 4 染色体检查
洋, 王韫芳, 闫
舫, 南
雪, 谢小燕,
少突胶质细胞是中枢神经 的成髓鞘神经胶质细胞, 它包 绕神经纤维的轴突形成髓鞘, 对轴突正常的电传导功能 有重 要作用 [ 1] 。将少突胶质细 胞移植 入髓鞘 形成障 碍或脱 髓鞘 的中枢神经系统内, 可揭示髓鞘形成和再生机制 [ 2] 。由于体 外培养的少突胶质细 胞与其在体内的特性相关 [ 3] , 因此通过 体外培养研究可了 解少突 胶质细胞 的存活、增 殖、分化和 发 育过程中的细胞生 物学变 化。然而中 枢神经 系统 具有细 胞 多样性, 它包括神经元、星形胶 质细胞、少突胶质细胞和 小胶 质细胞, 所以必须对少突胶质细胞进行体外纯化。目前 纯化 的方 法很多, 如密度梯 度法 [ 4] 、神 经干细胞 定向诱导分 化培 养法 [ 5] 等。前者得到的 细胞纯度 低, 后者操 作繁琐, 条件 要 求高。我们采用含 20% 胎牛 血清 的低 糖 DM EM 体 外培养, 同时根据少突胶质细 胞与星 形胶质 细胞培 养层黏 附特性 不 同进行分离培养, 获得了少突胶质细胞。
[参考文献 ]
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[ 3] M cCarthy KD, de V ellis J. Preparation of separate astroglial and
PBS洗涤。 DA B底物显色, 自来水洗。 1. 2. 2. 4 染色体检查 向指数生长期的单层细胞 培养液中 加入秋水仙碱 至终 浓 度为 0. 03 L g /m ,l 37e 继 续 培养 4 ~ 6 h。用吸 管 轻 轻 吹 打 细 胞 使 其 脱 落, 1 000 r/m in 离 心 5 m in, 收集 分裂 相细胞。 加入 0. 075 m o l/L K C l溶 液, 37e 温浴 30 m in, 离心, 收集细胞。将甲醇与冰醋酸混合液 ( 3B1) 加到细胞中, 混匀, 37e 固定 15~ 20 m in, 重 复固定 3次。制 片, G iem sa染色, 自然干燥。光学显微镜观察、计数, 分析。
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