小鼠XX细胞药物干预及核因子蛋白A凝胶电泳迁移率(EMSA)检测案例
emsa实验原理及步骤
emsa实验原理及步骤一、EMSA实验原理。
EMSA呀，它的大名是电泳迁移率变动分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay）。
这实验可神奇啦，就像是一场小小的分子追逐赛呢。
它主要是用来研究DNA 结合蛋白和其相关的特定DNA序列之间的相互作用。
原理简单来说就是，如果一段DNA序列和一个蛋白结合了，那这个DNA - 蛋白复合物在电泳的时候，跑的速度就会和单独的DNA不一样哦。
就像一个人单独跑步和背着个小包袱跑步速度有差别一样。
没结合蛋白的DNA跑得比较快，因为它轻呀，而结合了蛋白的DNA - 蛋白复合物比较笨重，在凝胶里就跑得慢些啦。
这样我们就能通过看电泳条带的不同位置，来判断有没有蛋白和DNA结合，超级有趣的原理呢。
二、EMSA实验步骤。
1. 准备样品。
- 首先得把我们要用的DNA弄好，这个DNA得是那种标记过的哦，就像给它做个小记号。
可以用放射性同位素标记，不过现在也有非放射性的标记方法啦，更安全一些。
然后就是蛋白样品，要保证蛋白是有活性的，就像我们要找的是活蹦乱跳能干活（和DNA结合）的蛋白。
2. 结合反应。
- 把标记好的DNA和蛋白放在一起，让它们在合适的缓冲液里“见面”。
这个缓冲液就像是一个小约会场所，里面各种离子浓度、pH值都得合适，这样DNA和蛋白才有可能看对眼，然后结合在一起。
就像两个人在合适的环境里才更容易产生感情一样。
3. 电泳。
- 把结合反应后的混合物放到聚丙烯酰胺凝胶里进行电泳。
这个凝胶就像是一个小跑道，不同的分子在上面跑。
没结合蛋白的DNA和结合了蛋白的DNA - 蛋白复合物就开始在凝胶这个跑道上跑起来啦。
电泳的时候电压要调好，就像给运动员们合适的比赛环境一样。
4. 检测。
- 如果是用放射性同位素标记的DNA，那就用放射自显影的方法来检测。
要是非放射性标记的呢，就用相应的检测试剂。
这样就能看到那些跑得慢的（结合了蛋白的）和跑得快的（没结合蛋白的）条带啦，就像在终点线看到不同的选手到达的情况一样。
emsa实验原理
EMSA实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸（一般是DNA）之间的相互作用。
该技术通过观察蛋白质-核酸复合物在凝胶电泳中的迁移率变化，可以揭示蛋白质与DNA结合的情况。
实验原理在EMSA实验中，首先需要准备一定浓度的DNA片段，通常是已知序列的DNA探针。
接着，将待检测的蛋白质与这些DNA探针一起混合，形成蛋白质-核酸复合物。
随后，将这些混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
在凝胶电泳过程中，如果DNA片段没有与蛋白质结合，那么它们将会沿着电场方向运动到特定位置。
但是，如果DNA片段与蛋白质结合形成复合物，则复合物的迁移率会受到影响，迁移速度将会减慢。
结果就是在凝胶中观察到不同带电簇的出现，这些带电簇代表了不同的蛋白质-核酸复合物。
通过对凝胶电泳结果进行分析，可以确定哪些蛋白质与DNA结合，并且可以定量检测它们之间结合的强度和亲和力。
这样的信息对于理解蛋白质功能以及基因调控机制至关重要。
实验步骤1.制备实验样品：准备已知序列的DNA探针和待检测的蛋白质溶液。
2.形成蛋白质-核酸复合物：将DNA探针和蛋白质混合，在合适的条件下形成复合物。
3.加载到凝胶中：将混合物加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
4.电泳分离：在合适的电场作用下，观察蛋白质-核酸复合物的迁移情况。
5.结果分析：分析凝胶电泳结果，确定蛋白质-核酸复合物的形成情况以及强度。
结论EMSA实验是一种简单有效的方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该实验，可以揭示蛋白质在基因调控中的作用，帮助科研人员深入理解这些生物大分子之间的相互作用机制。
EMSA技术在基因编辑、药物研发等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学的发展起着重要作用。
凝胶迁移(EMSA)实验总结
EMSA实验总结实验原理：凝胶迁移实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究蛋白与核酸（DNA/RNA）相互作用的技术。
实验步骤：（参考碧云天化学发光法EMSA 试剂盒）1.蛋白：利用原核表达蛋白，进行纯化后测定蛋白的浓度（BSA法测定）。
4 ℃保存。
注：提取的植物总蛋白（贝博试剂盒）进行EMSA实验，蛋白易滞留在点样孔，具体原因尚不明确。
2.探针：合成biotin标记的探针、未标记的探针、突变探针（需要HPLC纯化）。
注：合成单链探针，使用时1:1混合，利用PCR仪合成双链探针。
具体步骤：探针根据使用浓度用DEPC水稀释，正链：反链 = 1:1 ,PCR程序：75 ℃30 min，以后每个循环降低0.1 ℃，直到0 ℃。
3.6 % EMSA非变性胶：制胶前需要把制胶模具清洗干净，不能有SDS残留。
一块胶的用量（6 mL），不用制浓缩胶。
5 × TBE 1 mL30 % acrylamide/bisacrylamide 2 mL40 % 甘油 625 μLO 3.125 mLdd H210 % 过硫酸铵 150μLTEMED 5 Μl4.EMSA结合反应：（20 µl反应体系，蛋白和探针根据实验需求和预实验进行调整）阴性对照反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl标记好的探针样品反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子标记好的探针探针冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的探针标记好的探针突变探针的冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的突变探针标记好的探针Super-shift反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子目的蛋白特异抗体标记好的探针在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。
EMSA实验详情
Electrophoretic Mobility Shift Assay--电泳迁移率检测点击次数：137 发表于：2008-06-18 14:53转载请注明来自丁香园来源：互联网凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，已经成为转录因子研究的经典方法。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。
该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。
生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发生在转录水平。
近年来，基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长一段时期内功能基因组学研究的热点之一。
在转录水平，基因的转录行为是由顺式作用元件（cis-acting elements）和反式作用因子（trans-acting factors）（即转录因子）相互作用调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（loci control region，LCR）中顺式作用元件和相应转录因子至关重要。
但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：一是分离和鉴定基因5＇端核心启动子等顺式作用元件，二是分离和鉴定与各顺式作用元件相对应的转录因子，三是检测各顺式作用元件与对应转录因子的相互作用。
鉴定顺式调控元件和转录因子是研究得比较多的内容，而对于顺式作用元件与对应转录因子的相互作用这个层次的研究相对较为薄弱。
(完整版)凝胶迁移实验(EMSA)实验方法
凝胶迁移实验（EMSA）实验方法凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。
最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。
根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。
对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。
现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml（2）冰浴5min（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳（1）制备6.5%（2（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。
（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）4、转膜（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。
凝胶迁移实验(EMSA)
凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
1实验方法和原理凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
2实验材料、试剂、仪器耗材DNA样品[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝等水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽等3实验步骤一、探针的标记1. 如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针(1.75 pmol/微升) ：2微升。
凝胶迁移实验(EMSA)实验方法
凝胶迁移实验（EMSA）实验方法凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。
最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。
根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。
对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。
现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml（2）冰浴5min（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳（1）制备6.5%（2（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。
（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）4、转膜（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。
凝胶迁移阻滞实验(EMSA)实验操作方法及注意事项
凝胶迁移阻滞实验（EMSA）转载丁香园大神的帖子！非常详细！EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的! EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体,注意细节!EMSA的整体性包括6大点:探针制备(设计,合成,标记,纯化,退火);个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等);核蛋白制备;浓度测定;EMSA操作;实验时竞争设计. 这六大点都是会直接影响到EMSA试验的成功与否!简介:EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
发展:从发展史来看,这项实验技术起初是用32P同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,所以从定购到标记再到做完试验,必须14天完成,种种制约因素导致现代科技发展非同位素EMSA试验技术,这就出现了地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术.在实践中没多久,地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术就暴露了一个严重的缺陷,标记的探真纯化后灵敏度弱,导致实验结果的信号不行,最终就出现了现在的生物素标记探真的EMSA实验技术.配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题,到目前为止, 生物素标记探真的EMSA实验技术广为应用!EMSA试验成功的关键因素:1.1.试验设计,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.2.核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2.掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高,但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织, 细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多. 而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!!3.探针的制备:又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4.EMSA实验技术. 这一点主要是操作的细节问题! 下面会更细的谈到.技术要点:关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制胶必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）3.3ml50% Glycerol（50%甘油）1.0mldH2O（蒸馏水）14.8mlTEMED（四甲基乙二氨）20µl脱气10min10% AP（过硫酸氨）120µl总量20.0ml2. 一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC)l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC)l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC)l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC)l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC)l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC)l 2×Blocking Buffer（2×封闭液）(4 oC)l 5×Washing Buffer（5×洗涤液）(4 oC)l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC)l Binding-membrane（结合反应膜）(RT)3. 结合反应每次结合反应需1-5µl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15µl（1）结合反应体系：10X 结合反应液1.5µlPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0µl细胞核提取物* ? µl双蒸水* ? µl混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针0.5µl总量15µl混匀室温静置20分钟或以上。
EMSA凝胶阻滞或电泳迁移率实验技术服务
EMSA凝胶阻滞或电泳迁移率实验技术服务EMSA凝胶阻滞或电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay）：⼀种在体外研究DNA或RNA序列与蛋⽩结合的实验⽅法，可做精准的结合motif验证与检测。
基本原理是：
DNA-蛋⽩质或RNA-蛋⽩质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理，当转录因⼦或调控因⼦与特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将⼩于未结合蛋⽩的DNA，从⽽检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋⽩或调控因⼦。
技术原理：
技术服务流程：
1.WB检测饵蛋⽩的表达⽔平
2.细胞裂解，获取裂解液
3.免疫共沉淀
4.获取互作结合蛋⽩
5.WB检测或MS分析
优势：
1. ⽣物信息学预测DNA或RNA与蛋⽩结合的motif基序
2.可为客户做定制服务，融合表达，以标签抗体调取结合互作的蛋⽩，实验更加严谨可靠真实
3.设置完整组别，标记探针组，标记探针-蛋⽩组，⾮标探针组，⾮标探针组+蛋⽩组，实验更加完善
4.提供可直接⽤于⽂章的标准结果图，以及实验原图结果
5.提供完善的实验报告，更利于⽂章的撰写和申请
适⽤研究：
寻找蛋⽩结合的特异DNA或RNA的motif，精准定位结合靶标序列。
凝胶迁移或电泳迁移率实验 Protocol
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，也被称为凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验。
凝胶迁移实验的实验原理是基于DNA结合蛋白与目标DNA探针形成复合物后，由于分子量增大，在凝胶电泳过程中迁移速度较慢。
通过与未结合蛋白的探针进行对比，就可以确定是否存在目标蛋白与探针的相互作用。
实验所需的试剂和耗材包括：生物素标记试剂盒、凝胶迁移实验试剂盒（碧云天GS008 GS009）、TBE缓冲液（Tris-硼酸-EDTA）、去离子水、Tris、硼酸、40%甲酰胺、10%SDS、甲醇、超纯水等。
实验仪器包括：水平摇床、紫外可见光分光光度计、天平、称量纸、记号笔、计时器、移液器、量筒、滴定管、水平离心机、暗盒或成像系统等。
实验准备工作包括：配置TBE缓冲液，准备适量的去离子水，称量并溶解生物素标记试剂盒中的各组分，配置凝胶迁移实验试剂盒中的各组分。
实验方法如下：1.在室温下，将标记探针与蛋白溶液混合孵育，用封口膜封口，放入摇床中孵育。
2.在孵育结束后，进行酚仿抽提，以去除未结合的蛋白。
3.将样品进行电泳，电泳结束后将凝胶取下并放在转移膜上，用UV胶将其固定。
4.用显色剂显色，并记录结果。
注意事项包括：实验操作要保持清洁，防止污染；要准确控制实验条件，包括温度、pH等；孵育时间要适当，不宜过长；要根据不同目标蛋白选用不同的抗体。
常见问题及解决方法包括：如果蛋白与探针的结合不牢固，可以尝试改变抗体浓度或改变孵育时间；如果电泳结果不清晰，可以尝试改变凝胶浓度或改变电泳时间；如果显色结果不清晰，可以尝试改变显色剂浓度或改变显色时间。
总之，凝胶迁移实验是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可以用于定性和定量分析。
在实验过程中要注意保持清洁，控制好实验条件，并选择合适的抗体来检测目标蛋白与探针的相互作用。
同时也要注意常见问题的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。
热点实验：凝胶电泳迁移率(EMSA)实验案例介绍
小鼠XX细胞药物干预及核因子蛋白A凝胶电泳迁移率（EMSA）检测实验分组：A组对照组(DMEM 1000ul)B组 A药物组（DMEM 960ul+A药物40ul ）C组 A药物+B药物组（DMEM 892.5ul+ A药物40ul+B药物 67.5ul）D组 B药物组（DMEM 932.5ul+B药物 67.5ul）注：培养基与B药物，2小时候加A药物，24小时后收集细胞检测。
实验试剂：LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(PIERCE,20148)；Chemilumi-Nucleic Acid Detection Kit（PIERCE,89880）；NF-KB p65探针序列；Boitin-N4-CTP（invitrogen,15918-18）；TdT（NEB,M0252L）；Poly(dI.dC) （sigma,P4929）；Hybond-N+ 尼龙膜（Amersham,RPN303B）；6×Loading Buffer (TAKARA)实验仪器：离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TG16-W）；电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply(BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell(BIO-RAD,Catalog#165-3301)；电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170-3930)；生物素标记探针：1、按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩超纯水 25μl5×TdT Reaction Buffer 10μl探针(1μM) 5μlBiotin-N4-CTP 5μlTdT (2U/μl) 5μl37℃反应30分钟2、加入2.5μl 0.2M EDTA终止反应3、加入50μl 酚：氯仿，短暂涡漩，15000g离心2min，保留上层水相，-20℃保存。
emsa凝胶迁移实验原理
emsa凝胶迁移实验原理什么是emsa凝胶迁移实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常见的核酸-蛋白质相互作用研究技术。
它通过利用蛋白质与核酸结合形成复合物的特性，在电场下进行凝胶电泳迁移，从而分析和鉴定核酸与蛋白质之间的相互作用。
这个过程的实质是先将核酸与蛋白质按照一定比例混合反应，形成核酸-蛋白质复合物，然后将这个复合物与未结合的核酸分子一起进行凝胶电泳。
核酸-蛋白质复合物迁移速度较慢，而游离核酸迁移速度较快，因此可以通过观察凝胶中的带状图案来判断核酸与蛋白质是否发生相互作用。
EMSA凝胶迁移实验原理包括以下几个关键步骤：1. 核酸与蛋白质的结合：首先，需要获得待检测蛋白质所特异结合的核酸序列。
这个核酸序列可以是DNA、RNA或核酸伸展结构。
然后，将核酸与蛋白质按照一定比例混合，在适当的反应条件下进行结合。
常用的反应条件包括缓冲液pH值、离子浓度、温度等。
2. 核酸-蛋白质复合物的分离：混合物中的核酸-蛋白质复合物通常比未结合的核酸分子具有较大的分子量，迁移速度较慢。
因此，可以通过凝胶电泳来将复合物与游离的核酸分子分离开来。
常用的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
3. 凝胶迁移：将经蛋白质和核酸反应后的混合物加载到凝胶中，然后通过应用电场使核酸与蛋白质复合物迁移。
电场的作用是带动带电的分子在凝胶中移动，移动速度与其电荷量和形状有关。
4. 分析结果：通过凝胶电泳的分离，可以得到带状图案。
观察不同带状图案的位置、强度和大小可以判断蛋白质与核酸的结合情况。
当蛋白质与核酸发生结合时，形成的复合物迁移速度较慢，带状图案位置上移或移动较慢；反之，当蛋白质与核酸未结合时，带状图案位置下移或迁移速度较快。
需要注意的是，EMSA凝胶迁移实验只能证明核酸与蛋白质之间是否存在相互作用，无法提供相互作用的具体结合位点信息。
因此，为了进一步研究相互作用的机制，通常需要结合其他技术手段，如DNase I酶切、ChIP-Seq等。
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)
1)什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
2)作这样的实验需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。
还必须制备同位素标记的DNA或RNA。
一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。
Promega公司的Riboprobe?/sup系统（a,b）（目录号P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素标记的RNA的体外合成，DNA5`末端标记系统（目录号U2010）用于制备DNA探针，结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非离子去污剂。
在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage?/sup分析。
凝胶迁移实验原理与步骤
凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移实验：凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
EMSA原理：凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针根据研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA 片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
EMSA原理示意图实验基本步骤：一、探针的标记1、如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。
（3）Nuclease-Free Water ：5微升。
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。
凝胶迁移实验EMSA实验步骤及方法
凝胶迁移实验EMSA实验步骤及方法凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility s hift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA 结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
实验步骤探针的标记→ 探针的纯化→ EMSA胶的配制→ EMSA结合反应→ 电泳分析四大关键因素一、实验设计用药品刺激细胞时，设计的药品浓度和时间梯度的问题，这个很关键！【建议总结】：一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度！二是用药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程。
时间可以长一些，主要根据自己的药物刺激特性确定时间点。
二、核蛋白样品的制备1.注意用专用的核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像；2.掌握好核蛋白的浓度和纯度，尤其是浓度。
能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是比较高的! 一般要求在1ug/ul以上！有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，否则影响结合反应拿不到结果。
这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失。
3.同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多。
而组织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会不容易得到EMSA阳性结果！三、探针的制备生物素标记到3’端还是5’端？其实我觉得最好还是两端都标记，这样才能更好的提高灵敏度，国内的标记技术我还不是很了解，我们这边的探真都是国外定做的，还算可以，其制作程序如下：合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程。
emsa凝胶迁移实验原理 -回复
emsa凝胶迁移实验原理-回复什么是EMSA凝胶迁移实验？EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）凝胶迁移实验，也称为荧光着色凝胶迁移电泳（Fluorescence-Based Gel Shift Assay），是一种常用的分析蛋白质与核酸的相互作用的实验方法。
它的原理基于蛋白质与核酸结合后，形成复合物的电泳迁移速度较慢，从而可以通过凝胶迁移实验来研究这种相互作用。
EMSA凝胶迁移实验步骤：EMSA凝胶迁移实验一般分为以下步骤：制备蛋白质样品、制备探针、组装电泳体系、进行凝胶电泳、可视化和数据分析。
下面将一一介绍。
制备蛋白质样品：首先，需要从细胞中提取目标蛋白质。
其中，核酸结合蛋白质可能需要使用非变性提取缓冲液来保持蛋白质的完整性。
接着，使用蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度，并将提取的蛋白质样品进行冻存备用。
制备探针：探针是通过标记核酸分子，使其可以被可视化的荧光或放射性探针来识别的一种分子。
一般来说，探针可以通过合成或PCR方法获得。
然后，使用标签化的核酸标记试剂对探针进行标记，例如使用小分子的双链DNA或RNA标记试剂进行标记。
组装电泳体系：将已标记的核酸分子和目标蛋白质混合，在细胞提取液的缓冲液中，加入一定浓度的非特异性的竞争性DNA或RNA，这种非特异性核酸可以防止非特异性结合。
然后，将混合溶液与凝胶电泳缓冲液混合，并加入适当的电泳缓冲液。
进行凝胶电泳：将混合溶液加入到已经制备好的凝胶模板中，然后将凝胶模板转移到电泳仪中。
在电泳仪中，将电泳仓填满电泳缓冲液，然后将凝胶模板放入电泳仓中。
启动电泳，在一定的电压下，核酸和蛋白质复合物会从样品孔口开始电泳，不同的核酸和蛋白质复合物根据大小和电荷的不同而迁移的速度也会有所不同。
经过一段时间后，关闭电源，取出凝胶模板。
可视化和数据分析：将凝胶模板置于荧光成像仪或放射线扫描仪上，观察标记物的荧光或放射性信号。
emsa实验
emsa实验
EMSA实验是基于DNA结合蛋白与DNA的特异性结合，依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物。
通过电泳迁移率的变化来进行定性和定量分析，钟鼎生物提供的EMSA实验（凝胶/电泳迁移率实验）基于生物素标记探针与对应的DNA结合蛋白的特异性结合，设计合理、科学的实验方案，为客户提供验证性的EMSA，竞争性的EMSA以及超迁移EMSA(Super-shift EMSA）实验服务。
1、细胞核蛋白或纯化的转录因子，部分实验亦可使用重组表达的蛋白，依据实验设计每张膜至少提供50ul，浓度大于0.5mg/ml。
2、探针序列，如无探针序列，请提供DNA结合蛋白相关信息或相关文献，便于钟鼎生物技术人员设计探针。
3、结合蛋白特异性抗体50ul以上，浓度大于0.5mg/ml。
emsa实验原理及应用
emsa实验原理及应用EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay），即电泳迁移位移实验，是一种常用的分析蛋白质与核酸相互作用的方法。
该实验基于核酸与蛋白质结合后在凝胶电泳中的迁移速度变慢的原理，通过观察核酸与蛋白质结合复合物的迁移差异，来研究它们之间的相互作用。
EMSA实验的原理是基于核酸与蛋白质相互作用后的电泳迁移差异。
在实验中，首先需要获得核酸分子（通常是DNA或RNA）和蛋白质样品。
然后，将核酸与蛋白质按照一定的比例混合，并进行反应使其结合。
接下来，将反应体系进行凝胶电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在凝胶电泳过程中，核酸与蛋白质复合物的迁移速度会变慢，而未结合的核酸则会较快地迁移。
这是因为核酸与蛋白质结合后形成的复合物比未结合状态下的核酸分子大，电荷密度也增加，从而导致复合物的迁移速度较慢。
通过观察电泳过程中形成的带状图案，可以确定核酸与蛋白质是否发生了结合。
EMSA实验在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用来研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。
这对于理解基因表达、调控机制以及疾病的发生发展具有重要意义。
其次，EMSA实验可以用来鉴定蛋白质的结合位点。
通过对不同长度或突变的核酸序列进行EMSA实验，可以确定蛋白质与核酸的结合位点，进一步研究其功能。
此外，EMSA实验还可以用于筛选与特定蛋白质结合的核酸序列，从而寻找潜在的药物靶点。
尽管EMSA实验在研究蛋白质与核酸相互作用方面具有重要的应用价值，但也存在一些限制。
首先，EMSA实验只能提供间接的蛋白质与核酸结合信息，无法直接确定结合的强度或亲和力。
其次，EMSA实验需要一定的实验操作技巧，且耗时耗力。
此外，由于核酸与蛋白质之间的相互作用是动态的，EMSA实验只能提供一瞬间的结合信息，无法反映动态变化过程。
EMSA实验是一种常用的研究蛋白质与核酸相互作用的方法。
通过观察核酸与蛋白质结合复合物的电泳迁移差异，可以研究它们之间的相互作用及其调控机制。
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小鼠XX细胞药物干预及核因子蛋白A凝胶电泳迁移率
（EMSA）检测案例
实验分组：
A组对照组(DMEM 1000ul)
B组 A药物组（DMEM 960ul+A药物40ul ）
C组 A药物+B药物组（DMEM 892.5ul+ A药物40ul+B药物 67.5ul）
D组 B药物组（DMEM 932.5ul+B药物 67.5ul）
注：培养基与B药物，2小时候加A药物，24小时后收集细胞检测。
实验试剂：LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(PIERCE20148)；Chemilumi-Nucleic Acid Detection Kit（PIERCE89880）；NF-KB p65探针序列；Boitin-N4-CTP （invitrogen15918-18）；TdT（NEBM0252L）；Poly(dI.dC) （sigmaP4929）；Hybond-N+ 尼龙膜（AmershamRPN303B）；6×Loading Buffer (TAKARA)
实验仪器：离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TG16-W）；电泳电源：
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis CellMini Teans-Blot Moduleand PowerPac Basic
Power Supply (BIO-RADCatalog#165-3323)；电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RADCatalog#165-3301)；电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RADCatalog#170-3930)；
生物素标记探针：
1、按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩
超纯水，25μl
5×TdT Reaction Buffer，10μl
探针(1μM) ，5μl
Biotin-N4-CTP，5μl
TdT (2U/μl) ，5μl
37℃反应30分钟
2、加入2.5μl 0.2M EDTA终止反应
3、加入50μl 酚：氯仿，短暂涡漩，15000g离心2min，保留上层水相，-20℃保存。
4、结合反应前等体积混合两条标记引物，90℃退火引物，并自然冷却至4℃，待用。
抽提核蛋白：
1、2-3×106密度铺60mm细胞培养板，培养约12h
2、移去细胞培养基，PBS洗细胞一次
3、加入1mL Buffer B 于培养板，将细胞刮下收集于1.5mL离心管
4、1000g 离心2min，吸去上清
5、加入160μl Buffer A，重悬沉淀，冰育20min
6、加入含2.5％NP-40的Buffer A，涡漩10s，4℃ 15000g 离心5min
7、吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃涡漩25min，4℃ 18000g 离心5min
8、吸取2μl上清采用Bradford法测蛋白质浓度，其余储存于-80℃
蛋白浓度测定如下表：mg/ml
配置非变性聚丙烯酰胺凝胶:略
EMSA实验步骤：
1、按如下顺序加入反应物，温和混匀（20μl体系）
ddw ――
10×binding buffer ，2μl
Poly(dI.dC) ，1μl
核蛋白粗提物，10μg（温和混匀）
生物素标记的探针（0.1μM），0.5μl
室温反应20min，加入6×Loading Buffer 4μl，上样10-20μl，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。
2、电转前将尼龙膜浸泡于0.5×TBE至少10min以预冷的0.5×TBE为电转缓冲液100V转胶于尼龙膜上，45min
3、UV BOX下，以贴近膜一面面向紫外光源，以254nm激发光交联15min
4、加入25mLBlocking Buffer，以约70rpm在脱色摇床上封闭30min
5、将SA-HRP以1:30000-50000稀释于12mL Blocking Buffer，脱色摇床70rpm作用20min(洗膜过程全部在脱色摇床上进行约100-140prm)
6、Buffer II 25ml 5min
7、wash buffer 25ml 15min
8、Buffer III 25ml 5min×2次
9、0.1%SDS in 2×SSC 5min×2次
10、0.1%SDS in 1×SSC 10min×2次
11、0.1%SDS in 0.5×SSC 5min×2次
12、将膜于滤纸稍适吸干，加入到以1:20稀释的发光反应液，作用1-5min，将尼龙膜封于保鲜膜中（避免褶皱和气泡的产生），暗室曝光1-5min，检测信号。
实验结果：采用Gel Pro 4.0 软件分析（核因子A band）IOD参考数值
p：probe only. 只加入标记探针未加入核蛋白抽提物。
C: Postive Control : 采用德国MERCK公司 Cat#71183-3，Cat#71377-3，Cat#71518-3试剂盒中Hela control Nuclear Extract。