无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究

胚胎神经干细胞的体外培养体系，５的胎牛血清诱导神经干细胞分化，免疫荧光染色技术进行对神经用％用千细胞及诱导分化细胞的鉴定。结果原代培养的神经干细胞折光性强，养第２培ｄ开始形成细胞集落，第３形成大的神经球。３～ｄ５代传代的细胞生长稳定。经胎牛血清诱导后第３ｄ开始，神经球开始向周边发出突起，悬浮的细胞开始贴壁生长。原代及传代培养的神经球表达Ｎｓｎ阳性，化细胞分别表达ＮＥＧＡｅｔｉ分Ｓ、ＦＰ和ＧＬＡＣ阳性。结论应用无血清培养技术可在体外培养、扩增出神经干细胞。５％的胎牛血清可以诱导神经干
Ｅｘｐｒｍｅａｔｄｙｏｕｌｉａｉｎ，ｄｆｅｅｉｔｏｎｄｉｎｔｆｃｔｏｎｆｔｌｒｔｅｒｌｅｉｎｔｌｓｕｆｃｔｖｔｏｉｆｒｎｔａｉｎａｄｅｉａｉｎｉｅａａｓｎｕａｉ
ｓｍｅｓＩｉｎｘＷＮＧＸａｎ，ＨＮｏｇｊｎｅａ．ｅａｔｅｔｆＮｕｏｕｇｒ，ｅｔｃｌＵＪａ —ｉＡｉｏｇＺＡＧＲｎ－，ｔ１ＤｐｒｎｅｒｒｅｔｅｌＬｎ，ｕｍｏｓｙｈ
豫ＨｓｉｌＰ．ａｊ７１０．ｈｎｏｔＢｏ２０４Ｃｉａｐａｏｆｉ
ｆｅｄｕ，５ｒｅｍｅｉｍ％
ｏｈｅｗｏｂｖｎｓｒｍｗａｕｓｄｏｄｆｅｅｔａｉｎ．Ｉｆｔｍｂｏｉｅｅｕｓｅｆｒｉｒｎｉｔｏｆｍｍｕｅｌｕｒｓｅｃｎｆｏｅｃｎｅ

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定研究

ｔｄｐｓｔｖ１ｔｈｘｅｔｏｎｌｍｍａｉｎＴｈｏｅｓｖｒｅｒａｌｒ，ｈｒｉｈｒｔｅ１ｖｌｏｅｏｉｉｅｙｗｉｔｅｅｔｎｆｉｆａｈｔ．ｅｍｒｅｅｅｈａｔｆｉｅｔｅｍｏｅｈｇｅｈｅｅｆｏｕ
孔令胜张军臣张冉赵万巨邵彤杨全祥
（宁医学院附属医院）济
提法
要目的建立胎鼠神经干细胞体外培养方法并鉴定神经干细胞，观察神经干细胞生长特点。方
采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的无血清培养基对大鼠胚胎间脑组织细胞悬液进行培分离培养出了大量具有不断增殖的能力、达神经巢蛋白的神经干细胞，能经过诱导分化为神经元和神表并
探索神经系统疾病新的治疗方法。我们采用无血清培养、细胞克隆技术及免疫细胞化学分离并鉴定单神经干细胞，为进一步研究ＣＮＳ疾病的发病机制和治疗手段提供理论和物质基础。
１材料与方法
实验动物：孕１ｄ的ＳｒｇｅＤｗｅ（Ｄ）受４ｐａｕａｌｙＳ胚胎大鼠由我校实验动物中心提供。主要试剂：ＭＥＦ２（：）培养基（ — ＤＭ／ｔ１１Ｈｙ
第３ｚ卷第２期
Ｖｏ．２，．Ｉ３Ｎｏ２
济宁医学院学报
ＪＯＵＲＮＡＬ０ＦＪＮＩＤＩＩＮＧＭＥＣＡＬＣＬＧ０ＬＥＥ

无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化

通讯作者：沈强，博士，
主任医师，教授，硕士生
摘要背景：体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的：建立大鼠神经干细胞的分离、培养、纯化方法，进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：利用无血清悬浮神经球方法分离培养胚胎来源的神经干细胞，进行形态学观察，用免疫细胞化学方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物，流式细胞仪检测细胞标志物及其比例。结果与结论：无血清悬浮神经球培养下大鼠神经干细胞生长稳定，操作简单，可大量分离、纯化、扩增神经干细胞，所获细胞具有神经干细胞的一股生物学特性，流式细胞仪检测第３代神经干细胞巢蛋白达９１．５％，并具有多向分化潜能，免疫化学染色及流式细胞仪示神经干细胞可分化形成神经元，神经胶质细胞和少突胶质细胞。
中国组织工程研究
７７誊筹１４势２０１３— ０４—０２出版
ｗ。一．。
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇ￣ｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＡｐｒ｝Ｉ２．２０１３ＶｏＬ１７，Ｎｏ．１４
ｄｏｉ：ｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ２０９５ — ４３４４．２０１３．１４．０１８ｆｎｔｔｐ：ｌｌｗｗｗ，ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ］赵际囊沈强．黄斐无血清＿｛串经球培舞下种经干组匏的生长ｓ分化呲，中国维织Ｉ程磺究，２０１３．１７（１￣：２５９２ — ２５９６

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

ＰｎＬ，ＹｎＺａｇＷＨａＣｉＳＷｎｕ、，ａｏＲＷａｇＭＬｅＯＣｍｐｒｌｅｓｕｏＧＢｎ，ＲｎＹｏｏｏｉｌｎｖ
安徽医科大学第一附属医院，科，经内科，安徽省合肥市骨神２０２安徽医科大学微生物学教研室，徽省合肥市２０３３０２：安３０２潘良春 ★ ，，９８年生，徽省黄山市人，族，０６年安徽医科大学男１７安汉２０毕业，士，硕医师，主要从事周围神经损伤与修复方面的研究。通讯作者：宗生，士，任医师，授，徽医科大学第一附属医院尹博主教安骨科，安徽省舍Ｚｏｇｕｉｃｕｎ ∞ ｅｎｔｌｔｈｎｇｏＬｎｈａｇｒ
２０；（）５７Ｃａ０６１５： — （Ｎｎｌ０２
潘良春，宗生，尹王伟，勇，胡高荣保，明丽，于果．眙和新生大鼠神经干细胞王任胚培养与分化的特性比较Ｕ＿国临床康复，０６，１）５７ｌ中２０１５：－１０２ｗｗｗｚｌｋｒｌｇｃｆｏｃａ
・
２５
基础研究・
胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较★
潘良春・宗生。，尹，王伟，胡勇，荣保，明丽，于果高壬任
ｆｍｅａｎｅｎｔａｅｅｒｏｅ，ａｄｈｖｈｂｉｔｏｅｆｏｒｆｔａｄｎｏａａｒｔｃｒｂａｃｒｘｌｌｌｔｎａｅｔｅａｌｙｆｓｌ－ｉｒｎｗｉｇａｄａｌｅａｓｇｎｖｔ．ＮＳｒｍｅａａａｅｍｕｈｅｅｎｎｍｐｉｄｐａｅｉｉｏｉｆｓｒＣｓｆｏｆｔｒｔｈｖｃｌｍｏｅｕｒｎｍｂｅｎｐｌｆｒｔｅｂｉｔ，ｗｈｃｗｉｌｕｔｌｆｒｈｒａｄｒｉｅａｉａｌｙｏｖｉｉｈｌｂｅｓｉａｅｏｔｅｂｃｉｉａｈｒｐｆｎｕａｅｅｅａｉｎａｄｒｃｖｒ．ｌｃｔｅａｙｏｅｒｒｇｎｒｔｅｏｅｙｎｌｌｏｎ

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

ＰＡＩｌ —。
２结果
血浆ｔＡ、ＡＩｌ原含量检测见表ｌ — Ｐ —抗Ｐ。观察组血浆ｔＡ — Ｐ含量低于对照组（ｏ０）Ｐ — 量显著高于对照组（Ｐ＜．５．ＡＩｌ含Ｐ＜
０．０５）。
本文结果表明．急性脑梗死患者血浆ｔＡ含量降低，ＡＩ — ＰＩ — ｌ含量升高，内纤溶活性低。提示临床上可用ｔＡ、Ａｌ体 — Ｐ一Ｐ１的含量作为判断急性脑梗死患者纤溶活性，指导治疗的参考指标之
一
０
表ｌ两组血浆ｔＡ、ＡＩ含量比较（ ± ｓ — ＰＰ — ｌ）
参考文献
［３ＬｓａｚＢｒｕ１ｏｃｌｏＪ，ａｎｗａｄＥ．ｓｕｌｓｉｏｅｃｉａｏ（］．ＥｎｉｌＴｉｓｅｐａｍｎｇｎａｔｖｔｒＪＮｇ
维普资讯
・
３・４
中国塞旦神经疾病杂志２０年１月第９０６１卷第６期ＣｉｓＪｕｎｌｆｒｃｃｌｅｏｓｉａｓｏ．０６ＶＩｏ６ｈｅｅｏｒａｏＰａｔａＮｒｕｓｓｖ２０，ｏ９Ｎ．ｎｉｖＤｅｅＮ．
显示．性脑梗死患者血ｔＡ明显低于对照组（急 — ＰＰ＜００）．５而
１２标本制备所有实验对象人院第２．ｄ空腹、卧静息平１ｒｎ后采集，血中尽量减少静脉压迫时间。血液标本按０ｉａ采ｌ：抗凝（０１Ｍ枸橼酸钠０２＋血液１８）按３０ｒ９即．３．ｍｌ．ｍ１。００／ａｎ离ｒｉ心１ｒｉ，分离血浆放人一Ｏ５ｎ取ａ８ ℃超低温冰箱保存。１３检测方法及试剂采用ＥｌＡ定量测定ｔＡ、Ａｌ．ＬＳ — Ｐ一Ｐ１水平，剂盒购自美国诊断试剂公司（Ｄ。操作过程严格按照试ＡＤ药盒说明书进行。１４统计学处理采用ＳＳ１．．ＰＳ００统计软件进行两样本均数比较的ｔ检验，＝００ “ ．５作为检验水准，据以均数 ±标准差（－数Ｘ ± ｓ表示。）

维甲酸、音猬因子对大鼠脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞分化的影响

成功分质细胞的特异性抗原；导分化后结果显示Ｓｈ组未检测到胆碱乙酰诱ｈ
转移酶阳性细胞，Ａ组为２．３，ｈ＋ＲＡ组为６．４，Ｒｏ６ｓｈ６８其差异具统计学意义。结论：从大鼠胚胎脊髓可成功分离神
ｓｉａｏｄｗｅｅｉｏａｅｎｕｔｒｄｉｅｕｆｅｄｕ，ｌｂｌｄｂ－ｒｍｏ２ｄｏｙｒｄｎＢｒＵ），ａｄｔｅｄｎｉｅｐｎｌｒｒｓｌｔｄａｄｃｌｅｎｓｒｍ－ｒｅｍｅｉｍｃｕａｅｅｙ５ｂｏ一一ｅｘｕｉｉｅ（ｄｎｈｎｉｅｔｉｄｆｂａｓｏｉｇｅｏｏｂｅｉｙｍｅｎｆｓｎｌｒｄｕｌｍｍｕｏｌｏｅｃｎｅｓａｎｎｇｉｓｅｔｎｅｒｌｃｌｓｅｉｉａｔｅｓｎｆｕｒｓｅｅｔｉｉｇａａｎｔｓｉａｄｎｕａｅｌｐｃｆｎｉｎ．ＡｆｅｄｉｇＲＡ，ｎｎｃｇｔｒａｄｎＳｈｏｈｉｍｉｔｒ，ｔｅｄｆｅｅａｉｔｎｏｅｒ１ｔｍｅｌｉｔｔｒｅｒｎ１ｅｃｌｓｗａｅｅｔｄｈｒｔｅｒｘｕｅｈｉｆｒｎｔａｉｆｎｕａｅｃｌｎｏｍｏｏｕｏｋｅｌｓｄｔｃｅ．Ｒｅｕｔ：ｕａｔｍｏｓｓｎｉｓｌｓＮｅｒ１ｅｓｃｌｅｉｅｒｍｈａｍｂｙｎｃ（ｅｌｄｒｄｆｏｔｅｒｔｓｖｅｒｏｉＥＤ４ｐｎｌｃｒｘｒｓｅｅｔｎＡｆｅｅｎｎｕｅｔ１）ｓｉａｏｄｅｐｅｓｄｎｓｉ．ｔｒｂｉｇｉｄｃｄｗｉｈＲＡ，２．３ｃｌｉ— Ｏ６ｅｌｄｓｓｐａｅｏｉｖｏＣｈｌｙｄｐｓｔｅｔＡＴ，ａｄｉｃｅｓｄｔ６８ｗｈｎｔｅａｄｔｎｌｈｓａｄｄＮｏＣｈｉｎｎｒａｅｏ６．４ｅｈｄｉｏａｈｗａｄｅ．ｉＳＡＴｏｉｖｅｌｓｆｕｄｉｐｓｔｅｃｌｗａｏｎｉｎＳｈｔｅｔｄｎｕａｔｍｅｌ．Ｃｏｃｕｉｎ：ＳｈｃｎｅｈｎｅｔｅｃｐｂｌｙｏｈｒａｅｅｒｌｅｃｌｓｓｎｌｓｏｈａｎａｃｈａａｉｔｆｉＲＡｈｔｉｄｃｈａｍｂｙｎｃｓｉａｏｄｄ — ｔａｕｅｔｅｒｔｎｅｒｏｉｐｎｌｒｅｃｒｖｄｎｕａｔｍｅｌｉｔｔｒｎｕｏｉｅｃｌ。ｔｏｇｈａｎｔｉｄｃｈｅｒｌｔｍｅｌｉｔｔｒｎｕｏｉｅｉｅｅｒｌｅｃｌｎｏｍｏｏｅｒｎｌｅｌｓｓｋｓｈｕｈＳｈｃｎｏｎｕｅｔｅｎｕａｅｃｌｎｏｍｏｏｅｒｎｌｓｓｋ

胚胎大鼠神经干细胞培养方法的改进

１材料与方法
代后．分取出至预先涂有多聚赖氨酸的２孑培养部，Ｌ１板，续无血清培养２～４，去孔中液体．多继４８ｈ吸１
聚甲醛室温固定３ｉ，３Ｈ。１＋纯甲醇０ｒｎ用Ｏａ（份）
滤。１００ｒｍｉ、ｎ离心２次，上清。加０／ｎ３ｍｉ去
ＤＭＥＦ２培养液分别诱导其分化。在诱导分化后Ｍ／１
的３５ｄ多聚甲醛室温固定后进行免疫细胞化～，４／９６
学检测，方法与Ｎｓｉｅｔｎ检测基本相同。不同的是用其抗ＮＳＥ抗体检测神经元．抗ＧＦ用ＡＰ抗体检测星形胶质细胞，用抗Ｂｄ抗体检测细胞增殖能力。ｒＵ
５ｏ份的混合液灭活内源性过氧化物酶，ＢＡ封５Ｓ
Ｗｉｔｒ大鼠（２１）ｓａ孕１～６ｄ．
闭液２ｉ闭非特异反应。加入Ｎｅｔ０ｒｎ封ａｓｉ抗（ｎ一稀释度按各公司产品说明）３．７Ｃ孵育１ｈ生物素标记．的二抗ＩＧ和试剂ＳＢ各孵育２ｉ．ｇＡＣ０ｒｎＤＡＢ呈ａ
在神经干细胞（Ｃ）在一定条件下，ＣＮＳｓ；ＮＳｓ可向多
半量换液．直到再次传代。
１３免疫细胞化学反应四组神经干细胞球传２．
个方向分化，为神经元和神经胶质细胞。内源性于成

B-27 无血清添加剂-产品说明书

B-27无血清添加剂S440J710mL 24个月液体-30～-5 ℃干冰S441J7B-27 无血清添加剂，不含维生素A，50X 10mL 24个月液体-30～-5 ℃干冰S442J7B-27 无血清添加剂，不含抗氧化剂，50X 10mL 24个月液体-30～-5 ℃干冰1.产品描述B-27是一种优化的无血清添加剂，用于支持胚胎，产后和成体的海马神经元和其他中枢神经系统（CNS）神经元的生长和活性维持。

B-27添加剂以50X工作浓度的液体形式提供，旨在与NeuroGro®神经元基础培养基（源培货号：T710KJ）或Neurobasal®、Neurobasal®-A培养基（二者均为Thermofisher公司产品）配套使用，用于基本单一化（<0.5％胶质细胞）的神经元群落的培养，无需使用星形胶质细胞饲养层。

在神经元基础培养基中使用B-27添加剂，用于培养产前和胚胎神经元，以获得优化的活性和长期的存活率。

在神经元基础培养基中使用B-27添加剂，用于培养神经来源的肿瘤细胞系，可有效地保证其活性。

在DMEM / F12培养基中添加B-27添加剂，已被证明可支持扩增来自小鼠胚胎纹状体和中脑的EGF响应性的前体细胞。

货号为S440J7的B-27添加剂，为标准配方，包含了多种抗氧化剂，以减少反应性的氧化损伤。

货号为S441J7的B-27添加剂，从标准配方中去除了维生素A，以防止神经干细胞向神经细胞分化。

货号为S442J7的B-27添加剂，从标准配方中去除了全部5种抗氧化剂，以利于在氧化应激及损伤、氧自由基对神经损伤和凋亡的研究中排除抗氧化剂的干扰。

本产品使用注射用水（Water-For-Injection）配置。

本产品供科学研究和生产使用，用于组织和细胞的体外培养。

禁止临床使用。

2.企业质量体系上海源培生物科技股份有限公司的产品是在cGMP标准车间中生产的。

上海源培生物科技股份有限公司已取得ISO9001:2015、ISO13485:2016质量体系认证。

神经营养素家族类细胞因子对神经干细胞分化影响的研究现状

神经营养素家族类细胞因子
时神经干细分影响的研究现
张任飞肖诗柔中国医科大学七年制临床医学系
摘要
。
－
鬻
１神经千细胞（ｅｒｌｓｍｃｌ，ｎｕａｔｅｓｅｔ
ＮＣｓＳ）
（ｕｇａｕａｏｅＳ）ｓｂｒｎｌｒｚｎ，ＧＺ。
５Ｔ４５以及神经营养素一Ｎ－６。（－／）Ｎ６（Ｔ）本
２神经营养素家族（ＧＦ家族）Ｎ
包括：神经生长因子（）ＮＧＦ、
是具有高度自我更新能力并能分
化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质
ｇｎｆｍｙＧｅａｉ）ｌｅＮＦＢＮ，ｅｅａｉ（ＦｇｎｆｍｙｉｕｓＧ，ＤＦｌＮｅｌｎｄｃ
Ｎ－３Ｎ一４Ｔ，Ｔ／５，Ｎ一６ＴｅａｆｅｔｔｅＴ．ｈｙｃｎａｆｃｈ
ｄｆｅｅｔｔｎｏｔｍｅｌｎｔｉｐｐｒａｔｒｉｆｒｎｉｉｆｓｅｃｉａｏｓ．Ｉｈｓａ，ｆｃｏｓｅ
自从１９９２年Ｒｅｎｌｓ和Ｗｅｓｙｏｄｉｓ
退行性疾病的治疗提供了新的方向。
挥生物学效应。２．１神经生长因子（ＮＣＦ）２．．ｌ１ＩＮＧＦ的特性和分布
因此，对ＮＳ增殖和分化调控的研ＣＳ
阳性细胞的数目增加３倍【。１１
细胞。应用于临床疾病如帕金森病

神经干细胞——精选推荐

神经生物干细胞定义干细胞是指机体在其毕生过程中、某些特定时期具有自我更新(self-renewal)和分化(differentiation)能力的细胞群。

干细胞也称前体细胞(precursor cell)或祖细胞(progenitor cell)。

干细胞的概念最早由Evans于20世纪80年代初提出，他们在实验中发现来源于小鼠囊胚的内皮细胞团，能在体外培养，是一种高度未分化的细胞，具有发育成为各种细胞的潜能，一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。

干细胞具有两个基本功能：多种潜能和自我更新能力。

按照分化潜能的大小，干细胞可以分为3种类型：(1) 全能干细胞(totipotent stem cells)，能产生机体任何细胞类型，进一步形成机体的组织、器官并形成个体，如胚胎干细胞能够产生来自所有3个胚层的细胞，依所在组织不同而特化为不同类型的细胞；(2) 多能干细胞(multipotent stem cells)，这种细胞具有分化为多种组织细胞的潜能，但是不能形成个体，发育潜能受到一定限制，最典型的例子是骨髓造血干细胞；(3) 单能干细胞(unipotent stem cells)，常指成体中的细胞，这类细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，能够保证组织的稳定自我更新，补充因正常衰老或损伤而丧失的细胞，如上皮组织基底层的干细胞。

总之，生命体通过干细胞的分化增殖来实现细胞的更新及保证持续生长。

1、神经干细胞的定义1989年，Temple等从13天大鼠胚胎脑隔区取出细胞进行培养，发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞。

其后从成年鼠纹状体、海马齿状回等处分离出能在体外不断增殖，并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能的细胞群。

20世纪90年代初，Reynolds 等从成年小鼠脑纹状体分离出能在体外不断分裂增殖，具有多种分化潜能的细胞群，正式提出了“神经干细胞”的概念，以一种新的观念代替了传统的认为神经组织一成不变的观念。

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞２种神经细胞的特异性抗原，ＳｓＮＣ分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为（３０８５％和（３０￣．）４．￣．）７５２．３６％。结论：０９从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达ＮＣ的特异性抗原；激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞Ｓｓ
ＲＥＮｌｎＤａｉ，ＨＵＡＮＧｏｉＺＨＡＮＧｍｅ，ＵａＧｕｗｅ，ＸｕｉＬＩＨｕｎ
ＳｈｏｏＰｂｉＨａｔＴａｊｄｃｎｖｒｔ，ｉｊ０００Ｃｉａｃｏｌｆｕｌｅｌ，ｉｉＭｅｉＵｉｓｙＴｎｉ３０７，ｈｃｈｎｎｌａｅｉａｎｎ
ｃｏｉｓｃｉｎｒｄｓｅｔｏ，ｍｅｈｎｃｌｂｏｎｇａｄｓｒｍ－ｒｅｓｐｎｓｏｕｔｒ，ａｄｎｔｅｙｉｃａｉａｌｗｉｎｅｕｆｅｕｓｅｉｎｃｌｕｅｎｄｉｅｉｄｂｍｍｕｎｆｕｒｓｅｔｓａｎｉｇｕｓｎｎｉｆｏｏｅｃｎｔｉｎｉｇａ — ｌｔｏｇｉｔｎｓｉＴｈｆｅｅｔａｉｎｏＣｓｗｅｅｉｎｉｅｙｄｏｂｅｓａｎｉｇｉｕｏｕｏｅｃｅｅｔｃｉｅａｄｌｓｒｉｄｙａａｎｓｅｔｎ．ｅｄｉｒｎｉｔｆＮＳｒｄｅｔｆｄｂｕｌｔｉｎｍｍｎｆｒｓｎｃｅｈｎｑｕｎａｅｂｆｏｉｌ
天津医药２０年ｌ月第３卷第１期０８Ｏ６Ｏ

大鼠胚胎神经干细胞分离培养及基因感染研究

ｓｔｕｄｙｏｎｔｒｅａｔｉｎｇｓｅｎｓｏｉｒｎｅｕｒｌａｄｅａｆｎｅｓｓ．ＭＯ￣ｏＯｓＡｆｔｅｒｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｆｅｔａｌｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｉｆｄｅｗｉｈｔｎｅｓｉｔｎｉｒｍｎｕｎｏｃｙ－
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＵｎｉｏｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｏｎｇｊｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，
ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００２２，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔ￣Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＮＳＣｓ）ｔｏｃｒｅａｔｅｂａｓｅｓｆｏｒｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
件。方法分离、培养胎鼠海马组织神经干细胞，并用巢蛋白（ｎｅｔｓｉｎ）免疫荧光组织化学染色鉴定；诱导神经干细胞
分化，用神经元特异性烯醇化酶（ｎｅｕｒｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）、胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉｌａｉｆｂｒｉｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）免

体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞的增殖和分化

。
性树胶封片
阴性对照用
。
代替第一抗体
,
取材
将孕
,
大鼠颈椎脱臼处死无菌
, 。
其余步骤相同
二
条件下取出胚胎在解剖镜下分离出脊髓剥去脊膜原代细胞培养
组织
免疫荧光染色
培养细胞爬片经次冷丙酮固定
,
用
胰蛋白酶消化分离
,
冲洗
二
,
,
目铜网过滤去除未消化的组织
,
一 ’ 。。
,
,
大鼠由中国人民解放军第八十
。
,
九医院实验动物中心提供按
, ,
将成年雌雄
大鼠于晚
,
比例合笼次日上午
。、
,
时阴道涂片查精
经干细胞上对于脊髓源性神经干细胞的研究不多
, 、
。
子查到精子者记为
动物在常温环境下饲养自
防淬灭封片剂封片察拍照
、。
℃冰箱避光保存
。
量神经干细胞培养液用吸管反复吹打细胞球制成单细胞悬液养每
, ,
对照实验以
。
代替第一抗体其
。
台盼蓝计数细胞以
,
,
余步骤相同结果
种人培养瓶中置换液
,
℃
,
饱和湿度培养箱中培次方法同前
,
次用倒置显微镜观察记录细胞生长传代
,
神经干细胞分化培养代神经球收集人离心管中

全反式视黄酸促进胚胎神经干细胞诱导分化的研究

全反式视黄酸促进胚胎神经干细胞诱导分化的研究余静【摘要】目的本研究观察全反式视黄酸(atRA)对于体外分离培养的胚胎神经干细胞(ENSCs)生长增殖和诱导分化的作用及其可能的分子机制.方法分离培养孕15 d SD大鼠(E15 d SD Rattus)海马回ENSCs,采用不同组合成分的神经干细胞培养基培养ENSCs,利用MTT法检测其对于ENSCs存活和增殖的影响;采用不同组合成分的神经细胞诱导分化培养基培养ENSCs,利用细胞免疫荧光染色法鉴定ENSCs及atRA对于其诱导分化的影响.结果 MTT实验结果表明,atRA+组、atRA-组和DMSO组均出现ENSCs的增殖效果,而对照组则没有明显的增殖现象,其中atRA-组最明显,DMSO组次之,atRA+组最弱.AtRA+组与atRA-的ENSCs经过诱导分化后产生的神经细胞类型有较明显差异,并且atRA组处理产生的神经元是对照组的3倍左右.结论 atRA能够抑制ENSCs的增殖,并且抵消神经生长因子对于ENSCs的促进有丝分裂作用,atRA还可以促进ENSCs定向诱导分化为神经元.【期刊名称】《安徽医药》【年(卷),期】2010(014)004【总页数】5页(P419-423)【关键词】全反式视黄酸;海马回;胚胎神经干细胞;细胞分化;神经元【作者】余静【作者单位】安徽医科大学第一附属医院药剂科、国家中医药管理局中药化学三级实验室,安徽,合肥,230022【正文语种】中文哺乳动物在胚胎神经发生过程中,脑内存在大量的胚胎神经干细胞(embryonic neural stem cells,ENSCs)。

这些ENSCs经过迁移定位最终分化为各型神经细胞。

Reynolds等[1]在 1992年首先利用 Neuroshere法[2]成功地从成年鼠纹状体分离得到具有自我复制和多向分化潜能的神经细胞团即神经干细胞(neural stem cells,NSCs),并且证实 NSCs在细胞因子、激素及环境因素调控和诱导下能够在体外分裂,并且进一步分化为神经元及神经胶质细胞。

Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中的表达变化及意义

Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中的表达变化及意义韩瑞;周燕;王舒阳;张广宇;彭越;王翠琴;鲁晶晶;彭涛;贾延劼【摘要】AIM: To investigate the effect of zinc finger protein 521 ( Zfp521 ) on the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) into neurons. METHODS: Rat MSCs were cultured by conventional method in vitro and divided into non - transfection group, transfection group( transfected with Rn - Zfp521 - siRNA ) and negative control group( transfected with negative control siRNA ). MSCs were induced by (3 - mercaptoethanol ( (3 - ME ) to differentiate into neurons. The fluorescence expressed by transfected MSCs was observed under inverted fluorescence microscope. The expression of Zfp521 was detected after transfection by RT - PCR. Immunohistochemistry, RT - PCR and Western blotting were used to detect the expression levels of neuron - specific enolase ( NSE ), microtubule - associated protein 2( MAP - 2 ) and Zfp521 after induction. RESULTS: The fluorescence of MSCs was mostly displayed 72 h after transfection and the effi ciency of transfection was up to 84. 1% ±2. 3% . Meanwhile, the mRNA expression of Zfp521 was decreased ( P <0. 05 ). MSCs were induced by (3 - ME to differentiate into neurons. The differentiation efficiency of MSCs transfected with Rn - Zfp521 - siRNA was the highest and the expression of NSE and MAP - 2 was significantly increased compared with other groups ( P <0. 05 ). Zfp521 was detected in all groups, and the expression level of Zfp521 was significantly decreasedafter induction ( P < 0. 01 ). CONCLUSION: Zfp521 may be down - regulated during the differentiation. The inhibition of Zfp521 promotes the neural differentiation of MSCs. Zfp521 may play an important role in regulating MSCs differentiation into neurons.%目的:探讨锌指蛋白521(Zfp521)在大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元过程中的表达变化及意义.方法:体外培养大鼠MSCs,实验分为未转染组、转染组(转染Rn-Zfp521-siRNA)和阴性对照组(转染negative control siRNA),采用β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元.倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况.采用免疫细胞化学法、RT-PCR法及Western blotting法检测诱导后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)的表达情况及诱导前、后Zfp521的表达变化.结果:(1)siRNA转染72 h荧光表达最强,转染率可达84.1%±2.3%,转染组骨髓间充质干细胞的Zfp521 mRNA表达下降(P<0.05);(2)β-巯基乙醇可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元,以转染组诱导效果最佳,NSE和MAP-2表达显著高于其它各组(P<0.05);(3)Zfp521在各组细胞中均有表达,诱导后Zfp521表达明显低于诱导前(P<0.01).结论:Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞神经分化中表达下降,抑制Zfp521表达可促进神经元的分化,提示Zfp521在骨髓间充质干细胞的神经分化中可能发挥重要调控作用.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)002【总页数】6页(P326-331)【关键词】锌指蛋白521;骨髓间充质干细胞;诱导;神经元【作者】韩瑞;周燕;王舒阳;张广宇;彭越;王翠琴;鲁晶晶;彭涛;贾延劼【作者单位】郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院放射科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052【正文语种】中文【中图分类】R329.21骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有多向分化潜能的多能成体干细胞，可以向神经细胞分化［1－2］。

悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点

悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点刘友;刘希光;李爱民【摘要】目的观察神经干细胞在悬浮培养与贴壁培养方式下的形态学特点及分化表型.方法新生6 h内的大鼠皮质应用无血清悬浮培养与贴壁培养神经干细胞(NSCs)技术培养,观察神经干细胞的形态学特点.体外胎牛血清(FBS)诱导NSCs分化,通过巢蛋白(Nestin)和GFAP免疫荧光染色鉴定分化表型.台盼蓝活细胞计数法比较细胞增殖能力.结果新生大鼠皮质应用无血清悬浮培养可获得稳定的NSCs细胞球,应用贴壁培养形成长梭状NSCs,NSCs巢蛋白免疫荧光染色结果呈阳性.体外FBS诱导分化后,神经球内开始出现放射状的神经纤维丝,免疫荧光染色可见GFAP 阳性细胞向外伸展以及Nestin阳性细胞边集.贴壁的NSCs分化成星形胶质细胞,免疫荧光染色可见Nestin和GFAP染色阳性细胞.在相同条件下,应用悬浮培养在第2~3d时增殖速度最大,而以贴壁培养方式培养出的神经干细胞在第4~5 d时增殖速度最大.结论应用无血清培养物B27与bFGF、EGF组合的NSCs完全培养基通过悬浮培养法与贴壁培养法,都可以成功在体外培养出NSCs;悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法.%Objective To observe the morphological characteristics and differentiation phenotype of neural stem cells in suspension culture and adherent culture .Methods The neural stem cells ( NSCs) of rat cortex was cultured by serum-free suspension culture and adherent culture . The morphological characteristics of neural stem cells were observed .In vitro fetal bovine serum (FBS) induced differentiation of NSCs,and differentiated phenotypes were identified by Nestin and GFAP immunofluorescence staining .Proven blue viable cell count method compared cell proliferation ability .Results The neonatal ratcortex was cultured in serum-free suspension to obtain stable NSCs cell pellets .Adherent culture was used to form long fusiform NSCs .NSCs were positive for nestin immunofluorescence staining .In vitro, FBS induced differentiation , radial nerve fibers began to appear in the nerve ball , immunofluorescence staining showed GFAP positive cells outward and Nestin positive cells set .NSCs were stained into astrocytes , and Nestin and GFAP staining positive cells were observed by immunofluorescence staining .The proliferation rate of the neural stem cells cultured in the same way was the highest at the 4th ~3rd day,and the proliferation rate was the highest at the 4th ~5th day.Conclusions The neural stem cells can be successfully cultured in vitro by suspension culture and adherent culture using the serum -free culture medium B27 and bFGF,EGF combined neural stem cells .Cultivation of neural stem cells by suspension culture was superior to adherent culture in early proliferation rate .【期刊名称】《临床神经外科杂志》【年(卷),期】2017(014)005【总页数】5页(P385-389)【关键词】神经干细胞;悬浮培养;贴壁培养【作者】刘友;刘希光;李爱民【作者单位】222002 连云港,徐州医科大学附属连云港医院神经外科;222002 连云港,徐州医科大学附属连云港医院神经外科;222002 连云港,徐州医科大学附属连云港医院神经外科【正文语种】中文【中图分类】R741.05成年哺乳动物大脑的急性或慢性损伤通常与持续功能性缺陷相关，其再生潜力和重建缺失神经结构的能力有限[1]。

无血清培养基名词解释

无血清培养基名词解释
无血清培养基是一种不含血清的培养基，通常用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞，以制备单克隆抗体、病毒抗原和重组蛋白等。

这种培养基通常含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质和清蛋白、纤维蛋白、胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同的功能，如提供细胞贴壁所需的基质，抗生物反应器剪切力，作为脂质和其他生长分化因子的载体等。

无血清培养基的制作成本较高，但其使用更加方便和高效，有利于体外培养和细胞的分化。