ELISA
简述elisa的四种方法类型
简述elisa的四种方法类型
Elisa（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种受抗原特异性抗体促进酶链反应的免疫分析技术，应用非常广泛。
其中有四种主要类型：
1、酶连接免疫吸附试验（ELISA）：该类型ELISA以抗原为靶，以特异性抗体为解链剂，可以用于研究特定抗原之间的关系、表达以及联合的特性以及确定平衡状态。
2、双抗体免疫吸附试验（DASA）：该类型ELISA以抗原抗体复合物作为靶，应用特异性抗体进行解链，用于研究抗原-抗体复合物表达以及复合物稳定性，可用来测定特定抗原和抗体复合物的浓度。
3、酶联抗原免疫吸附试验（ELISA）：该类型ELISA是检测特定抗原的浓度，而不是其抗体复合物的浓度。
它利用特异性抗体识别特定抗原，并结合酶，加以反应以发出光学信号，从而实现抗原浓度的检测。
4、双抗体完全免疫吸附试验（DIAS）：这种ELISA技术中，使用一种特异性抗体与抗原结合以形成抗原抗体复合体，而另一种特异性抗体可以与该复合体结合，得到抗体抗体复合物以及特定浓度的抗原-抗体复合物，可用来研究特定抗原的表达率和稳定性。
elisa标准曲线
elisa标准曲线Elisa标准曲线。
Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的实验技术，其原理是利用酶标记的抗体与待检测物质结合，通过底物的酶促反应来检测待测物质的含量。
在Elisa实验中，标准曲线是非常重要的，它可以用来定量测定待测物质的浓度，为实验结果的准确性提供保障。
一、标准曲线的制备。
制备Elisa标准曲线的第一步是准备一系列已知浓度的标准溶液。
这些标准溶液的浓度应当覆盖待测物质的预计浓度范围，通常会选择一个对数级数，以便后续的数据处理。
接下来，将这些标准溶液按照一定比例加入Elisa板中的孔中，然后进行相应的实验操作，最终得到各标准溶液对应的光吸收值。
二、绘制标准曲线。
通过测定各标准溶液的光吸收值，我们可以得到一组数据点，其中横坐标为标准溶液的浓度，纵坐标为对应的光吸收值。
接下来，利用这些数据点可以绘制出标准曲线，通常采用线性回归分析的方法，得到一条直线方程，用以描述浓度与光吸收值之间的关系。
标准曲线的斜率和截距分别代表了待测物质的浓度与光吸收值之间的线性关系，通过这条标准曲线，我们可以根据待测样品的光吸收值，反推出其浓度。
三、标准曲线的应用。
标准曲线在Elisa实验中起着至关重要的作用。
首先，它可以用来定量测定待测物质的浓度，通过对待测样品的光吸收值进行测定，然后通过标准曲线反推出其浓度，从而实现对待测物质的定量分析。
其次，标准曲线还可以用来评估实验的准确性和可靠性，如果标准曲线的相关系数R²接近于1，表明实验数据符合良好的线性关系，说明实验结果可信度较高。
最后，标准曲线还可以用来进行质量控制，监测实验过程中的误差和偏差，确保实验结果的准确性和可重复性。
四、注意事项。
在制备和应用标准曲线的过程中，有一些注意事项需要特别注意。
首先，标准曲线的制备过程中，应当严格按照实验操作规程进行，确保标准溶液的浓度准确无误。
其次，在绘制标准曲线时，应当选择合适的数据处理方法，确保得到的标准曲线具有良好的线性关系。
ELISA方法的及步骤
ELISA方法的及步骤
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay）是一种免疫分析的方法，也叫酶标免疫分析，是在免疫学及其它生物领域中常用的分析技术，通过酶，抗体和抗原等物质的反应来测定其中一种物质的存在量及含量。
1、准备样品
首先将样品放入微孔板中，根据所需的数量准备多个样品，如果样品太浓，可以把它们降解成所需的浓度；如果样品太稀，可以根据需要加以稀释。
2、准备抗体和抗原
分别准备抗体和抗原，其中抗体是用来特异性结合抗原的，并起到抗原的定位、分析的作用，而抗原是根据需要溶解在其中一种介质(Buffer Solution)中，通常是立即使用；如果出于其中一种原因不能立即使用，可以先保存冰上，在使用前加热到室温。
3、准备链式反应物
将抗体和抗原分别加入微孔板中，同时把链式反应物加入微孔板中，链式反应物也叫链式抗体，可以促进抗体和抗原之间的反应，一般抗体和抗原均可与链式反应物发生反应，这样可以提高反应的准确性及灵敏度。
4、酶标偶联反应
将已准备的样品、抗体、抗原和链式反应物放入微孔板中，用摇床摇匀即可进行酶标偶联反应，反应的原理是：抗体和抗原发生特异性结合，当抗体和抗原结合后，其中的链式反应物与抗原结合。
Elisa
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1.4.2 间接法
是检测抗体最常用的方法 原理为利用酶标记的抗原抗体（抗人免疫球蛋白抗体） 以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
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目 录
1.概念
一
二 三 四
ELISA的基础
ELISA所需条件
2.原理 3.特点
4.分类
ELISA实验步骤 常见问题解答
3
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1.1 ELISA 的概念
指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载 体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定 性和定量检测方法。
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3.1 实验前准备
②
试剂的准备： 20x 洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1:20 稀释，即 1 份的 20x 洗涤
缓冲液加 19 份的蒸馏水。
③
洗板： 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽
夹心法（测抗原、抗体） 间接法（测抗体） 竞争法（测抗原） ABS-ELISA 法（测抗原、抗体）
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1.4.1 夹心法
双抗体夹心法测抗原
双抗原夹心法测抗体
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ELISA原理和应用
ELISA原理和应用
ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay），又称酶联免疫吸附
测定法（ELISA），是一种常用的免疫分析学和生物化学技术，它利用特
异性抗体与抗原结合，并用酶促化学反应检测的方法来测定抗原或抗体的
浓度；便携式ELISA试剂盒则可广泛应用于食品、产品、环境等检测现场，便捷性更能满足现行监管检测的要求。
ELISA技术的发展，使得免疫检测
变得更为快捷、准确、方便，大大节省了成本，得到广泛应用。
1.抗体-抗原结合：ELISA最重要的部分，也是最关键的部分，是一
个特异性的免疫反应。
在被检样品中，抗原可以通过特异性的抗体被特异
性结合；
2. 酶-底物反应：在ELISA技术中，一般采用酶-底物 colorimetric 反应，抗原和抗体结合后，将起作用的酶连接到抗体上，从而发生底物和
酶的反应。
底物将引发酶反应，将颜色发生一个变化。
无论酶浓度多少，
使得颜色的变化可以测定；
3.度量反应：一般有两种反应测定方法，即光度测定法、仪器检测法，可以测定抗原或抗体的浓度，从而得出最终的结果。
elisa的名词解释
elisa的名词解释
ELISA是酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简称，是免疫学中的一种技术，用于检测特异性抗体或抗原的免疫反应。
ELISA是一种灵敏、快速、特异的检测方法，广泛应用于生物医学领域，如感染性疾病的诊断、免疫学研究、药物筛选等。
ELISA的基本原理是将抗原或抗体吸附到固相载体表面，加入酶标记的抗体或抗原，加入底物显色，根据颜色反应判断是否含有待测抗原或抗体。
ELISA有多种类型，如直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA 等。
其中夹心ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是最常用的一种，它通过将抗原或抗体结合到酶标板上，再加入待测抗体或抗原，最后加入底物显色，根据颜色反应判断是否含有待测抗原或抗体。
ELISA具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点。
然而，ELISA也存在一些局限性，如操作繁琐、需要专业人员操作、试剂成本高等。
此外，由于ELISA只能检测特异性抗体或抗原，因此不能用于检测非特异性免疫反应。
ELISA基础知识
（二抗） 二抗）
7.洗涤 8.加底物显色 9.观察结果
夹心法
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检样本，保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物 。洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结 合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量正相关。 4）加底物显色。
尽量避免酶标板叠放在一起 定期校准移液器， 定期校准移液器，确保移液器的正 确使用 酶标板用封条密封或者加盖 确定正确的洗板步骤 读板时清理干净酶标板底部
ELISA操作过程中可能遇到的问题 操作过程中可能遇到的问题
问题 可能的原因
试剂或者耗材污染 阴性对照产生了阳性的 结果 洗板出现问题 使用了过多的抗体 二抗产生了非特异性吸附 显色液不新鲜 显色反应时间过长没有终止 整板出现高背景 试剂或者耗材污染 反应温度过高导致的非特异性吸附 封闭条件不佳导致的非特异性吸附
10X PBS Tween 1X PBST (20%Tween) 10X CBS 包被缓冲液） （包被缓冲液） 1X CBS
室温 室温
3个月 3个月
表面活性剂。去垢剂的作用， 表面活性剂。去垢剂的作用，使蛋白质之间的非特 异性结合减弱，从而降低实验背景。 异性结合减弱，从而降低实验背景。 作用：降低背景。若含Tween太高， Tween太高 作用：降低背景。若含Tween太高，致使抗原抗体的 特异性结合也被减弱，从而影响结果。 特异性结合也被减弱，从而影响结果。 碳酸盐缓冲液 PH=9.6 包被可溶性蛋白， 包被可溶性蛋白，便于蛋白质吸附到酶标板上 碳酸盐缓冲液
牛奶 1：2500
ELISA的原理和类型
ELISA的原理和类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常见的免疫学实验技术，用于检测和诊断环境样品、食物、血液以及其他生物样品中的特定分子（如蛋白质、抗体、抗原等）。
ELISA具有高灵敏度、高特异性和较低的成本，广泛应用于医学、农业、环境科学和食品工业等领域。
间接式ELISA是最常用和经典的类型，其原理基本分为四步：1.固相吸附：将待测抗原分子固定在微孔板上，一般使用多孔质料（如聚合物）涂覆表面。
2.阻塞：为了防止非特异性结合，可以在固相吸附的基础上加入一层非特异性蛋白质（如牛血清白蛋白，BSA）来阻止未被抗原结合的空位。
3.特异性抗体结合：在孔中加入与抗原特异性结合的抗体，抗体会和已固定的抗原结合形成抗原-抗体复合物。
4.标记酶和底物检测：将酶标记的二级抗体加入孔中，与特异性抗体结合，再加入一种底物，使酶发生反应，并产生可观察的信号，如颜色反应。
夹心ELISA和间接式ELISA的步骤类似，但有所区别。
夹心ELISA在特异性抗体结合前和后都进行了固相吸附，因此可以检测出更弱的信号。
夹心ELISA也有更高的特异性，因为特异性抗体的结合位置被抗原所固定。
竞争ELISA用于测量待测样品中特定抗原的浓度。
与其他ELISA类型不同的是，竞争ELISA中待测物和标准抗原竞争与已固定抗原的特异性抗体结合。
待测样品中特定抗原的浓度越高，抗原与抗体结合的信号就越弱。
竞争ELISA的原理和标准曲线相关，用标准曲线中不同抗原浓度对应的信号强度来计算待测物的浓度。
直接ELISA是一种较少使用的类型，它通过直接将酶标记的特异性抗体与待测抗原结合，然后检测酶标记物的反应来获得结果。
直接ELISA省略了二级抗体的使用，所以比其他类型的ELISA快速，但灵敏度较低。
ELISA技术的应用范围非常广泛，如检测疾病诊断和筛查、食品卫生检测、生物制药质量控制以及环境监测等。
它通过测量特定分子的浓度，可以定量评估样品中待测物的含量，从而实现对疾病、食品质量或环境污染的检测、监测和控制。
ELISA技术方法原理
活化底物的酶标记
活化底物是通过酶标记进行标记，当底物与酶结合发生反应时，会产生可检测的信号，常用的酶包括酶联脱氧 核糖核酸酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
酶反应及其测定
酶反应通过底物与酶的催化活性产生染色反应，染色强度与样品中目标分子的数量成正比，可通过测定光密度 或荧光强度进行定量分析。
ELISA技术方法原理
ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的生物化学检测方法，用于检测抗 原或抗体的存在。
ELISA技术简介
ELISA技术是一种敏感、特异和可定量测定抗原或抗体的方法，被广泛应用于 医学、生物学、食品安全等领域。
ELISA技术原理介绍
ELISA基于抗原与抗体的特异性结合，通过酶标记底物的反应生成可测量的信 号，用以判定样品中目标分子的存在。
间接ELISA和夹心ELISA
间接ELISA通过先结合捕获抗体，再结合检测抗体实现对目标分子的检测。夹 心ELISA在间接ELISA的基础上增加了捕获抗体与检测抗体之间的结合。
双抗夹心ELISA和竞争ELISA
双抗夹心ELISA通过同时结合捕获抗体和检测抗体，形成三重结合复合物。竞 争ELISA中，样品中的抗原与标准品之间竞争结合检测抗体，用以定量测定抗 原含量。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定抗原或抗体。
本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA操作步骤，以确保实验结果的准确性和可重复性。
二、材料和试剂准备1. 微孔板：96孔的酶联免疫吸附板。
2. 样本：待测试的生物样本，如血清、尿液等。
3. 标准品：已知浓度的目标抗原或抗体。
4. 缓冲液：适用于特定ELISA试剂盒的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）。
5. 洗涤缓冲液：含有洗涤剂的缓冲液，如PBS-T（磷酸盐缓冲液-0.05% Tween-20）。
6. 酶标记的二抗：与目标抗原或抗体特异性结合的二抗，如HRP（辣根过氧化物酶）标记的抗人IgG。
7. 底物：与酶标记结合并产生可测量信号的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶液。
8. 停止液：用于停止底物反应的溶液，如2M硫酸。
三、操作步骤1. 准备微孔板a. 将微孔板放置在工作台上。
b. 标记每个孔的编号，以便记录结果。
c. 添加适量的样本和标准品至不同的孔中，每个孔的体积应相同。
d. 添加适量的缓冲液至空白对照孔中。
2. 孵育a. 将微孔板盖好，使用封闭膜密封。
b. 将微孔板置于恒温孵育箱中，在适当的温度下孵育一段时间，通常为1小时。
3. 洗涤a. 将微孔板倒置，轻轻拍打以除去孔内液体。
b. 使用洗涤缓冲液，将每个孔洗涤3-4次，每次洗涤约200μL。
c. 在洗涤完成后，轻轻拍打微孔板以除去多余的洗涤缓冲液。
4. 添加酶标记的二抗a. 加入适量的酶标记的二抗至每个孔中，注意避免交叉污染。
b. 盖好微孔板，继续在恒温孵育箱中孵育一段时间，通常为1小时。
5. 再次洗涤a. 重复第3步的洗涤步骤，确保洗净未结合的二抗。
6. 底物反应a. 加入适量的底物（TMB溶液）至每个孔中。
b. 在暗处孵育一定时间，通常为15-30分钟，直至产生明显的颜色反应。
ELISA原理
1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。
4.酶催化底物并显色。
抗原
固相载体
双抗原夹心法示意图
酶
抗抗 体
酶标记 抗抗体
抗体
1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结 合为抗原-抗体-酶标记抗抗体 复合物。
• 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
显色
• 显色是酶催化无色的底物生成有色产物 的温育反应。反应的温度和时间仍是影 响显色的因素。在一定时间内，阴性孔 可保持无色，而阳性孔则随时间的延长 而呈色加强。适当提高温度有助于加速 显色进行。
比色
• 拭干板底附着的液体，然后将板正确放 入酶标比色仪中。
• 均相EIA可不需进行游离的和结合的标记 物的分离而直接测定标记物。均相EIA在 临床检验中较少应用。
• 非均相EIA需先进行游离的和结合的标记 物的分离。
这种固相免疫酶测定方法在1971年最初 建立时称为酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay），简称 ELISA。
• （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； • （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； • （3）酶的底物； • （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； • （5）结合物及标本的稀释液； • （6）洗涤液； • （7）酶反应终止液
免疫吸附剂
• 固相载体--聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能， 抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活 性。
• 所有的ELISA固相均需封闭。
ELISA知识简介
其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原 结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少， 因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直 接包被固相。
如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包 被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形 成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标 抗体进行竞争结合反应。
图3 甲型肝炎病人血清中IgG抗体和IgM 抗 体出现的时间和水平。
每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将 多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体，将由多 系的B细胞产生相应的多种抗体，这些抗体均存在于免疫 血清中。
免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马 制得。产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞 融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体 外培养而分泌的抗体单克隆抗体monoclonal antibody， McAb或Mab）。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有 很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将 免疫的脾细胞（含产生抗体的B细胞）与小鼠肿瘤细胞融 合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含 有浓度很高的单克隆抗体。
1.3.2 最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物.
抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zone of quivalence）。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带 。
如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定 中称为带现象（zone nomenon）。抗体过量称为前带（ prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学 方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测 得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。
ELISA原理和分类(附图解)
一、ELISＡ旳原理ELIＳA旳基础是抗原或抗体旳固相化及抗原或抗体旳酶标记。
结合在固相载体表面旳抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记旳抗原或抗体既保存其免疫学活性，又保存酶旳活性。
在测定期,受检标本(测定其中旳抗体或抗原）与固相载体表面旳抗原或抗体起反映。
用洗涤旳措施使固相载体上形成旳抗原抗体复合物与液体中旳其他物质分开。
再加入酶标记旳抗原或抗体，也通过反映而结合在固相载体上。
此时固相上旳酶量与标本中受检物质旳量呈一定旳比例。
加入酶反映旳底物后,底物被酶催化成为有色产物，产物旳量与标本中受检物质旳量直接有关,故可根据呈色旳深浅进行定性或定量分析。
由于酶旳催化效率很高,间接地放大了免疫反映旳成果,使测定措施达到很高旳敏感度。
二、EＬISA旳类型ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。
在这种测定措施中有三个必要旳试剂:(1)固相旳抗原或抗体,即＂免疫吸附剂＂（immunoｓorbｅnｔ)；（2)酶标记旳抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conｊugate）；（3)酶反映旳底物。
根据试剂旳来源和标本旳状况以及检测旳具体条件,可设计出多种不同类型旳检测措施。
用于临床检查旳ELＩS Ａ重要有如下几种类型:（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用旳措施,操作环节如下：(1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。
洗涤除去未结合旳抗体及杂质。
（2) 加受检标本,保温反映。
标本中旳抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
(3) 加酶标抗体,保温反映。
固相免疫复合物上旳抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合旳酶标抗体。
此时固相载体上带有旳酶量与标本中受检抗原旳量有关。
(4) 加底物显色。
固相上旳酶催化底物成为有色产物。
通过比色,测知标本中抗原旳量。
在临床检查中，此法合用于检查多种蛋白质等大分子抗原，例如HB ｓＡｇ、HBeAg、ＡFＰ、ｈＣG等。
只要获得针对受检抗原旳异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
ELISA知识简介PPT课件
总结与展望：ELISA技术发展趋 势预测
2024/1/26
28
新型标记物在ELISA中应用前景探讨
荧光标记物
高灵敏度、宽线性范围，适用于低丰度蛋白检测 。
酶标记物
高催化活性，可放大信号，提高检测灵敏度。
纳米材料标记物
独特的光学、电学性质，可增强信号并降低背景 干扰。
2024/1/26
29
2024/1/26
肿瘤治疗监测
利用ELISA技术监测肿瘤患 者治疗过程中肿瘤标志物 的变化，评估治疗效果和 预后。
肿瘤复发监测
定期采用ELISA方法检测肿 瘤患者康复期肿瘤标志物 的水平，及时发现肿瘤复 发迹象。
16
药物滥用检测中ELISA方法应用
毒品滥用检测
采用ELISA技术检测尿液或血液中的毒品代谢物，如吗啡、可卡 因等，用于毒品滥用的筛查和确认。
多重检测技术在提高通量方面优势分析
1 2
多通道检测
同时检测多个样本，提高检测效率。
多重荧光标记
实现多目标蛋白同时检测，减少实验误差。
3
微流控芯片技术
集成化、微型化，降低样本消耗和检测成本。
2024/1/26
30
自动化和智能化设备在ELISA领域应用前景
自动化样本处理
减少人工操作，提高实验可重复性。
等疾病。
2024/1/26
03
其他自身抗体检测
ELISA还可应用于抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）、抗磷脂抗体（
APL）等自身抗体的检测，为自身免疫性疾病的诊断提供依据。
15
肿瘤标志物筛查与监测进展
肿瘤标志物筛查
采用ELISA方法检测肿瘤标 志物，如AFP、CEA、 CA19-9等，实现肿瘤的早 期发现和筛查。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在。
本操作规程旨在提供一个详细的步骤指南，以确保ELISA实验的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 微孔板：96孔的高吸附微孔板。
2. 缓冲液：含有适当浓度的PBS（磷酸缓冲盐溶液）和BSA（牛血清白蛋白）的缓冲液。
3. 标准品：包含已知浓度的抗原或者抗体的标准品。
4. 样品：待测的抗原或者抗体样品。
5. 探针：与待测物相对应的酶标记抗体。
6. 底物：适当的酶底物。
7. 住手液：住手底物反应的液体。
三、实验步骤1. 准备工作a. 将微孔板标记好，以便识别每一个孔。
b. 准备所需的缓冲液，并将其加热至适当的温度。
c. 将标准品和样品稀释至适当的浓度。
2. 涂覆抗原或者抗体a. 向微孔板中加入适量的抗原或者抗体溶液。
b. 将微孔板密封，并在4℃下孵育一夜。
c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。
3. 阻断非特异性结合位点a. 向微孔板中加入适量的缓冲液。
b. 将微孔板密封，并在室温下孵育1小时。
c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。
4. 加入探针a. 向微孔板中加入适量的探针溶液。
b. 将微孔板密封，并在室温下孵育1小时。
c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。
5. 应用底物a. 向微孔板中加入适量的底物溶液。
b. 将微孔板密封，并在室温下孵育适当的时间。
c. 加入适量的住手液住手反应。
6. 测量吸光度a. 使用ELISA阅读器测量每一个孔的吸光度值。
b. 记录吸光度值，并进行数据分析。
四、数据分析1. 标准曲线绘制a. 使用已知浓度的标准品制作一系列稀释液。
b. 测量每一个稀释液的吸光度值。
c. 将吸光度值绘制成标准曲线。
2. 计算样品浓度a. 使用标准曲线确定样品的浓度。
b. 根据实验需求，可以使用线性回归或者其他适当的计算方法。
五、实验注意事项1. 所有操作应在洁净的实验室环境下进行，以避免污染。
ELISA操作流程
ELISA操作流程ELISA（受体结合酶联免疫吸附检测）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测生物样品中特定抗原或抗体的存在。
该技术主要基于抗原-抗体特异性结合的原理，结合酶的反应可使目标分子在颜色、荧光或发光等性质上发生变化，从而实现定量或半定量的检测。
下面是ELISA的操作流程：1.涂布酶标板：将特异性或捕获性抗体溶液加入酶标板孔中，并在孔底表面吸附，形成抗体层，常用的方法为静置法或旋涂法。
吸附抗体的选择要考虑其特异性、纯度和稳定性。
2.阻断：在涂布之后，使用适当的阻断缓冲液封闭剩余的吸附位点，以避免非特异性结合。
3.样品孔：在吸附抗体的孔中加入待测样本，如血清、尿液或细胞培养上清。
一般来说，样品应该先经过稀释，以便在酶标板上形成可测的信号。
为了获得准确的结果，通常要进行样品的多倍稀释。
4.洗涤：通过将酶标板孔填满洗涤缓冲液，轻轻摇晃或用洗板机进行洗板，以洗去未固定的样品和其他成分。
洗涤过程至少重复3次，以确保非特异性结合物质的彻底去除。
5.次级抗体：将标记有酶的次级抗体加入孔中，使其与样品中的目标抗原或抗体结合。
次级抗体可以是针对特定物种IgG的抗血清，或是针对相对特异性的抗体，如蛋白A/G。
6.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
7. 底物加入：向每个孔中加入染色底物，如TMB （tetramethylbenzidine），底物与酶反应后会在颜色上发生可见变化。
对于荧光ELISA或发光ELISA，将相应的底物加入。
8.反应停止：添加停止剂，如硫酸或酸，以停止酶的反应。
底物反应停止后，颜色会停在一定的反应时间点处。
9. 读取结果：通过光谱分析，使用酶标仪测定吸光度或荧光/发光的强度，以检测抗原或抗体的存在。
吸光度（Absorbance）与目标物质的浓度成正比。
10.数据分析：计算各标准品的吸光度值和待测样品的吸光度值，根据标准曲线或内部对照，计算出待测样品中目标物质的浓度。
总结：ELISA技术广泛用于生物医学研究和临床诊断，其操作流程简洁明了，通常需要进行涂布、阻断、样品孔、洗涤、次级抗体、底物加入、反应停止和结果读取等步骤。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的方法。
ELISA技术可广泛应用于医学、生物学、农业和环境科学等领域，具有高灵敏度、高特异性和高通量的优点。
直接ELISA是最简单的一种ELISA形式，其中将特异性抗体直接固定在微孔板上，然后加入样品，特异性抗原与固相抗体结合，并使用标记的二抗或酶偶联的二抗进行检测。
标记的二抗与样品中的抗原结合，从而实现抗原的检测。
间接ELISA类似于直接ELISA，但使用的是一种抗体，该抗体不与待检测抗原直接结合，而是与特异性抗体结合。
首先，特异性抗体被固定在微孔板上，然后样品中的抗原经过结合，在该阶段，非特异性蛋白质将被洗掉。
接下来，加入与待测抗原特异性结合的二抗。
最后，使用标记的二抗或酶偶联的二抗进行检测，以确认待测抗原的存在。
竞争ELISA用于检测分析物，如细胞因子、激素或抗生素等。
在该方法中，待检测抗原被固定在微孔板上，标记的分析物样品添加到孔中，这些样品中的分析物会与待测抗原竞争结合到固定的抗体上。
最后，通过测量分析物与固定抗体的竞争程度，来确定分析物的浓度。
间接竞争ELISA则结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理，主要用于检测抗体的含量。
在该方法中，先固定检测抗体在微孔板上，再加入不同浓度的标准抗体或待测抗体样品。
标准或待测抗体与固定的检测抗体竞争结合，最终通过测量标准或待测抗体与检测抗体的竞争程度，来确定抗体的含量。
1.用特异性抗体涂覆固定在微孔板上，这可以通过免洗、半干燥或吸附方式实现。
2.加入样品，让待测抗原与固定在板上的特异性抗体结合。
3.洗涤板子以去除非特异性蛋白质，以减少干扰。
4.添加二抗或酶偶联的二抗，它会与待测抗原特异性结合。
5.再次洗涤板子以去除未结合的二抗。
6.加入底物，底物受酶的作用而发生颜色变化。
7.加入终止液以停止反应。
elisa方法
elisa方法Elisa方法是一种广泛应用于生物医学研究领域的实验技术，它的全称是Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，即酶联免疫吸附实验。
Elisa方法通过特定的抗体-抗原相互作用来检测样本中特定分子的存在，因此在临床诊断、生物学研究和药物开发等领域都有重要应用价值。
本文将从Elisa方法的原理、步骤和应用领域等方面进行介绍。
首先，Elisa方法的原理是基于酶标记的免疫反应。
在Elisa实验中，将待检测的抗原或抗体与固相载体结合，形成固相抗原或抗体。
然后，加入特异性的酶标记二抗或酶标记抗原，使其与待检测的抗原或抗体结合形成酶标记的免疫复合物。
最后，通过酶底物的作用来检测酶的活性，从而间接检测待检测物质的存在。
Elisa方法的步骤一般包括固相吸附、非特异性结合位点的封闭、特异性抗原或抗体的结合、酶标记的二抗或抗原的结合、底物的作用和测定。
其中，固相吸附是将待检测的抗原或抗体吸附在固相载体上，而非特异性结合位点的封闭则是为了防止非特异性结合的干扰。
特异性抗原或抗体的结合是Elisa方法的核心步骤，它决定了实验的灵敏度和特异性。
酶标记的二抗或抗原的结合是为了增强检测的信号，底物的作用和测定则是通过测定酶的活性来间接检测待检测物质的存在。
Elisa方法在临床诊断、生物学研究和药物开发等领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，Elisa方法可以用于检测各种疾病标志物，如肿瘤标志物、传染病病原体抗体等，具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点。
在生物学研究中，Elisa方法可以用于检测细胞因子、蛋白质相互作用、药物浓度等，为科研人员提供了重要的实验手段。
在药物开发中，Elisa方法可以用于筛选药物靶点、评价药物的药效和毒性，为药物研发提供了重要的技术支持。
总之，Elisa方法作为一种重要的实验技术，在生物医学研究领域有着广泛的应用前景。
通过本文的介绍，相信读者对Elisa方法有了更深入的了解，希望能够为相关领域的研究和实践提供帮助。
ELISA的种类及原理
ELISA的种类及原理
ELISA（酶联免疫吸附试验）的种类有直接ELISA、间接ELISA、双抗体夹心ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA
和间接/夹心ELISA。
直接ELISA的原理是将需要检测的抗原直接固定在微孔板上，然后加入与抗原结合的标记抗体，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，以确定抗原的存在。
间接ELISA的原理是先将需要检测的抗原固定在微孔板上，
然后加入特异性抗体，再加入标记二抗与特异性抗体结合，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，以检测抗原的存在。
双抗体夹心ELISA的原理是用两种具有特异性的抗体来检测
抗原。
首先将捕获抗体固定到微孔板上，加入待检样品，待抗原与捕获抗体结合后，加入检测抗体，最后再加入与检测抗体结合的标记二抗进行检测。
竞争ELISA的原理是在抗原与特异性抗体的竞争下检测抗原。
将捕获抗体固定到微孔板上，加入已知抗原浓度的标准样品和待检样品，再加入特异性抗体与标记抗体竞争结合。
间接竞争ELISA的原理同竞争ELISA类似，但检测抗体不是
标记抗体而是另一种竞争性抗体。
间接/夹心ELISA的原理是将捕获抗体固定在微孔板上，加入
待检样品和检测抗体，再加入标记二抗，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，并检测抗原的存在。
elisa的方法及原理
elisa的方法及原理Elisa（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测特定蛋白质、抗体或抗原的分析方法。
它具有高度的敏感性和特异性，被广泛应用于医学、生物学和生物技术领域。
本文将介绍Elisa的原理、步骤和应用。
一、Elisa的原理Elisa基于免疫学原理和酶学反应，通过特异性抗原-抗体反应来检测目标物质的存在与否。
Elisa通常包括以下几个关键步骤：1. 固定抗原：将目标抗原固定在盘或膜上，以便后续的抗体结合反应。
2. 试样添加：将待测样品加入固定抗原的孔中，允许样品中的抗原与已固定的抗原发生结合。
3. 抗原结合：加入特异性的抗体，并使其与待测样品中的抗原结合。
4. 洗涤：通过洗涤剂去除未结合的物质，以减少非特异性反应。
5. 酶标记抗体结合：加入酶标记的抗体，它与待测样品中的抗原结合。
6. 信号发生：加入染色底物，使酶标记的抗体产生一个可测量的信号（如颜色变化）。
7. 信号检测：使用光度计或其他测量仪器测量信号的强度，与标准曲线相比较，确定待测样品中目标物质的浓度。
二、Elisa的步骤Elisa的步骤十分关键，需要严格按照以下程序进行：1. 准备工作：准备所需的试剂和设备，保持实验区域的洁净。
2. 抗原包被：将具有特异性的抗原添加到固相载体（如96孔板或膜）上，制备固定抗原。
3. 样品添加：将待测样品和标准品加入孔中，与固定抗原发生结合。
4. 增强体添加：加入特异性的酶标记抗体，允许其与结合的抗原发生结合。
5. 洗涤：通过洗涤液去除未结合的物质，减少背景干扰。
6. 底物加入：加入染色底物，与酶标记的抗体发生酶学反应。
7. 反应终止：加入终止液，停止酶学反应，保持结果稳定。
8. 信号测量：使用光度计测量发色底物的吸光度，与标准曲线或对照样品进行比较。
三、Elisa的应用Elisa具有广泛的应用领域，以下是一些常见的应用示例：1. 医学诊断：Elisa可用于检测疾病标记物、肿瘤标志物和病原体抗体，用于早期诊断和治疗监测。
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数据处理2
将测得的吸光度值OD490nm 扣除空白后，按照下 面的公式换算成抑制结合率B/B0(%)：B/B0(%)＝ (OD-NSB)/(OD0-NSB)×100 其中，OD为给定样品的吸光度值；OD0 为阳性对 照的吸光度值；NSB为阴性对照的吸光度值。
以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值 Log10(抗原)为横坐标作图，绘制标准曲线，标准 曲线用线性拟合[y=ax+b] ，其中a和b为方程拟合 参数。
酶联免疫吸附分析法
主要内容
酶联免疫吸附分析法（ELISA）
ELISA方法分类
间接竞争ELISA
酶联免疫吸附分析法（ELISA）
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体 的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持 其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学 活性，又保留酶的活性。
ELISA分类
直接法
将样品和标准抗原直接包被在微孔板上，经过温育、 洗涤、封闭等一系列步骤，加入同位素或酶标记的抗体， 与微孔板上的抗原充分反应，如果没有标记的抗体，也 可加入相应的酶标二抗（例如辣根过氧化物酶或碱性磷 酸酶标记的羊抗兔IgG）与结合在微孔板上的抗体结合， 最后加入底物显色，测定与抗体结合的抗原的量。各孔 颜色的深浅与对应样品中抗原的浓度成正比。 直接法是最简单的ELISA分析方法，但是样品中非特 异性吸附干扰影响很大，并且抗原吸附一般也不完全。
④抗原抗体反应：弃去封闭液，用PBST洗涤4次。 将一定浓度的抗血清或抗血清和样品的混合物加入板 孔（提前预混合，4˚C过夜放置）。每孔150μL，37˚C 孵育2小时； ⑤ 抗原抗体复合物与酶标二抗反应 ：酶标板用 PBST洗涤3次，加入一定浓度的酶标二抗 (辣根过氧 化物酶标记的羊抗兔IgG)，每孔150μL，37˚C孵育1.5 小时；
恒温恒湿二氧化碳培养箱 ； 酶标仪 ；
旋涡混合仪 ；
电子天平 。
间接竞争ELISA操作步骤
①包被：用包被液将标准抗原稀释至最佳工作浓度 包被96孔酶标板，每孔150μL，留出4孔做阴性对照， 即加入150μL不含Vtg的NaCO3-NaHCO3 缓冲溶液， 室温放置2小时后，转入4˚C过夜放置； ②洗涤：弃去包被液，用200μL PBST (0.02M磷酸 盐，包含0.15M NaCl和0.05% Tween-20, PH 7.4)洗涤 4次，每次5min； ③ 封 闭 ： 加 入 1 ％ BSA 于 37˚C 封 闭 2 小 时 ， 每 孔 300μL；
⑧测定：用酶标仪于490nm波长下测量各孔的吸光度 值OD490nm。
数据处理1
将测得的吸光度值OD490nm 扣除空白后，按照下 面的公式换算成抑制结合率B/B0(%)：B/B0(%)＝ (OD-NSB)/(OD0-NSB)×100 其中，OD为给定样品的吸光度值；OD0 为阳性对 照的吸光度值；NSB为阴性对照的吸光度值。 以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值 Log10(抗原)为横坐标作图，绘制标准曲线，标准 曲线用Boltzmann方程拟合[y = a + b/[1 + exp (xc)/d]，其中a, b, c, d为方程拟合参数。
Байду номын сангаас
双抗体夹心法
需要制备两种抗体来检测抗原，两种抗体要求可以识 别不同的抗原决定簇。从某种意义来讲，多克隆抗体 比单克隆抗体更适用于双抗体夹心法，因为多克隆抗 体本身就是识别不同抗原决定簇的抗体的混合物。 把最先吸附在酶标板上的抗体称为一抗；另一种抗体 称为二抗或酶标二抗。二抗可以是另一种单克隆抗体 也可以是多克隆抗体。对二抗的要求较高，需要对抗 血清进一步分离纯化。
典型的二抗制备方法是用木瓜蛋白酶将抗体水解为两 个Fab’片断和一个Fc片断，在Fab’片断的羧基段键合辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
检测时首先将一定量的一抗包被于酶标板上，再加入 样品或已知浓度的抗原，孵育一段时间后，洗去未作 用的抗原，再加入酶标二抗孵育一定时间，洗出未吸 附的酶标二抗，加入酶反应底物，显色。 如果没有用酶标记二抗则需加入相对应的第三种酶标 抗体再显色。 吸附在酶标板上的一抗将样品中的抗原捕获，二抗再 与被捕获的抗原相结合，形成一个抗体-抗原-二抗复 合物形式，各孔吸光度与样品中抗原浓度成正相关。
封闭液：1% BSA，溶解于碳酸盐缓冲液中。
底物溶液：柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH=5.0， (0.1 M柠檬酸溶液12.15 mL，0.2 M磷酸二氢钠 12.85 mL，加蒸馏水25 mL)溶解0.02 g的邻苯二胺， 使用前加80 μL 30% H2O2； 终止液：2 M HCl溶液
间接竞争ELISA所用仪器
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使 固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物 质分开。 再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应而结合在固 相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色 产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关， 故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反 应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
竞争ELISA作用原理图
间接竞争ELISA分析所用试剂
碳酸钠 碳酸氢钠 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 氯化钠 吐温-20 BSA (第V组分) 柠檬酸 磷酸二氢钠 双氧水 邻苯二胺 酶标二抗
间接竞争ELISA所用缓冲液
包被液：0.01 M碳酸盐缓冲液，pH=9.6。
PBST缓冲溶液：0.2 M磷酸盐缓冲液，pH=7.4， 0.15 M NaCl，0.05% Tween 20。
⑥显色：PBST洗涤板3次，在各孔中加入OPD底物显 色液(20mg邻苯二胺溶于50mL 0.05M的磷酸盐-柠檬酸 缓冲液中，PH5.0,加入80μL H2O2混合后立即加入孔 内)，每孔100μL，37˚C孵育；
⑦终止反应 ：反应30min时，每孔加入50μL 2mol/L 的盐酸终止液终止反应；
双抗体夹心ELISA作用原理图
竞争法
竞争法在操作上比直接法多一步预混合的步骤，即在 酶标板上加入样品和抗体之前，需要将这两者以一定比 例混合，预孵育一定时间。 首先，在酶标板上包被一定量的抗原，封闭未被占据 的吸附位点后，加入一定量的特异性抗体和样品或标准 抗原的预混合液，吸附在酶标板上的抗原和样品中的抗 原与抗体竞争结合。如果样品的抗原浓度高，则能够与 吸附在酶标板上的抗原相结合的抗体的量就少。 然后，依次加入酶标二抗和底物，显色后用酶标仪测 定其吸光度。各孔的吸光度值与样品中抗原的浓度成反 比。
谢 谢！