血肿区灌注罗格列酮对家兔脑出血模型病 灶周围PPARγ和MMP-9表达的影响

目录摘要 (1)前言 (2)材料与方法 (4)结果 (14)讨论 (22)结论 (25)参考文献 (25)英文摘要 (29)致谢 (31)缩略词表 (32)论文原创性声明 (33)附：综述 (34)血肿区灌注罗格列酮对家兔脑出血模型病灶周围PPARγ及MMP-9表达的影响专业：神经病学研究生：吴俊杰导师：伍国锋教授【摘要】目的以血肿周围PPARγ及MMP-9变化为指标，探讨立体定向微创颅内血肿清除术后于病灶区灌注罗格列酮对颅内血肿继发性脑损伤的治疗作用。

方法将90只家兔(雌雄不分)随机分为6组，分别为正常对照组（NC组）、假模型组（Sham组）、模型对照组（MC组）、微创组（MI组）、罗格列酮组（RSG组)和微创+罗格列酮（MI+RSG）组。

每组15只家兔按体重相近分为5个配伍组，每个配伍组中的家兔分别在模型复制成功后第1天、3天、7天处死。

断头取脑后，分离出以针道为中心的直径1.5cm内的脑组织，平均分为5块：用western blot 检测PPARγ的表达；用western blot及RT-PCR定量MMP-9蛋白及mRNA的表达；称量干重及湿重计算血肿周围组织水含量；以伊文思蓝为追踪剂检测血脑屏障通透性。

结果 1.模型制作情况：MC、MI组家兔在造模后3天各死亡1只，其余动物均完成实验过程。

2. PPARγ的蛋白表达结果：MC、MI、RSG、MI+RSG组在造模后1天、3天、7天测得PPARγ均高于NC组（p<0.05），NC组与Sham组差异无统计学意义（p＞0.05），RSG、MI+RSG组较MC、MI组均升高（p＜0.05），MI 组较MC组降低（p＜0.05），MI+RSG组较RSG组升高（p<0.05），MI+RSG组在脑出血3天时测得PPARγ较第1天时增高，7天时测得结果最低，差异有统计学意义（p＜0.05）。

3.血肿周围脑组织MMP-9蛋白及mRNA表达、血脑屏障通透性、脑组织水含量的结果:MC、MI、RSG、MI+RSG组在造模后1天、3天、7天测得结果与NC组相比均升高（p<0.05），NC组与Sham组差异无统计学意义（p＞0.05），MI+RSG组较MC、MI、RSG组降低（p＜0.05），MI组较MC、RSG组降低（p<0.05），RSG组较MC组升高（p<0.05）。

MI+RSG组结果随时间的增加而递减，7天时测得结果最低（p＜0.05）。

结论 1.罗格列酮能够抑制MMP-9的表达，减少炎症反应，改善神经损伤；2. 在微创血肿清除术后干预PPARγ可能为治疗脑出血引起的继发性损伤提供靶点，为临床治疗技术的开发提供了一定的理论依据。

【关键词】脑出血；罗格列酮；过氧化物酶活化增生受体γ；立体定向微创血肿清除术；基质金属蛋白酶9；血脑屏障通透性；脑组织周围水含量前言自发性脑出血是原发性高血压的常见并发症，具有很高的发病率和死亡率，幸存者也会存在严重的神经功能缺损[1,2]。

颅内血肿引起的脑损伤分为两个阶段。

第一阶段为出血后0到4小时内，主要为血肿的压迫作用引起的机械性损伤，血肿挤压引起周围的神经元和胶质细胞死亡，导致细胞水肿及组织坏死；第二阶段为出血后4小时到7天内，主要为血肿引起的继发性损伤，血红细胞及受损伤的脑细胞裂解释放细胞毒性物质，进入脑细胞外基质引起的损伤。

在该阶段，小胶质细胞或巨噬细胞通过其膜表面的清道夫受体CD36识别并吞噬渗入脑组织的血红细胞和受损伤的脑细胞，防止这些细胞裂解释放的毒性物质进入细胞外基[3,4]。

目前国内颅内血肿的治疗研究方兴未艾，但是研究内容主要涉及颅内血肿后细胞损伤的分子机制的研究，鲜有研究着眼于颅内血肿的治疗，特别是实施血肿清除术和新型治疗药物相结合的研究。

目前国内对微创血肿清除术的研究已进行的相当深入[5-11]。

经研究表明，微创血肿清除术能有效的清除颅内血肿，同时有效降低血肿引起的继发性脑损伤。

但是，微创血肿清除术的不足之处是其很难清除渗入血肿周围脑组织的血红细胞和脑细胞毒性物质，也不能预防和治疗颅内血肿引起的继发性脑损伤。

过氧化物酶活化增生受体γ (PPARγ)是一种核激素受体，与其配体结合后可通过抑制NF-kappa B(核因子kB) 来减轻炎症反应；还可通过启动核内靶基因的转录来调节糖、脂类代谢以及细胞的抗氧化机能[12]。

尽管国内外学者对PPAR-γ在脑缺血、抗炎症等方面展开了一些研究，但是在其对微创血肿清除术后血肿引起的继发性脑损伤的病理生理意义方面至今未见PubMed收录论文。

噻唑烷二酮是一类口服降糖药，临床用于治疗二型糖尿病[13],其作用机制是激活PPARγ受体，上调某些基因的表达从而增加外周组织对胰岛素的敏感性，因此噻唑烷二酮类药物是十分有效的PPAR γ激动剂[13]。

MMPs是分解细胞外基质的主要酶类，它能降解细胞外基质的几乎所有成分，其在脑血管病中以缺血性疾病研究较多，最近其在脑出血中发挥脑损伤的机制也成为研究的热点。

MMP-9是基质金属蛋白酶的一种，主要由小胶质细胞、星形胶质细胞、单核细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等合成与分泌，它在体内由特殊的蛋白酶切割后即产生活性。

MMP-9表达增高的机制与炎症因子的作用是相辅相成的，一方面血肿的直接压迫作用使周围的脑组织受压导致血流量下降，造成局部组织细胞缺血缺氧，而缺氧作为一种刺激信号作用于内皮细胞、胶质细胞、炎症细胞等，MMP-9基因的启动子存在NF-κB等多种核因子的结合位点，炎症细胞、炎症因子与结合位点结合后启动MMP-9基因的启动子使其表达上调[14]；另一方面MMP-9的高表达使细胞外基质的降解过程显著增加，血管结构的完整性遭到破坏并渗漏和破裂，血脑屏障通透性增高进而造成脑水肿、炎症细胞浸润、细胞因子释放，这些改变都进一步加重脑损伤。

Qureshi 等[2]发现血肿中的血红细胞裂解后释放的大量细胞毒性物质，包括凝血酶、亚铁离子、血红蛋白、氯化血红素、亚铁血红素和转铁蛋白等的释放可刺激小胶质细胞的激活，从而引起小胶质细胞释放MMP-9。

Hamann[15]等报道活化的MMP9通过分解层粘连蛋白、胶原酶，并破坏紧密连接蛋白来促进炎性浸润．改变血脑屏障的通透性形成脑水肿。

也有研究表明脑损伤之后MMPs家族特别是MMP9会上调引起神经血管基质分解，导致神经细胞死亡[16]。

实验发现MMP9加入体外培养的细胞时即能杀死神经元，因此MMP-9也具有直接的神经毒性[17]。

这些都表明了MMP-9参与了脑出血后血肿周围的病理生理改变。

目前对于PPARγ激动剂干预脑小胶质细胞后MMP-9表达的变化的研究尚少，Zhao等[18]通过敲除大鼠的PPARγ基因，然后与正常大鼠对照发现，PPARγ基因缺失后会加重脑水肿及脑损伤，这一研究进一步证实了激活PPARγ可以减轻脑组织的炎性损伤。

Hanefeld[19]等研究发现，体外培养的巨噬细胞PPARγ活化后可抑制促炎因子、MMP、C反应蛋白(CRP)等炎症标志物的表达。

还有研究表明罗格列酮等PPARγ激动剂可降低2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者血清MMP-9、CRP（C反应蛋白)的水平[20]。

Ye等[21]在对2型糖尿病患者的临床研究中观察到，PPARγ激动剂吡格列酮能明显降低患者空腹血糖、糖化血红蛋白、血脂、脂联素、细胞黏附分子及动脉内膜的厚度，其是通过降低MMP-9起到血管保护作用，并且这一作用与降低血糖无关。

综上所述，我们认为PPARγ之所以能够抑制MMP-9表达，原因主要为以下两点：一、在颅内血肿形成的0-4小时内，缺氧导致NF-κB的释放，其与MMP-9的结合启动了MMP-9的表达，而PPARγ通过抑制NF-κB降低炎症反应，使MMP-9表达减少；二、在颅内血肿形成的4小时到7天内，PPARγ吞噬血红细胞裂解的毒性物质，而这些毒性物质的清除可使小胶质细胞的激活数量减少，从而使MMP-9的表达减少。

本实验应用微创血肿清除术与罗格列酮干预脑出血，观察干预后PPARγ、MMP-9、血脑屏障通透性及脑组织水含量的变化，进而探讨噻唑烷二酮(TZD)类药物在脑出血的防治中的作用，为脑出血的防治提供新的思路和方法。

材料与方法1材料1.1动物健康大耳白兔90只，由贵阳医学院实验动物中心提供，体重2.8-3.4 kg，雌雄不分，全部动物均在同一实验室，并由专人按照清洁级家兔要求饲养。

1.2 药品和主要试剂1.2.1 Western blot所需试剂预染蛋白marker （加拿大渥太华Fermentas公司）；甲醇（天津永大化学试剂有限公司）；X-光片（上海柯达公司）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；十二烷基磺酸钠（SDS）、溴酚蓝、TEMED （美国加州Sigma公司）；吐温20（Tween 20）、牛血清白蛋白（BSA）（美国加州Sigma公司）；4³蛋白上样缓冲液、甘氨酸（Gly）（北京索莱宝科技有限公司）；β-巯基乙醇（2-ME）（贵阳赛维斯生物技术公司）；三氯乙酸、磺基水杨酸（天津市巴斯夫化工有限公司）；丙烯酰胺、N,N’-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）（美国宾夕法尼亚州VWR 公司）；显影液、定影液（美国马萨诸塞州Perkin Elmer股份有限公司）；PVDF膜（美国麻省Millipore公司）；兔PPARγ多克隆抗体、兔β-actin 多克隆抗体购于武汉博士德公司，兔MMP-9单克隆抗体购于英国剑桥Abcam公司。

相关试剂的配制：⑴ 30%丙烯酰胺贮液丙烯酰胺 29.0g 、N，N’甲叉双丙烯酰胺 1.0g，加蒸馏水定容至100mL，滤纸过滤，用棕色瓶于4℃保存。

⑵ 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）将Tris 18.16g溶解于800ml的蒸馏水中，充分溶解后用浓HCL将pH调至8.8，加蒸馏水定容至1000mL，4℃保存备用。

⑶ 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）Tris 6.06g，4M HCL调pH至6.8，加蒸馏水定容至100mL，4℃保存备用。

⑷ 4M HCl36％盐酸40.5mL，加蒸馏水定容至100mL。

⑸ 10％APS过硫酸铵100mg，溶解于1mL蒸馏水，使用前新鲜配制。

⑹ 10% SDSSDS 10g，用蒸馏水缓慢溶解，定容至100mL，常温保存。

⑺ 5³电泳缓冲液（pH 8.3）Tris 15.15g、 SDS 5g、甘氨酸72.05g ，蒸馏水定容至1000mL，用时稀释5倍。

⑻ 5³转移缓冲液Tris 15.15g、甘氨酸72.05g，蒸馏水定容至800mL，用时取160mL并用蒸馏水稀释至800mL，再加200mL甲醇。