星形胶质细胞和少突胶质细胞培养

（二）星形胶质细胞

星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少，星形胶质细胞分两类，一类为原浆性星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。另一种为纤维性星形胶质细胞（fibrous astrocyte），它的突起细长，分枝少。纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞。星形胶质细胞具有多种功能，中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填，起结构的支持作用，星形胶质细胞的突起构成血脑屏障，星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等。调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用。还能吸收细胞间隙中过多的K+，为K+的存储库，通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动。星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子，星形胶质细胞有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。

（1）方法和结果

选择出生2 d 的SD大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃

30min)后用培养液（90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2，每瓶10ml细胞悬液置。置36℃、10%CO2 培养箱中培养。每周换液2 次，培养10-14h，细胞分为两层，下一层为I型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是O-2A前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37℃摇床上振荡，16 h （180r/min）O-2A前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中，培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞。可分裂增殖的原浆形胶质细胞和纤维型胶质细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体（GFAP）染色确定。

（三）少突胶质细胞

1、方法和结果

少突胶质细胞培养方法同星形胶质细胞培养。少突胶质细胞比星形胶质细胞小，光镜下少突胶质细胞胞体呈圆形或多角形，突起呈串珠状，根据其所在部位的不同可分为束间少突胶质细胞、神经元周围少突胶质细胞。在中枢神经系统内，少突胶质细胞主要形成及维持髓鞘。讨论

在神经生理、生化和神经药理的研究中、神经细胞的体外培养日益受到重视，因为它是研究单个神经细胞功能和结构的适宜方法。

在体外培养条件下背根神经节、颈上交感节、胚胎脊髓和不同脑区(海马、隔、下丘脑、大脑皮层、小脑和垂体细胞等)培养细胞的形态特征都不尽相同，这与它们具有不同功能有关。交感和感觉神经元以及不同脑区神经元的体外培养成功，为我们深入研究它们的结构和功能提供了合适的体外实验模型。

在背根节神经细胞培养过程中，我们观察到，早期感觉神经元发育阶段，NGF是必不可少

的营养因子，但在培养后期，神经元已发育成熟，可能非神经细胞分泌的极少量NGF即能满足神经元生长需要,因此不另NGF也能维持长期培养。在上颈交感节细胞分散培养过程中，我们亦观察到，若最初1-2d在培养液中缺乏NGF，交感神经元突起不见生长，且大多死亡。培养15d或1个月时，如果培养液中未加入NGF，本来生长良好的神经元很快便出现颗粒变性或空泡，逐渐死亡。结果表明NGF对于促进神经突起生长和维持神经元生存有显著作用。

在神经细胞培养过程中，神经细胞的生长发育受到多种因素的影响，其中细胞接种密度对细胞生长发育影响较大，一般神经细胞的接种密度以0.5-1×106个细胞/ml密度为宜，如每毫升中超过3×106个细胞/ml密度，将使细胞簇过大，而且培养皿内过分拥挤，影响存活和生长。但如果培养的细胞数目过少时，神经细胞的生长分化较差，因为神经细胞是一种细胞群体，它们相互之间具有营养和支持作用。其次是控制非神经元细胞过多增殖。

原代分散单层培养是神经细胞与非神经细胞的混合培养。其中胶质细胞等可在体外继续增殖，神经元则不能增殖而只能生长分化。当适量胶质细胞的存在是神经细胞长期培养的必要条件，但如果神经胶质细胞过渡增殖时，神经细胞的生长分化便受到一定影响，常使神经细胞提早开始退化。这可能是由神经胶质细胞频繁分裂过程中，夺取了神经细胞生长中需要的某种营养成份。为保证神经元生长所需的营养，需在非神经细胞增殖的高峰即所谓“合

流”(confluence)时，将一定量的抗DNA 药物加入培养液中以抑制其过渡增殖，实验证明，在培养第5d 或第7d时使用5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或阿糖胞苷3μg/ml，作用48h即停用可加快神经元的分化，延长培养时间。

再次是所配制的培养液必须保持一定的等渗性，溶解于培养基的物质浓度所产生的等渗性必须与细胞外液的液体一致，培养神经细胞可将培养液的渗透压调节到320-330 mOso 较为

合适。如果培养液是高渗的，细胞会失去水份并发生皱缩，如果培养液是低渗的，细胞会吸收水分而膨胀。两者不利于神经细胞的存活和生长。

最后需注意的是须掌握换液的次数和数量。为了使神经细胞得到生长分化必须的营养，必须经常进行换液，但如果换液次数太多，并不利于神经细胞的生长分化，因为神经细胞在培养液中需要适当的环境，而且它本身也有创造良好环境的能力，如果频繁换液就会破环这种环境。我们每周换液二次，每次只换一半，保留一半原液。除此之外，培养液的PH、温度等均对神经元的生长发育有影响，因而在实验中必须加以注意。