特殊禽流感在肺部体液免疫动力学是局部抗体产生的标志

特异性禽流感在肺部体液免疫动力学对于局部抗体产生具有指示性摘要：在感染禽流感后，呼吸系统里的免疫球蛋白的作用和机理尚未被研究。

在这个研究中，我们确定了感染低致病性禽流感之后，在肺、脾、血液和骨髓（BM）中的抗体分泌细胞（ASC）和特异性病毒ASC的总数。

在肺脏的局部和脾脏系统抗病毒的体液免疫应答反应被诱导产生。

在肺脏和骨髓中的反应先于在脾脏和血液中，在初次接种一个星期的肺脏和骨髓中，已经发现特异性病毒IgY ASC，表明呼吸系统的免疫应答不会发生于脾脏中，但是会在肺脏的局部发生。

ASC是存在于肺脏的血液中；基于统计相关性，在淋巴细胞分离中，ASC从肺脏中被共同分离对于在肺脏中的ASC没有主要的影响。

关键词：低致病性禽流感体液免疫呼吸道局部全身抗体分泌细胞⒈前言在流感病毒感染的过程中，体液免疫应答通过绑定到病毒抗原上而有助于病毒中和反应。

在感染禽流感病毒（AIV）的鸡体内，接种免疫后呼吸系统的免疫球蛋白的作用已经被研究过，其包括分泌的Ig在眼泪和血清中的水平和在哈氏腺（HG）的抗体分泌细胞（ASC）的水平，但除了在肺脏本身局部的ASC水平。

众所周知，抗体是参与禽类机体抵抗AIV，即保护疫苗接种可以获得血清内高浓度的特异性流感抗体（Kumar 等，2007; Maas 等，2009; Nayak 等, 2009）。

在这项研究中，我们确定了在低致病性（LP）流感的感染中，ASC的总数和病毒特异性ASC的数量。

鸟类的肺脏中，有着高度组织性的淋巴结构和广泛分布的淋巴和骨髓细胞。

支气管相关淋巴组织（BALT）结构位于主支气管和尾部的次级支气管的连接处（Bienenstock 等，1973; Van Alstine 和Arp,1988）。

相比之下，人和鼠肺脏的BALT是可诱导的（Kocks 等, 2007; Moyron-Quiroz 等, 2004; Tschernig 和Pabst, 2000），鸡的BALT是基本存在的（Bienenstock 等, 1973）。

有人提议在家禽中，BALT是正常淋巴结构，来弥补缺乏排水性淋巴结（Fagerland和Arp,1993）。

Van Ginkel 等人（2008）研究了粘膜和系统的体液免疫反应之后随着滴眼流感疫苗的接种的血凝素（H）5的表达复制有能力的无（RCA）腺病毒的人的缺陷E1/E3 Ad5 型载体。

在HG中，高频率的特定的H5 IgA ASC被发现，在血清和泪液中，H5特异性抗体存在于其中。

对于禽类呼吸系统的ASC的研究已经通过使用其他疾病模型被执行过了。

在感染新城疫病毒（NDV）后的呼吸系统的抗病毒免疫力是依赖于局部产生抗体（Al-Garib 等,2003）。

随着NDV的感染，NDV的特异性抗体被发现存在于气管灌洗液中（Al-Garib 等, 2003）、唾液（Ewert 等,1979）和泪液中。

人们认为这些NDV特异性的IgY是血液到泪液的渗出物（Toro 等, 1993），而NDV特异性IgM和IgA主要产生于局部的HG（Russell 和Koch,1993）。

多聚免疫球蛋白受体（pIgR）（Wieland 等, 2004），其是有望能够穿过上皮细胞到达粘膜分泌物，然而，IgY是不可以通过此种方式分泌的。

在志愿者的鼻腔灌洗液中，特异性HA IgA被认为在防护流感感染中是重要的传递物质（Clements 等, 1986）。

在某些情况下，儿童的鼻腔分泌物里的IgG是局部性的产生；然而，在成年人的鼻腔灌洗液中存在的IgG，被证实是血清渗出物，其在血清和鼻腔灌洗液中的浓度是有显著的正相关性（Wagner 等, 1987）。

在本研究中，我们利用ELISPOT试验，确定了鸡感染LP H7N1 AIV 之后特异性同型ASC的频率。

我们假设感染流感病毒之后，在呼吸道和脾脏系统，体液免疫应答将被诱发；这些应答反应将不同在诱发的类型，随着局部产生的IgA参与防护抵抗呼吸道的感染。

在肺脏的局部和脾脏的全系统，抗病毒体液免疫应答被诱发。

在肺脏的应答反应先于脾脏。

在初次预防接种（p.p.i.）一个星期之后，特异性病毒IgY ASC已经在肺脏中被发现。

ASC存在于肺脏的血液中；基于统计相关性，在淋巴细胞分离中，ASC从肺脏中被共同分离对于在肺脏中的ASC没有主要的影响。

⒉材料与方法⒉1 鸡Lohman Brown ED18蛋是从Verbeeks Broederij BV（伦斯沃德；荷兰），其在乌特勒支大学动物设备中孵化。

动物以小组为单位，随意地采食和饮水。

按照荷兰的法律，所有的实验都需要经荷兰乌德勒支大学动物实验委员会的兽医教学人员依照荷兰的实验动物管理规则来批准。

2.2 培养液低致病性情流感毒株H7N1 A/鸡/意大利/1067/99（是由Drs. I Capua and W. Dundon 提供）是在SPF鸡胚中感染。

收集了尿囊液，300g∕5min离心分离全部的细胞碎片。

为了确定病毒效价，病毒被接种到了SPF鸡胚中。

病毒的效价是1.6×109 EID50/ml，病毒被储存在﹣80℃中，直到以后使用。

这些鸡在鼻内接种了0.1ml和气管内接种了0.1ml的溶于无菌PBS 中的1×106 EID50/ml。

使用的ELISPOT病毒第一次分离是3000g∕30min，之后，上清液再用100000g∕1h离心分离。

弃掉上清液，有悬浮颗粒存在于PBS液中。

蛋白质含量则使用BCA蛋白质分析设备（Pierce）来测定。

等分收集病毒，储存在﹣80℃中，备用。

2.3 实验设计对三周龄的鸡通过气管很鼻腔进行基本的预防接种。

第一组鸡一周和三周p.p.i，第二组的禽类和两组的禽类都给予继发感染。

第二次接种之后一周的一组被杀和最后被杀的是第二次接种之后六周。

在所有的时间点都包括未感染的鸡。

每组都包括4只禽类。

收集所有的包括BALT组织的肺脏，脾脏，骨髓，全血和血清。

肺脏的一部分用于分离RNA，剩余部分用于ELISPOT 。

2.4 制备细胞肝素化的血液，肺脏，脾脏，股骨和胫骨都被收集。

把肺脏切成小块，用2.4 mg/ml 胶原酶A (Roche)来消化和用1 mg/ml DNAse I (Roche)在37℃溶解30min。

BM则通过使用PBS 被洗脱出。

通过轻轻挤压一个70lm的细胞过滤器可制备出脾脏，肺脏和BM的单个细胞悬浮液。

白细胞是通过使用Ficoll-Paque (GE Healthcare) 1000∕20min的密度梯度离心而分离得到，然后用PBS洗两次。

之后，细胞被重悬在的RPMI中，其增加了5%FCS、2mM 谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和100 lg/ml 链霉素在2 ×106 cells/ml。

在聚蔗糖密度梯度离心之后，等离子相的血液样品被保存在﹣20℃中，为ELISA备用。

2.5 ELIAPOT 确定总体和病毒特异性ASC多层筛 96-wells 过滤板（Millipore）被包裹着溶在50mM碳酸氢钠缓冲系（pH = 9.6）中的10 lg/ml 山羊抗鸡IgL（Bethyl 实验室），或者是溶于碳酸氢钠缓冲系中的1 lg/well H7N1病毒。

平板在4℃中保持1—3天，在37℃，用PBS和5%FCS封闭2h。

弃掉封闭液，加入50µl的细胞，分三个不同的浓度，起始于2×106∕ml和1:5连续稀释。

平板在37℃下、5% CO2过夜培养。

培养后，用PBS 和0.05%的Tween-20清洗三次。

加入鼠抗鸡IgM （HIS-C12; Cedi Diagnostics Lelystad）、碱性磷酸酶标记的兔抗鸡IgY（-AP; ProSci Incorporated）或者鼠抗鸡IgA（Southern Biotech），然后在室温下培养1h。

然后清洗板4次。

平板在生长于NBT/BCIP溶液中（Roche）的抗IgY AP中培养和反应会在自来水中停止。

剩余的含有山羊抗小鼠AP的平板在室温下培养1h，洗涤，然后发展。

随着紫色斑点的出现，ASC用A.ELVIS设备和Eli.Analyse软件（v5.0）来分析，考虑到斑点数的自动计数基于最少6个、斑点最低亮度5和斑点的低斜度。

2.6 ELISA竞争性阻断ELISA IDEXX FlockChek 禽流感MultiS-Screen Ab试剂盒（IDEXX）使用按照产品说明书。

总之，每个充分稀释好的样品100µl或者适当的阳性∕阴性对照血清100µl 加入到涂有AIV病毒的平板上。

平板在室温下培养1h，然后洗涤。

加入辣根过氧化物酶标记的抗AIV聚合物也检测到游离的涂层，平板在室温下培养30min。

平板进行，然后通过使用TMB显色液进行显色。

使用终止液使显色终止，在650nm处读取吸光度。

样品∕阴性（S∕N）比率的计算如下：S ∕N比率=样品吸光度∕阴性对照吸光度。

2.7 数据分析所有的数据分析是通过SPSS 16.0 软件进行Kruskal-Wallis 或者Mann-Whitney U 检测。

相关系数确定是利用SPSS 16.0 软件。

图表准备使用Prism Graphpad 4。

3.结果3.1 感染一周以后血清抗体的检测感染H7N1之后，每个时间点的血清抗AIV抗体是使用ELISA来确定的（图1）。

在这个竞争性阻断ELISA 中，含有AIV特异性抗体的样品有着一个样品∕阴性（S∕N）比例﹤0.5 。

因此，低S∕N比例的样品要比高S∕N比例的样品包含更多的AIV特异性抗体。

一周p.p.i的AIV特异性抗体仅仅在4只中的一只中被发现。

三周p.p.i的，所有的鸡对于AIV特异性抗体都显示阴性（未显示）。

在第二次感染相同的H7N1毒株之后，在一周p.p.i的所有鸡中都检测到了AIV特异性抗体。

六周p.p.i的四只鸡中的三只抗体水平已经减少到检测范围以下。

图 1 鸡感染H7N1后的流感特异性抗体。

在一周和三周p.p.i.和一周三周p.s.i的血清中利用竞争性阻断ELISA IDEXX FlockChek禽流感MultiS-Screen Ab试剂盒（IDEXX）确定特异性流感抗体。

在S∕N值﹤0.5的样品中检测到了流感特异性血清抗体，S / N值> 0.5被认为是阴性。

数据为S∕N值+SEM的平均值。

3.2 感染病一周之后的ASC总数的最大值我们检测了在肺脏和脾脏系统，AIV感染对抗体产生的影响。

所以，进行两个总体和病毒特异性ASC ELISPOT。

列举从肺脏分离到的可能的血液污染物，同样，我们使用从血液中分离到的抗体来进行ELISPOT。

在人和老鼠中，BM是一个适合浆细胞长期存在的微环境（Radbruch 等, 2006; Tokoyoda 等, 2010），因此，我们也在从BM分离出的淋巴细胞上进行ELIAPOT。