实验一 全基因组DNA的分离及纯化
溶菌酶SDS裂解
核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
核酸制备的步骤：
I.材料准备
破碎细胞 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质 1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀 后13000rpm离心3min，除去苯酚。
6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积 的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心 15min，可见白色丝状沉淀物。 7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µ l 70％乙醇洗涤2 次，室温干燥后，用50µ lTE （含20µ g/ml的Rnase）溶解DNA， －20℃冰箱放置备用。源自核酸制备中常用的蛋白质变性剂
实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化
二、实验原理 基因组DNA的特性：分子量较大、易断
如何保证DNA分子的完整性
DNA抽提思路：
破碎组织细胞 去除细胞内杂质
匀浆或液氮研磨 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
所提取的DNA片段的大小：100 ～150kb
纯化DNA
、实验原理
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
鲁东大学 生命科学学院 四、操作步骤
基因组DNA的提取：
School of Life Sciences
0.1g猪肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 转入玻璃匀浆器中，加入1mL匀浆液，匀浆至无组织块（冰上操作） 将匀浆液转入1.5 mL小指管， 加入蛋白酶K20 uL（20mg/mL），颠倒混匀 650C 恒温水浴锅中水浴30min 12000rpm，离心5min，取上清移入另一离心管
超净台中干燥后加 100～200uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存 （可进一步通过凝胶电泳检测所获取基因组DNA质量）
鲁东大学 生命科学学院
五、注意事项
1.肝的处理时间不宜过长；
School of Life Sciences
2.加入细胞裂解液前，细胞需均匀分散，以减少DNA团块形成； 3.提取的DNA不宜过分干燥，否则会导致DNA溶解困难。
DNA纯化
加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min 40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
鲁东大学 生命科学学院
School of Life Sciences
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀 40C,12000rpm，离心10min，用扩口枪头取上清 上清加1/10体积的3mol/L NaAc（pH5.2)和加2倍体积的无水乙醇 慢慢混匀，-200C静置20min 12000rpm离心10min，弃上清 沉淀用1mL 70%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清
组织DNA的提取与纯化
在某些情况下，需要更高的灵敏度和特异 性来检测和纯化特定的DNA片段，这是当 前技术所面临的挑战。
随着生物信息学和基因组学的发展，对 DNA提取与纯化的自动化和高通量需求越 来越高，这也是未来需要解决的问题。
未来发展方向与前景
新技术应用
随着生物技术的不断发展，新的技术和方 法将被应用于组织DNA的提取与纯化，以
通过对组织DNA进行病原微生物检测，有助于快速准确地诊断感 染性疾病。
个体化医疗与精准医学
个体化用药
根据组织DNA中的基因变异信息，为患者选择最合适的药物和剂 量，实现个体化用药。
预测性医学
通过分析个体的基因组信息，预测其在特定疾病上的风险，从而采 取针对性的预防措施。
定制化疗法
基于组织DNA的个体差异，开发定制化的疗法或细胞疗法，提高 治疗效果和安全性。
02
03
细胞破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞，释放出细胞内的 DNA。
DNA的分离
利用离心、沉淀等方法将 DNA从细胞碎片和其他物 质中分离出来。
DNA的提取
通过吸附、洗脱等步骤将 DNA从细胞裂解液中提取 出来。
DNA的初步纯化
去除杂质
01
通过离心、过滤等方法去除提取出的DNA中的蛋白质、RNA等
去除其他杂质
如多糖、脂类等，可以通过离心或沉淀的方法去 除。
进一步纯化
乙醇沉淀
将DNA从溶液中沉淀下 来，以去除剩余的杂质。
漂洗
使用漂洗液进一步去除 DNA上的杂质。
切向电泳
通过切向电泳技术，将 DNA片段根据大小进行 分离。
纯度检测与鉴定
紫外吸收法
通过测量DNA在260nm和280nm处的紫外吸收值，判断DNA 的纯度。
猪肝基因组DNA的分离纯化及鉴定
猪肝基因组DNA的分离纯化及鉴定摘要利用十二烷基硫酸钠（SDS）裂解猪肝组织细胞，用氯仿、异戊醇抽提蛋白质以分离核酸，然后用盐溶法分离出DNA，用冷乙醇沉淀，最后分别用紫外分光光度法和二苯胺显色法测定DNA纯度，并比较二者的结果。
关键词：DNA纯化鉴定紫外分光光度法二苯胺Separation,purification and identification of genomic DNA inpork liver cellsAbstract:In our experiment the lysis of pork liver cells is accomplished with sodium dodecyl sulfate(SDS).And the protein is separated with chloroform and isoamyl alcohol and the nucleic acid is obtained.Then DNA is separated by concentration of NaCl.Finally the ultraviolet spectrophotometry is used to determine the purity.Key words:DNA;Purification;Determination;ultraviolet spectrophotomentry;Diphenylamine核酸研究的首要方法是分离和测定。
核酸制备中需要注意的共同问题是防止核酸的降解和变性，要尽量保持其在生物体内的天然状态。
故必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。
天然核酸都具有生物活性，这是检验其质量的重要指标。
物理化学指标也常用来评定核酸的品质，这些指标包括：相对分子质量，紫外吸收，沉降系数，电泳迁移率，粘度等。
制备方法的不同因材料的不同而有很大差异1。
试验一植物基因组DNA提取
实验一植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。
原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。
然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB 使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。
经细胞破碎液获得的DNA 粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。
一、材料植物的根、茎、叶。
二、设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。
三、试剂1、CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。
四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。
2、将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。
3、加入2.4ml 65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀，-20℃度放置20min，4℃离心5000g×5min，去上清。
4、再沉淀中加入0.6ml的65℃CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4℃离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置20min。
DNA克隆技术的实验方法与应用
DNA克隆技术的实验方法与应用由美国的赫伯特·鲍姆发明的DNA克隆技术，是一种在体外进行基因工程的重要技术。
它可以复制、修饰和转移任何基因组的DNA序列，是现代基因学、分子生物学和生物技术领域最经典的实验技术之一。
本文将对DNA克隆技术的实验方法和应用做初步介绍。
一、原理DNA克隆技术基于细胞质体的自然复制机制，在体外将不同来源的DNA片段连接起来并稳定的复制进入到宿主细胞内。
DNA 克隆的基本图谱，包括需要被克隆DNA的结构，选材，酶切和聚合反应、DNA分离与纯化，连接反应、载体选择及转化等流程。
二、实验方法1. DNA分离与纯化DNA 分离可使用多种DNA提取法，从细胞、组织、粪便等样品中提取DNA。
常用的方法有有机溶剂法、盐水法、界面活性剂法、核蛋白纤维素法等。
其中，有机溶剂法操作简单、纯化效果好，适用于体积较小的样本。
2. 酶切与聚合反应酶切是将克隆DNA加入到载体的首个步骤。
在酶切过程中，需要用到限制性内切酶，将DNA序列切割成不同的片段，以便将DNA片段连接载体时具备兼容性。
聚合反应可用Taq聚合酶引物进行PCR扩增，建立目标DNA与载体之间的黏合。
3. DNA 连接反应连接反应是将目标DNA 片段和载体DNA 进行黏合。
常用的技术有限制性内切酶法和磷酸二脂—缩合酶法。
磷酸二脂—缩合酶法是利用此酶使DNA连接变得稳定而成为一对完整的DNA序列。
4. 载体选择与转化DNA片段连接到载体后，宿主细胞可以用化学或电击转化方法将DNA载体复制。
目前，载体基本的质粒选择有合成型和自然型两种，而自然型质粒可用于在体外进行克隆的工作。
三、应用1. 生产基因产品该技术已广泛应用于生产基因药物、基因工程菌株、基因转化植物和克隆动物等产业。
其中，基因药物和基因工程细菌产业是目前应用最广泛的两个方面。
2. 分子生物学研究DNA克隆技术是分子生物学中最经典和最精密的实验技术之一。
在原核生物和真核生物的发育研究中，DNA克隆技术也应用得十分广泛。
细菌基因组DNA的提取
核酸样品的保存
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性 Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
二、材料、设备及试剂
菌种 ：大肠杆菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器，水浴锅（ 37℃ 、60 ℃ ） 试剂：LB液体培养基 、无水乙醇、细菌基因组DNA提取试剂 盒。
三、操作步骤
四、注意事项——材料准备
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
四、注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
实验一、细菌基因组DNA的提取
一、实验原理
1、核酸的分类
DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA， 如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。
DNA提取实验方案
DNA提取实验方案
材料与试剂：
1.细胞样本（如血液、组织等）
2.细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶K）
3.蛋白酶K
4.乙醇
5.蛋白质沉淀液
6.正丁醇
7.氯仿
8.等离子水
9.TE缓冲液
10.离心管
11.磁珠
12.磁珠悬浊液
13.热拌器
14.离心机
实验步骤：
1.细胞破裂：将细胞样本加入细胞裂解缓冲液中，加入适量蛋白酶K，放入热拌器中破裂细胞，使DNA溶解在缓冲液中。
2.蛋白质沉淀：加入等体积的蛋白质沉淀液，轻轻混匀，离心使蛋白
质沉淀。
3.DNA沉淀：将上清液转移至新的离心管中，加入适量的乙醇，轻轻
混匀，使DNA沉淀。
4.DNA纯化：将DNA沉淀用等离子水悬浊，加入等体积的正丁醇和氯仿，混匀后离心，取上清液，加入等量的等离子水和TE缓冲液。
5.纯化DNA：将上清液转移至带有磁珠的离心管中，加入磁珠悬浊液，混匀后在离心机中进行离心，使DNA和磁珠结合。
6.洗涤DNA：将离心管中的上清液丢弃，加入70%乙醇洗涤DNA，多
次洗涤后去除乙醇，干燥磁珠。
7.溶解DNA：最后用等离子水或TE缓冲液溶解DNA，即可用于后续的
实验。
通过上述步骤，可以从细胞样本中提取出纯净的DNA，用于后续的分
子生物学实验。
DNA提取是一项基础而重要的技术，在分子生物学和遗传
学研究中具有广泛的应用价值。
希望以上方案可以帮助您顺利进行DNA提
取实验。
实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化
细胞裂解缓冲液（核酸酶抑制剂）、蛋白质酶K、TE缓冲
液（pH8.0）、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提液、 氯仿：异戊醇（24:1）抽提液、5.2mol/L醋酸钠、异丙 醇、无水乙醇、70%（V/V）乙醇、灭菌水
移液枪的使用
样品准备 设定体积 装枪头
吸液
放液 使用完毕
将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形， 延长移液枪的使用寿命
二、实验原理 基因组DNA的特性：分子量较大、易断 如何保证DNA分子的完整性 DNA抽提思路：
破碎组织细胞
匀浆或液氮研磨 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质 所提取的DNA片段的大小：100 ～150kb DNA
二、实验原理 真核生物DNA以染色体形式位于细胞核内，因此，制备DNA的原 是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA的完 整。 SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白质与DNA分离，
DNA纯化
加等体积氯仿/异戊醇(24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min(40C 冰箱) 40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
பைடு நூலகம்
上清加等体积氯仿/异戊醇(24:1)，慢慢颠倒混匀 40C,12000rpm,5min，用扩口枪头取上清 上清加1/10体积的3mol/L NaAc（pH5.2)和加2倍体积的无水乙醇 慢慢混匀，-200C静置一周 12000rpm离心10min，弃上清 沉淀用1mL 70%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心5min，弃上清 超净台中干燥加 100～200uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存 （可进一步通过凝胶电泳检测所获取基因组DNA质量）
【实验流程】 材料 蛋白酶K 醇沉淀
基因提取的实验原理是什么
基因提取的实验原理是什么基因提取是一种实验方法，用于从细胞中分离和纯化DNA分子。
它涉及到一系列步骤，包括细胞破碎、去除杂质、DNA溶解和纯化等。
基因提取的实验原理主要分为以下几个步骤：1. 细胞破碎：首先需要将细胞破碎以释放DNA分子。
这可以通过物理或化学方法实现。
物理方法包括振荡、摇床或超声波等，用于破坏细胞膜和壁。
化学方法则是采用细胞裂解缓冲液，其中含有蛋白酶或表面活性剂等，可以破坏细胞结构。
2. 去除杂质：细胞的破碎会释放许多非DNA的组分，如蛋白质、RNA、多余的盐和酶等。
这些杂质会影响DNA的提取和分析，因此需要通过凝胶电泳、离心沉淀或其他分离技术来除去。
一种常用的方法是通过protease K 酶处理混合物，使DNA不受蛋白质的干扰。
3. DNA溶解：细胞溶解后，DNA被释放到溶液中。
DNA在水溶液中具有一定的稳定性，但在高温、酸碱等环境条件下会降解。
因此，为了保护DNA的完整性，需要在溶解过程中加入一定的缓冲液，如Tris-HCl缓冲液或TE缓冲液（Tris-EDTA缓冲液），以维持适宜的pH值和离子强度。
4. DNA纯化：DNA溶液中仍然存在其他杂质，如RNA、酶、无机盐等。
这些杂质会干扰DNA的后续分析。
因此，需要利用分子生物学中的各种技术来纯化DNA，如甲醇沉淀、有机溶剂提取（如酚/氯仿或酒精/马尾酚方法），或者利用商用的DNA提取试剂盒进行纯化。
总体来说，基因提取的实验原理是通过破碎细胞、去除杂质、溶解DNA和纯化DNA等步骤来获得纯净的DNA样品。
这种纯化后的DNA可以用于许多后续实验，如PCR、酶切、DNA序列测定等。
基因提取是分子生物学和遗传学等领域中的关键步骤，对于研究基因功能、诊断疾病、进行基因工程等有着重要的意义。
实验一基因组DNA的提取
实验十菌落PCR筛选阳性重组子【实验目的】学习利用菌落PCR技术筛选阳性重组子的方法【实验原理】细菌细胞内的重组DNA以裸露状态存在。
在高温条件下，细菌细胞破裂，细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可作为模板用于PCR，进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。
【仪器、材料与试剂】1 仪器生化培养箱，超净工作台，离心机，PCR仪，电泳仪，电泳槽，连续可调移液器，凝胶成像系统2 材料含待检测菌的阳性筛选平板，PCR试剂盒，引物1（primer 1）和引物2（primer 2），PCR管，移液器枪头，ddH2O，电泳级琼脂糖，Tris碱，硼酸。
3 试剂PCR试剂盒：10X PCR buffer，MgCL2或MgSO4，dNTPs，DNA聚合酶；primer 1和primer 2：均配成10μmol的使用液；DNA Marker：根据PCR产物大小确定。
【实验步骤】1 配制25μL的PCR反应体系10×buffer 2.5 μLMgCL2或MgSO4 1.5～2.5μL（若buffer里有，则可不加或少加）dNTPs（2µmol） 2.5μLprimer 1 (10µmol ) 1μLprimer 2 (10µmol ) 1μLTaq 酶（或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶）1UddH2O 补至25μL最后用移液器挑取筛选平板中的待检测菌落，放入上述反应体系中。
2 PCR程序配制好反应体系后，将其放入PCR仪中。
然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。
通常设计的反应条件如下：94℃预变性3～5min；94℃变性30sec～1min50～60℃退火1min 30～35个循环72℃延伸2min72℃最终延伸8～10min设定好程序后，即可开始运行程序，进行PCR。
3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测见实验六PCR完成后，取5～8μL PCR产物与适宜的上样缓冲液（loading buffer ）混匀后，加样电泳。
分子生物学实验基本技术
分子生物学实验进程
实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备 DNA样品的纯化、定量和电泳检测 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化 实验三 碱变性法小量制备质粒 DNA的限制性酶切 实验四 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 质粒DNA的连接和转化 实验五 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR 实验六 Western印迹（上） 实验七 Western印迹（下） 实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 实验九 多聚酶链式反应（PCR）反应 实验十 Northern印迹 实验十一 Southern印迹 考试
1966
1972 1973 1973 1977 1977 1982 1986 2001
Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana
Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen Discovery of reverse transcriptase; H. Temin Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman Creation of PCR; K. Mullis et al. Human Genome Project; Venter, Collins and many others
段连接起来构成一个新的DNA分子的过程。
分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性 繁殖过程。
实验一 真核生物基因组DNA的提取和分析
（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒 入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。 动物尸体应放入指定的容器中。
（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切 勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。
（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用 物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教 师检查，允许后方可离开。
1) 破碎细胞 2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞 基因组较大，在纯化出的DNA的操作中应注意动作轻 柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学 作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA 3) 沉淀核酸
DNA提取和分析步骤图解
SDS裂解 蛋白酶K消化
酚氯仿抽提
二苯胺法
紫外分光光度法分析
答辩ppt内容： 实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式， 实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释
答辩安排： 最后一周答辩，每组时间控制为20分钟演讲，10分钟提问。
设计性实验题
1 免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。 2 人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。 3 蛋清中溶菌酶的分离鉴定。 4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。 5 如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？ 6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？ 7 请设计实验从基因及蛋白表达角度讨论老年痴呆症模型小鼠与人类老年痴 呆症的可比较性 （即小鼠模型建立的可靠性） 8 请设计实验从基因及蛋白表达角度追踪老年痴呆模型小鼠发病期典型变化， 及给药治疗后效果评价 9 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设 计实验检测羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白(Albumin) 并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。 10 细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝脏中有三种亚型，即细 胞色素氧化酶1，2和3，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的 表达并计算它们的表达量。
基因组的dna提取与纯化中dna含量低的原因
基因组的dna提取与纯化中dna含量低的原因1. 引言基因组的DNA提取和纯化对于后续实验的进行非常重要，因为DNA 是产生生命的重要物质。
然而，有时DNA的提取和纯化过程中会出现DNA含量低的情况，这会用影响后续实验的结果。
本文将讨论在DNA提取和纯化中，DNA含量低的原因。
2. DNA提取的基本步骤DNA提取通常分为三个步骤：细胞破裂、DNA分离、DNA纯化。
其中，细胞破裂是最关键的步骤，因为它决定了DNA是否能够被有效地分离。
在细胞破裂时，常用的有生物法和物理法两种方法。
生物法是指使用化学试剂或酶，将细胞膜和核壳破裂，使DNA裸露。
物理法则是通过机械方法（如高压），来破裂细胞膜和核壳。
在细胞破裂后，可以通过离心来分离DNA。
DNA纯化是为了减少杂质对DNA产生影响。
纯化方法通常为盐溶、硅胶柱纯化、离心管纯化等。
这些方法可以将DNA从其他杂质中分离出来，获得较干净的DNA样品。
3. DNA含量低的原因DNA含量低通常有以下几个原因：3.1 样品来源不纯样品来源不纯可以是由于取样不规范导致，也可以是外源性DNA污染导致。
比如，从土壤中提取DNA时，土壤中的微生物DNA可能会干扰样品中目标DNA的提取和纯化。
因此，必须在取样和提取前进行预处理，以确保目标DNA可以被有效地提取。
此外，对于人类样品，样品处理要避免污染，如手套的使用，每次操作都更换器材等。
3.2 细胞破裂效果不理想细胞破裂是DNA提取的关键步骤之一。
如果细胞破裂效果不理想，将会导致DNA含量低。
在细胞破裂时，需要考虑一些因素，如细胞密度、细胞类型以及细胞破裂方法等。
如果细胞密度过高或者破裂方法不当，就有可能导致DNA破坏或者不完全释放，从而降低DNA的提取量和纯度。
3.3 质量差的DNA纯化纯化方法也是影响DNA含量的一个因素。
如果选用质量差的纯化方法，可能会导致DNA遭受损伤或者丢失。
同时，以前某些纯化方法对一些DNA形态脆弱的样本存在一定的损伤，如某些ungi、植物的叶片、种子等，在这些情况下，DNA含量会出现不同程度的降低。
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定夏天（武汉大学生命科学学院生命科学与技术基地班2009302630014）摘要实验中以新鲜猪肝为材料，利用SDS裂解细胞，氯仿、异戊醇抽提，得到猪肝细胞中基因组DNA和RNA，并且用盐溶法分离DNA与RNA。
用紫外分光光度法测定DNA的含量和纯度，并与二苯胺显色法的结果相比较。
关键词核酸；DNA；紫外分光光度法；二苯胺Separation, purification and identification of gnomic DNA from animal tissue: XIA Tian (College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China).Abstract: In this experiment, fresh pork liver was used as the material. By using SDS to dissolve the cell and chloroform and isoamylol to extract, the gnomic DNA and RNA can be successfully obtained. The DNA and RNA are separated by the concentration of NaCl. The ultraviolet spectrophotometry is used to determine the content and purity.Key words: nucleic acid; DNA; ultraviolet spectrophotometry; diphenylamine核酸通常与蛋白质结合形成核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、传递生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，在生物的生长、遗传、变异等生命过程中起着重要的决定作用。
DNA提取实验
DNA提取实验DNA提取是现代生物学研究的基础实验之一，它可以从生物体内分离和纯化DNA分子，为各种分子生物学技术和研究提供重要的基础。
本实验旨在介绍DNA提取的基本步骤和操作技巧。
材料和仪器：1. 新鲜的生物样本（如水果、蔬菜、口腔拭子等）2. DNA提取试剂盒3. 离心管4. 加热器5. 离心机6. 显微镜实验步骤：1. 样本处理：a) 将生物样本取出，如水果则切成小块，口腔拭子可直接使用。
b) 将样本放入离心管中。
c) 使用试剂盒提供的试剂，在样本中加入适量的细胞裂解缓冲液。
d) 轻轻摇动离心管，使样本与缓冲液均匀混合。
e) 将离心管放入加热器中，在60摄氏度恒温加热20-30分钟，以促进细胞的破裂和DNA的释放。
2. 细胞裂解：a) 将加热后的样本离心管取出，稍微晃动离心管使样本充分混合。
b) 加入适量的蛋白酶，用离心管盖密封离心管，并再次摇动离心管混合。
c) 将离心管放入加热器中，以高温（通常为60-65摄氏度）恒温孵育10分钟，以使蛋白酶发挥作用，降解细胞蛋白。
3. DNA沉淀：a) 将加热后的样本离心管取出，加入等体积的冷异丙醇，并摇动离心管使两者充分混合。
b) 将混合溶液离心10-20分钟，以最大速度离心沉淀DNA。
c) 抽掉上层溶液，离心沉淀的DNA。
d) 加入适量的70%乙醇洗涤一次，以去除残留的盐和其他杂质。
e) 将离心管倒置于纸巾上，待乙醇挥发后，加入适量的去离子水重新溶解DNA。
4. DNA纯化：a) 使用显微镜观察提取的DNA溶液中是否有明显的纹理和颜色，以确保DNA提取的成功。
b) 使用测量纯度和浓度的仪器对提取的DNA进行定量分析，并记录结果。
c) 将DNA溶液保存在低温冷冻条件下，以防止DNA的降解和损伤。
实验注意事项：1. 实验前需佩戴实验手套和口罩，防止污染和细菌感染。
2. 操作过程中需注意无菌操作，避免污染。
3. 实验前要确保所有仪器和材料已经正确消毒和清洗。
DNA分离方法
一、分离与纯化的方法双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子，可用于重现犯罪现场和进行古生物学分析。
但由于是很长的线性分子（如人的染色体DNA平均长度为100～150Mb）而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。
在溶液中，由于碱基堆砌力的相互作用与磷酸基团的静电排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很难溶解，而且也增加了它对剪切力的敏感性。
即便是最轻柔的方式，高分子量的DNA也很容易因剪切力发生横向的断裂。
常规方法分离基因组DNA时，大于150kb的DNA分子很容易发生断裂。
（一）酚抽提法本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改进，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA 样品。
其中，EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DN A酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性；SDS为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质，与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀，其非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性、解聚，所以SDS同时还有降解DNA酶的作用；无DN A酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用；酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。
多次抽提可提高DNA的纯度。
一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。
透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量DNA。
沉淀处理常以醋酸铵为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100kb～150kb。
运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10mg至大到数百mg的DNA样品。
基因组DNA的分离与纯化
蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA 酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用；酚 可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性； pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相， 而避免滞留于蛋白质层。 • 多次抽提可提高DNA的纯度。一般在第三次抽 提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。 透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得 到200kb的高分子量DNA。沉淀处理常以醋酸铵 为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70% 的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100kb～ 150kb。
基因组DNA的分离与纯化
分离与纯化的方法
• • • • 一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、DNA样品的进一步纯化
分离与纯化的方法
• 双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强 的化学分子，可用于重现犯罪现场和进行古生 物学分析。但由于是很长的线性分子（如人的 染色体DNA平均长度为100～150Mb）而且缺 乏横向的稳定性，因此很容易断裂。在溶液中， 由于碱基堆砌力的相互作用与磷酸基团的静电 排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很难溶 解，而且也增加了它对剪切力的敏感性。即便 是最轻柔的方式，高分子量的DNA也很容易因 剪切力发生横向的断裂。常规方法分离基因组 DNA时，大于150kb的DNA分子很容易发生断 裂。
• 运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜 组织及血液标本中制备少于10mg至大到数百mg 的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切 力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过 100kb～150kb的很少，但这种大小的DNA足以 作为PCR反应的模板和进行Southern blotting 分析以 胞（如HeLa细胞）大约可以制备分子量在 100kb～150kb的DNA 200mg，自20胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制 备分子量大于200kb的DNA。该法的细胞裂解 与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽 提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质 的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充 分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种 离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合 物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白 酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤 其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般 可以大于200kb。
实验一 全基因组DNA的分离及纯化
实验一全基因组DNA的分离及纯化由于分离线粒体DNA繁琐、耗时、成本相对较高，目前很多研究采用先分的全基因组DNA，再用特异的引物扩增线粒体基因组的方法，因此获得高纯度全基因组DNA显得尤为重要。
现在有很多的商品化试剂盒可以快速高效的从血液，组织中提取基因组DNA，简便快捷，DNA的得率和纯度都很高。
我们就TaKaRa DNA提取试剂盒为例，介绍外周静脉血全基因组DNA提取的操作流程。
目的：掌握试剂盒提取外周血细胞基因组DNA的方法。
原理：本试剂盒是用于动物组织、植物材料、全血和培养细胞（Animal tissues/Plants/Blood/Cultured cells）等全基因组DNA的广谱型小量纯化试剂盒。
该试剂盒采用独特的细胞裂解系统，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖以及脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化基因组DNA。
本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，全套操作约需1小时便可完成。
使用本试剂盒可从1～100 mg 的动物组织、10～200 mg的植物材料、10～200 μl的全血（含抗凝剂）、105～107的培养细胞中纯化得到多至数十微克的高纯度基因组DNA。
此基因组DNA可用于PCR反应、Southern 杂交以及RAPD、AFLP、RFLP等多种分子生物学实验。
试剂：该DNA提取试剂盒包括：试剂Set （表4-1）和Column Set（表4-2）。
表4-1 DNA提取试剂盒试剂试剂Set试剂名称体积RNase A1（50 mg/ml）*1 65μlSolution A*2 45 mlSolution B*2 24 mlSolution C原液*3 1.1 mlDB Buffer 24 mlRinse A 28 mlRinse B*4 24 mlElution Buffer 12 ml注：*1 RNase A1为混浊溶液，使用时请混匀后使用。
水稻基因组DNA提取，PCR，纯化分子生物学实验报告
分子生物学实验报告实验内容：设计一个完整的实验，以水稻基因组为例，最终得到纯化的一个基因片段。
水稻基因组DNA提取以及基因片段的扩增、纯化和检测1.实验目的：1.1 熟练掌握实验室分子生物学相关的仪器的规范使用方法1.2 遵守实验室相关的实验规章制度，服从实验人员的管理1.3 熟练掌握实验室有关植物基因组DNA的简单提取方法以及检测方法1.4 了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握胶体制备的方法以及电泳仪的操作方法1.5 掌握PCR技术的操作流程，熟练使用PCR仪并了解其工作原理及检测方法1.6 了解柱纯化的原理及使用方法2.实验原理1）水稻叶片基因组DNA提取水稻属于真核生物，其DNA以双链线性高分子形式存在于细胞核中，一般以染色质形式在。
由于植物组细胞破裂之后，DNA酶会水解DNA因此在提取过程总要加入EDTA螯合剂从而抑制DNA酶活性。
水稻叶片基因组DNA的提取主要是通过破碎组织和细胞从而通过对细胞内其他杂质的去处来达到基因组DNA的提纯。
提纯的产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验。
本实验是通过CTAB法来进行提取的，它是一种阳离子表面活性剂，能溶解细胞膜和和核膜蛋白，使核蛋白解聚从而使DNA游离出来，已达到分离的目的。
2）特定基因片段的PCR扩增PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。
它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在95℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经30轮循环就可使DNA扩增上百倍。
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实验一全基因组DNA的分离及纯化
由于分离线粒体DNA繁琐、耗时、成本相对较高，目前很多研究采用先分的全基因组DNA，再用特异的引物扩增线粒体基因组的方法，因此获得高纯度全基因组DNA显得尤为重要。
现在有很多的商品化试剂盒可以快速高效的从血液，组织中提取基因组DNA，简便快捷，DNA的得率和纯度都很高。
我们就TaKaRa DNA提取试剂盒为例，介绍外周静脉血全基因组DNA提取的操作流程。
目的：掌握试剂盒提取外周血细胞基因组DNA的方法。
原理：本试剂盒是用于动物组织、植物材料、全血和培养细胞（Animal tissues/Plants/Blood/Cultured cells）等全基因组DNA的广谱型小量纯化试剂盒。
该试剂盒采用独特的细胞裂解系统，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖以及脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化基因组DNA。
本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，全套操作约需1小时便可完成。
使用本试剂盒可从1～100 mg 的动物组织、10～200 mg的植物材料、10～200 μl的全血（含抗凝剂）、105～107的培养细胞中纯化得到多至数十微克的高纯度基因组DNA。
此基因组DNA可用于PCR反应、Southern 杂交以及RAPD、AFLP、RFLP等多种分子生物学实验。
试剂：该DNA提取试剂盒包括：试剂Set （表4-1）和Column Set（表4-2）。
表4-1 DNA提取试剂盒试剂试剂Set
试剂名称体积
RNase A1（50 mg/ml）*1 65μl
Solution A*2 45 ml
Solution B*2 24 ml
Solution C原液*3 1.1 ml
DB Buffer 24 ml
Rinse A 28 ml
Rinse B*4 24 ml
Elution Buffer 12 ml
注：*1 RNase A1为混浊溶液，使用时请混匀后使用。
*2 若出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。
*3 首次使用前，请将1.1 ml的Solution C原液移入125 ml的Solution C空瓶中，然
后加入68.75 ml的异丙醇、41.25 ml的异丁醇，混合均匀，配制成Solution C溶液后使用。
Solution C溶液请于4℃保存。
*4 首次使用前，请添加56 ml的100%乙醇，混合均匀。
表4-2 DNA提取试剂盒Column Set
试管名称数量
Filter Cup 50 支
Spin Column 50 支
Collection Tube（2 ml）150 支
操作步骤：
1）①取10～250 μl的全血（含抗凝剂）加入至Collection Tube中。
②加入500 μl的Solution A。
③加入1 μl的RNase A1（使用时请混匀），激烈振荡15秒后，冰浴5分钟。
2）加入400 μl的Solution B，振荡混合。
3）加入1 ml的4℃预冷的Solution C溶液，充分混匀后，12,000 rpm离心3分钟。
注）Solution C溶液的制备方法请见第一页中的说明。
4）弃去上层有机相，再加入1 ml的4℃预冷的Solution C溶液，充分混匀后12,000rpm离心3分钟。
5）弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于Collection Tube 上的Filter Cup中，12,000 rpm离心1分钟。
6）弃Filter Cup，在滤液中加入400 μl的DB Buffer，混合均匀。
7）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
将上述操作6混合溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
8）将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
9）将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
10）重复操作步骤9。
11）将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。
12）将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜中央处加入50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
13）12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
图4-1 试剂盒提取全基因组DNA操作流程图
利用该试剂盒可以从200 μl的外周血中提取1.0 μg左右较高纯度的全因组DNA(包括核基因组DNA和线粒体基因组DNA)。
相对来说，采用试剂盒提取全
基因组DNA成本较高。