抗乙型肝炎病毒单克隆抗体药物的临床前药效学评价_李蒙

基金项目：“十二五”国家科技重大专项（２０１３ＺＸ１０００２００１、２０１２ＺＸ１０００３００８－０１０）通信作者：陈力Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ．ＣＨＥＮ　Ｌｉ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｃｈｅｎ＿ｂｋ＠ｆｕｄａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ·综述·抗乙型肝炎病毒单克隆抗体药物的临床前药效学评价李蒙，孙桂芹，王蕾，陈力复旦大学上海医学院教育部／卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海２０００３２摘　要：由乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染导致的病毒性肝炎是世界范围内的一个重大公共卫生问题，抗ＨＢＶ抗体药物乙型肝炎免疫球蛋白（ＨＢＩＧ）是阻断乙型肝炎母婴传播和移植性感染的主要用药。

但ＨＢＩＧ本身存在一些问题，而重组抗ＨＢＶ单克隆抗体能成为其有效替代物。

在重组抗ＨＢＶ抗体技术相对成熟的情况下，重组抗ＨＢＶ单克隆抗体药物功能性评价体系的缺失成为阻碍抗ＨＢＶ单克隆抗体药物研发的重要因素。

本文就现有的抗ＨＢＶ单克隆抗体药物的评价方法和体系进行综述。

关键词：乙型肝炎免疫球蛋白；乙型肝炎病毒单克隆抗体；功能评价Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ———Ａ　ｒｅｖｉｅｗＬＩ　Ｍｅｎｇ，ＳＵＮ　Ｇｕｉ－Ｑｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｌｅｉ，ＣＨＥＮ　ＬｉＫｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００３２，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ａ　ｇｌｏｂａｌ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｃｏｎｃｅｒｎ　ｗｉｔｈ　ｈｕｇｅ　ｓｏｃｉａｌ　ａｎｄ　ｅｃｏｎｏｍｉｃｉｍｐａｃｔｓ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＨＢＩＧ）ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｏｏｌｅｄ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｄｏｎｏｒｓ　ｉｓ　ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｔｏ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ＨＢＶ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｍｏｔｈｅｒ－ｔｏ－ｃｈｉｌｄ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，ａｃｕｔｅｅｘｐｏｓｕｒｅ，ａｎｄ　ｄｏｎｏｒ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ　ｌｉｖｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｓ　ａ　ｐｌａｓｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｄｕｃｔ，ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢＩＧ　ｉｓ　ｌｉｍｉｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｒｕｍ　ｓｕｐｐｌｙ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｕｎｋｎｏｗｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ａｎｄｏｔｈｅｒ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｏｌｅｄ　ｂｌｏｏｄ，ａｎｄ　ｕｐ－ｌｉｍｉｔｓ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｏｓｅ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｎｔｉ－ＨＢＶｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓ　ｂｅｉｎｇ　ｓｏｒｔｅｄ　ａｓ　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ＨＢＩＧ，ｉｔｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｓ　ｉｎ　ａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｓｌｏｗ　ｐａｃｅ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｓｐｅｅｄ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｓｔｅｐｓ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｌａｃｋｏｆ　ａｎ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ａｎｔｉ－ＨＢＶ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ＨＢＶ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｓ　ｒｅｖｉｅｗｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；Ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ 乙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）感染是世界范围内的一个重要公共卫生问题，是导致慢性活动性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌的最主要原因之一，每年有近１００万人死于与ＨＢＶ感染有关的各种肝脏疾病［１］。

我国是乙型肝炎大国，ＨＢＶ携带者约占全国人口的７％［２］。

ＨＢＶ表面抗原（ＨＢＶ·８４２·微生物与感染　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２５，２０１３，８（４）：２４８－２５４　ｈｔｔｐ：∥ｊｍｉ．ｆｕｄａｎ．ｅｄｕ．ｃｎｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｓＡｇ）阳性母亲的新生儿［３］和免疫功能低下的人群［４］（如肝移植受者）是ＨＢＶ感染高危人群。

ＨＢＶ疫苗通过主动免疫方式对ＨＢＶ易感人群提供安全、有效的免疫能力。

与此互补，肌内注射乙型肝炎免疫球蛋白（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｉｍｍｕｎｏ－ｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＨＢＩＧ）实现了被动免疫，提供了针对ＨＢＶ接触后的快速、短期保护。

ＨＢＩＧ在阻断母婴传播（与ＨＢＶ疫苗联用）、防止肝移植患者ＨＢＶ再感染及突发情况应急处理方面有广泛应用［５－７］。

但ＨＢＩＧ作为血液制品，有以下缺点：①接受治疗的患者尤其是免疫功能低下者，存在感染潜在未知病原的可能；②除ＨＢＶ表面抗体（抗－ＨＢｓ）外，产品中还存在其他抗体和蛋白，反复使用有造成免疫复合物疾病的可能；③高效价抗－ＨＢｓ的血液供者来源有限。

因此，通过体外抗体工程制备针对ＨＢｓＡｇ的人源（或人源化）抗ＨＢＶ单克隆抗体（简称单抗）替代ＨＢＩＧ很有必要，是未来的发展趋势。

动物抗体的人源化和人源抗体是抗ＨＢＶ单抗药物研发的２条主要途径。

人源化抗体是通过鼠源抗体的人源化改造获得，一般保留鼠源抗体的互补可变区（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）及部分骨架区，产品仍含有５％～１０％的鼠源序列。

现有多个人源化抗体已被美国食品药品管理局（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）批准上市。

人源抗体的技术如噬菌体抗体库技术［８］、免疫球蛋白基因克隆技术［９］、人淋巴细胞移植小鼠［１０］等已成熟，而全球第１个人源抗体阿达木单抗（ａｄａｌｉ－ｍｕｍａｂ）已经在２００２年上市。

尽管如此，抗ＨＢＶ单抗药物研发进展缓慢，主要原因是其功能评价系统还不成熟，增加了效果研究和质量控制的难度，限制了筛选效率，从而降低了研发进度。

药物临床前常规评价主要包括药效学评价、毒理学评价及生产和质量控制（图１）。

ＨＢＩＧ临床前评价已有评价标准和流程［１１］，且有多个上市产品。

由海外公司研发上市的产品有ＨｅｐａＧａｍ　Ｂ（Ｃａｎ－ｇｅｎｅ公司）、ＨｙｐｅｒＨＥＰ　Ｂ（Ｔａｌｅｃｒｉｓ　Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ公司）、Ｎａｂｉ－ＨＢ（Ｎａｂｉ公司）和Ｂａｙｈｅｐ　Ｂ（Ｂａｙｅｒ公司）等；国产的上市产品有由上海生物制品研究所、华兰生物工程股份有限公司、成都蓉生药业有限责任公司等生产的ＨＢＩＧ。

目前为止，重组抗ＨＢＶ单抗药物还没有上市产品，其临床前评价体系也有待建立。

ＨＢＩＧ是血液制品，有传染ＨＢＶ、丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）、人类免疫缺陷病毒１／２型（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅｓ　１ａｎｄ２，ＨＩＶ１／２）、人Ｔ细胞病毒（ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏ－ｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ，ＨＴＬＶ）、细小病毒Ｂ１９等的可能，所以ＨＢＩＧ的生产工艺强调病毒灭活过程（有机溶红色框内为建议用于评价抗ＨＢＶ抗体药效学的功能性试验图１　抗ＨＢＶ抗体药物临床前评价示意图Ｆｉｇ．１　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ＨＢＶ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ·９４２·李蒙，等：抗乙型肝炎病毒单克隆抗体药物的临床前药效学评价剂／表面活性剂法和膜过滤法）。

此外，还要对聚合物、细菌内毒素、抗补体活性等指标进行质量控制。

而重组抗ＨＢＶ抗体由通用工业生产细胞株表达，质量控制时会关注ＤＮＡ残留、抗生素残留、蛋白纯度等。

另外，抗ＨＢＶ单抗的糖基化检测也很重要。

在毒理学评价方面，因为已有很多经过相似工艺生产并含有相似成分的免疫球蛋白在人体安全应用的经验，血源性ＨＢＩＧ一般不需进行动物毒性评价；而抗ＨＢＶ单抗需进行毒理学评价，包括急性毒性、长期毒性、遗传毒性、生殖毒性及免疫毒性试验等。

药效学评价是整个临床前评价的核心。

ＨＢＩＧ是通过阴离子交换层析和超滤方式纯化人血浆蛋白成分获得的，主要成分是ＩｇＧ，所以认为其作用与人循环系统中的ＩｇＧ相同，只需对其抗－ＨＢｓ效价进行评价（不低于１００ＩＵ／ｍｌ）。

抗ＨＢＶ单抗在药效学评价中也需评价其抗－ＨＢｓ效价，但仅抗－ＨＢｓ效价高是远远不够的。

本实验室筛选的高效价抗ＨＢＶ单抗中，有几株在后续功能性评价（与ＨＢｓＡｇ形成抗原抗体复合物及血清病毒清除试验）中并没有很好的效果（数据未发表）。

因此，相比ＨＢＩＧ，重组抗ＨＢＶ抗体在临床前药效学评价中需进行更多研究。

本文主要介绍抗ＨＢＶ单抗研究中用到的药效学评价方法。

１　体外功能评价１．１　细胞感染评价体系虽然ＨＢＶ的研究已有半个多世纪的历史，但迄今尚未建立有效的细胞感染模型。

目前常见的研究体系如下所列。

１．１．１　树鼩细胞感染模型　该模型在１９９６年由Ｗａｌｔｅｒ等［１２］首次报道。

利用该系统，德国的Ｇｌｅｂｅ等［１３］发现ＨＢＶ的Ｐｒｅ　Ｓ１蛋白在感染树鼩肝细胞中起重要作用。

最近，李文辉等［１４］借鉴Ｗａｌｔｅｒ等报道的树鼩肝细胞体外培养方法，提供了钠离子－牛磺胆酸共转运蛋白为ＨＢＶ功能性受体的相关证据。

但是，影响树鼩原代肝细胞ＨＢＶ感染模型感染成功率的因素较多，实验的可重复性需提高，目前还不宜用于抗ＨＢＶ单抗的功能性评价。

１．１．２　人原代肝细胞感染模型　研究表明，ＨＢＶ可高效感染人肝细胞［１５，１６］。

但由于人肝细胞来源有限，批次间差异性大，评价ＨＢＶ单抗极少用到该细胞模型。

１．１．３　ＨｅｐＧ２细胞感染模型　ＨｅｐＧ２细胞是一种人肝肿瘤细胞，无法自然感染ＨＢＶ。

但通过人工转染病毒基因，可实现ＨＢＶ转录和复制。