转PSAG12-ipt基因结缕草的获得及其衰老特性分析

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物质代谢与植物衰老

物质代谢与植物衰老发布时间:2010年7月27日阅读次数:12（李吉琴）在基因的控制下，植物在衰老时发生许多变化，主要是可溶性蛋白、酶、核酸、脂类、叶绿素和激素等物质的代谢。

对它们进行研究有利于揭示植物衰老的机理1可溶性蛋白、酶、核酸、脂类植物衰老时既有新蛋白质的合成，也有原蛋白质的增加和降低，但蛋白质总体水平呈下降趋势。

关于蛋白质的合成，已通过蛋白质合成抑制剂延缓衰老的实验得到证明。

宋松泉等(1995)在研究水稻叶片衰老与蛋白质水解酶的关系时发现：蛋白质的降解比叶绿素、RNA降解的早，并认为蛋白质的降解是叶片衰老的基本特征。

蛋白质降解的主要原因是蛋白酶基因的表达及许多已存在蛋白酶的激活。

目前已从拟南芥、玉米、油菜中分离克隆到多种蛋白酶降解基因LSC760、SEE1、SAG12等抗氧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是衰老中清除活性氧的关键酶，在衰老中表现为：量的减少和活性的降低，代谢产物丙二醛（MDA）的量增加。

因此生物正常代谢的活性氧得不到及时清除，氧自由基增加，大量的自由基和丙二醛攻击蛋白质、核酸、脂类、叶绿素，引起进一步的过氧化，加剧衰老的进程。

植物衰老期间DNA的水平相对稳定，而RNA的水平显著下降，其中又以18SrRNA下降为甚。

18SrRNA的降解直接引起核糖体小亚基的分解，使核糖体解体，蛋白质合成能力下降。

提取绿叶和黄化叶的mRNA，进行体外翻译发现：衰老中有新RNA的合成，也有原有RNA的增加（Thomas et al，1992）。

这是因为植物衰老时，大量蛋白质的合成，必须有相应核酸的转录。

核酸降解的最终产物磷，成为植物非衰老部分的磷源。

植物衰老中总脂类水平下降，并且这种脂类水平的下降与呼吸作用有关（Koiwai，1981；Wanner et al，1991）。

脂类和呼吸的关系相继被三个试验证明：C14标记的半乳糖脂饲喂大麦幼叶，当叶片衰老时发现有大量CO2的释放；衰老叶片的呼吸商低，不可能以蔗糖为基质；呼吸作用参加与脂类降解乙醛酸循环的两类酶MS、ICL，在衰老叶片中的含量要比正常情况下高的多(Wanner et al,1991;Gut et al,1988)。

农杆菌介导PSAGl2-IPT基因转化辣椒的研究

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ＭｅｄｉａｔｅｄＧｅｎｅｔｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ
ＨｏｔＰｅｐｐｅｒｗｉｔｈＰＳＡＧ１２－ＩＰＴ
ｆｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆｐｌａｎｔｓ．Ａｈｉｇｈｌｙｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ — ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＰＳＡＧ１２）ｒｆｏｍａｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｇｅｎｅＳＡＧ１２ｅｎｃｏｄｉｎｇａ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃｙｔｏｋｉｎｉｎ．Ｏｖｅｒ— ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＩｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｌｅａｄｓｔｏｈｉｇｈｅｒｆｏｌｉａｒｃｙｔｏｋｉｎｉｎ
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ＬＩＱｉｕｑｉｎｇＣＨＥＮＧｕｏｊｕＣＡＯＢｉｈａｏＣＨＥＮＣｈａｎｇｍｉｎｇＬＥＩＪｉａｎｊｕｎ

PSAG12-ipt基因转化植株研究进展

PSAG12-ipt基因转化植株研究进展张根良1,2 王文泉2(1华南热带农业大学农学院, 儋州571737;2中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口571101)摘要: 叶片衰老是一种程序性死亡过程; ipt ( isopentenyl transferas ) 基因转化植株, 可以催化调控内源细胞分裂素合成, 延缓转化株叶片衰老。

SAG12 基因启动子能够控制ipt 基因在植株下部衰老叶片中表达。

介绍了ipt 基因和SAG12 基因启动子的来源和应用, 以及PSAG12-ipt基因的产生和转化植株在国内的研究概况。

关键词: SAG12 ipt 细胞分裂素叶片衰老叶片衰老是一种典型的细胞程序性死亡, 它表现在叶绿素、脂类、蛋白质和RNA 的减少, 有助于提高植物的适应性; 它可以作为作物选择的一个重要指标来增加作物的遗传改良潜力。

目前, 对于叶片衰老的机制已经在生理生化、分子水平得到一定的阐明, 获得了一些与衰老有关的基因。

并且发现在衰老进程中, 植物激素, 包括生长素、赤霉素、乙烯、脱落酸和细胞分裂素起着非常重要的作用。

其中, 细胞分裂素作为植物衰老过程中的一个关键因子得到了广泛的关注。

已有研究通过转化ipt 基因增加植物内源的细胞分裂素, 可以延缓植物叶片的衰老, 增强植物对非生物逆境的抗性。

ipt 基因来源于土壤农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 的Ti 质粒, 编码一种异戊烯基转移酶, 催化和调控细胞分裂素的合成。

Medford( 1989) 等[1]利用ipt 基因转化烟草和拟南芥, 用来源于玉米的hsp70 作为热诱导启动子,调控ipt 基因的表达, 受热激诱导后的转基因植物表现出叶片衰老的延迟, 细胞分裂素显著增加, 但没有诱导的转基因植物在细胞分裂素增加后, 出现了许多影响生长和发育的有害症状, 如侧芽的脱落, 茎杆和叶面积的减少, 根生长的停止等。

高世代转PSAG12-IPT基因水稻生育后期的延衰性

ＺＨＥＮＧＸｉｎ —ｈｎａｇｚｅｇ，ＣＨＥｕｘｎ，ＺＮＧｉ—ｕＮＺ —ｉＨＥＪｎｇｉ’
（．ｅａｏａｒｆｒｐＧｎｔｒｅｉｇａｄＣｍｐｈｎｉｔｚｔｎＭｉｉｒｆｄｃｔｎ２Ａｒｕｔｒ１ＫｙＬｂｒｔｏｏｅｅｉＢｅｄｎｏｒｅｓｅＵｉａｏ，ｎｓｏｕａｏ；．ｇｉｌａｏｙＣｃｎｅｖｉｌｉｔｙＥｉｃｕｌ
高世代转ＰＡ１一基因水稻生育后期的延衰性ｓＧ２
许明，黄昕郑华坤苏永昌，，，郑祥正程祖锌，，郑金贵
（．建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室；１福２福建农林大学农产品品质研究所，建福州３００）．福５０２
福建农林大学学报（自然科学版）
第３９卷第１期２１００年１月
ＪｕｎｌｆｕｉｇｃｌｒａｄＦｒｓｙＵｉｒｔＮｔｒｌｃｅｃｄｉ）ｏｒａｏｊｎＡｒｕｔｅｎｏｅｔｎｖｓｙ（ａａＳｉｎｅＥｉｏＦａｉｕｒｅｉｕｔｎ
ｈＯｃｖｃａｇｄｉｅｕａｌｄｒｇｄｕｓｇ．ｓｎｉｅｔｔｉｅｅｃｎｅｉｅｃｇｎ＾ＩＴｅＰＤａｔｔｈｎｅｒｇｌｒｕｎｏｇａｅＴｉｉｄｃｔａａｔｓｎｓｅｃｈｍｒｅｅｓｃｉｙｉｒｙｉｈｔｈａｄｈ — ｎｃｉＰ２
ＰｏｕｔｕｌｓｔｅｕｉｇｃｔｅａｄＦｒｓｙＵｉｒｉ，ｕｈｕＦｊ５０２ｈｎ）ｒｃＱａｔＩｔｕ，ＦｊｎＡｒｕｕｎｏｅｔｎｅｓｙＦｚｏ，ｕｉ３００，Ｃｉａｄｉｎｉｔｙａｉｌｒｒｖｔｎａ

花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展

花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展果树的基因转化研究早在1988年，首先在核桃上取得突破，McGranahan等获得了转gus基因核桃再生植株。

此后，果树转基因工程研究日益发展，许多果树获得了转基因植株，但是与农作物的转基因工程研究相比，果树转基因工程还是远远处于落后状态。

最难转化的禾谷类，现在也已经有多种作物进入转基因的商业化生产阶段，而果树仅有一例转基因植物进入田间试验（方宏筠等，1999）。

我国在樱桃、草莓、苹果等果树转基因方面做了许多研究工作，并都获得了转化目的基因的转基因植株，特别是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间实验，该项研究处于国际领先水平。

1988年第一株转基因核桃(Juglans regia L.)在美国诞生为利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种奠定了实践基础。

相对于农作物而言，果树转基因技术及研发相对滞后转化体系仍有待进一步完善，但果树基因工程也有其突出的优势。

目前，我国已在荔枝、番木瓜、苹果、柑橘、梨、桃、香蕉、猕猴桃、葡萄、樱桃、草莓的果树上展开了遗传转化技术的研究，转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪轰击的方式，获得了部分转基因植株。

在果树等林木育种中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅见钟启宏等采用花粉管通道导入方法，将欧洲黑杨的一个克隆片段导入泡桐，最终获得了3株可含50μg/mL的Kan培养基上生长的幼苗。

侯立群（2000）等利用花粉管通道发进行核桃转基因研究，只是获得了畸形果植株，但尚未完成分子鉴定等。

山东农业大学张玲（2004）利用花粉管通道法对杏转化抗寒基因相关研究。

由于果树，栽培环境复杂、生产周期长，且主要为风媒传粉植物，与作物相比，在影响树种自身遗传多样性等方面，其潜在的生态风险性可能更大。

随着果树转基因成功事例逐年增加，转基因果树的生态安全性问题也越发受到重视。

由于花粉管通道法进行转化的供体可以是植物总DNA，即利用自然界现有的具目的性状的外源DNA或基因进行遗传转化，其实质相当于远缘杂交。

植物叶片衰老

植物叶片衰老摘要：叶片衰老是植物发育后期的一个重要特征。

在生产上当植物叶片衰老或是异常时，光合作用减退，将极大程度地限制植物产量潜力的发挥，农业生产中造成许多作物减产。

本文结合植物叶片衰老发育的过程，从叶片衰老过程中各个组织水平细胞结构变化、细胞生理生化变化、植物激素以及基因调控等方面对叶片衰老的机理进行综述，并提出今后研究的方向。

关键词：植物叶片衰老，机制，调控，环境因素1.叶片衰老过程叶片衰老最显著的形态变化就是叶片颜色的变化，在衰老过程中，生理生化指标的变化是其衰老过程的反应，可用来判断衰老的过程及其程度，而衰老的机理是导致这些生理生化指标变化的基础（张宝来，2013）。

研究表明，根据植物叶片生理生化变化的早迟、强弱、方向和幅度，一般将衰老过程划分为三个阶段：诱导期、抵抗期和加剧期。

三个衰老阶段表现出不同的生理生化变化特征。

一阶段的变化较大，第二阶段为趋于平稳的变化，第三阶段变化剧烈。

即第三、第一、第二阶段的生理生化变化速率依次降低。

在衰老诱导阶段，叶片受到衰老信息的刺激，存在于体内的衰老机制得到激发，生理生化变化表现为幅度较大的应激反应，呈现出通过生理生化变化来去除衰老信息作用的趋向。

在衰老抵抗阶段，是叶片内衰老机制和防衰老机制相互激烈作用的时期，因而表现出生理生化变化速率较小的特点。

但是，衰老机制逐渐处于主导地位，使生理生化变化逐渐向衰老的方向发展，真正意义的衰老是从这一阶段开始的。

在剧烈衰老阶段，体内的防衰老机制已失去作用或不复存在，因而生理生化变化表现为变幅很大的衰老特征，最终导致死亡（Eng-Chong Pua Michael R.Davey,2010）2．叶片衰老的细胞结构和生理功能的的变化研究表明，植物叶片在衰老过程中表现为下述典型特征：叶绿素的降解明显快于合成，蛋白质迅速丧失，RNA大量水解，叶片在形态上表现为黄化现象。

2.1细胞结构的变化叶细胞在衰老阶段显示出一些独特的结构和生化变化。

植物叶片衰老资料

植物叶片衰老摘要：叶片衰老是植物发育后期的一个重要特征。

在生产上当植物叶片衰老或是异常时，光合作用减退，将极大程度地限制植物产量潜力的发挥，农业生产中造成许多作物减产。

研究表明，根据植物叶片生理生化变化的早迟、强弱、方向和幅度，一般将衰老过程划分为三个阶段：诱导期、抵抗期和加剧期。

三个衰老阶段表现出不同的生理生化变化特征。

一阶段的变化较大，第二阶段为趋于平稳的变化，第三阶段变化剧烈。

即第三、第一、第二阶段的生理生化变化速率依次降低。

在衰老抵抗阶段，是叶片内衰老机制和防衰老机制相互激烈作用的时期，因而表现出生理生化变化速率较小的特点。

但是，衰老机制逐渐处于主导地位，使生理生化变化逐渐向衰老的方向发展，真正意义的衰老是从这一阶段开始的。

2.1细胞结构的变化叶细胞在衰老阶段显示出一些独特的结构和生化变化。

植物叶片衰老机理与调控研究进展

植物叶片衰老机理与调控研究进展王建勇;姚晓华;张志斌【摘要】综述了有关于植物叶片衰老机理与调控等的研究进展.%The research progress on mechanism and regulation of plant leaf senescence were summarized.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)031【总页数】4页(P19036-19038,19058)【关键词】叶片衰老;衰老机理;衰老相关基因;衰老调控【作者】王建勇;姚晓华;张志斌【作者单位】山东省沂水县沙沟镇林业站,山东临沂276414;青海省农林科学院青稞遗传育种重点实验室,青海省高原作物种质资源创新与利用重点实验室,青海西宁810016;青海省农林科学院青稞遗传育种重点实验室,青海省高原作物种质资源创新与利用重点实验室,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S132衰老是生物界普遍存在的重要生理现象，通常指生物的器官或整个个体生理功能逐渐衰退并最终死亡的过程。

叶片是植物利用光能合成有机化合物的重要场所，也是植物衰老最敏感的器官之一。

叶片衰老是一个极其复杂的生理生化过程，叶片衰老的主要特征为叶绿素和蛋白质、膜脂和RNA等大分子分解以及营养物质再利用等;分子水平上表现为大量衰老相关基因的活跃表达［1－2］。

目前，人们越来越重视植物衰老现象及其本质的研究。

近年来，我国在该领域的研究取得了较大进展，如在整体水平揭示大田作物的衰老机理及其在农作物高产育种和栽培中的应用，果蔬衰老机理与保鲜技术等方面已取得新突破，并获得了一些耐储藏的转基因番茄植株和延缓早衰的转基因水稻植株等，但目前国内外植物衰老的研究基本上以拟南芥等模式植物以及水稻、小麦等经济作物为对象［3－5］，而对林木衰老的研究较少。

1 叶片衰老的机理多年来人们对叶片衰老的机制开展了大量研究，以期从理论上揭示叶片衰老的生理生化机制，为此提出了营养胁迫说、自由基损伤说、激素平衡说、DNA损伤说和程序性细胞死亡理论等。

结缕草种子愈伤组织诱导及植株再生研究

培养基中蔗糖含量均为３，８ｇＬ琼脂固化，％以／并调节ｐ．。愈伤组织诱导及继代为暗培养，Ｈ５８分化培养光照强度为１６０ｌ，照时间为１／，养温度均０ｘ光２ｈｄ培
为２℃。５
１２２材料的前处理与消毒．．
物保护方面研究工作。Ｅｉ：ａｐｓｄ．ｄ．ｎｍａｌｃｉ＠ｕａｅｕｃ。
基金项目：苏州市科技支撑（业）农资助项目（Ｎ９９。Ｓ０）收稿日期：００３９２１ —０～０
ｌ３５
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生物技术・
北方园艺２ｏ３１～４ｏ（）３１ｌＩ：５ｏ
２１Ｄ度／ｇＩ，＿浓ｍ．
糖时，出愈率最高，到１０，性愈伤的发生率也达到最高，８．；含０１ｇＩ２４Ｄ达０胚为４４用．／，－的ａｒ
１２／ＭＳ分化培养基，１次继代的浅黄色稍致密愈伤组织分化率最高，经达到８．。１７
间的影响，大大提高繁殖系数和工作效率，速获得可迅
大量无病毒优质苗，在种质资源保存和加速良种化进程等方面具有重要的意义Ｌ。目前，４］已有少量关于结缕草组织培养和植株再生ｌ］＿的研究，７如结缕草种子ｌ、＿匍６］
坡或海滨草地上口。结缕草属植物具有抗高温、］耐践踏、抗病虫和耐盐碱、护成本低等特性，养在适宜的土壤和气候条件下能够形成致密、整齐的优质草坪，广泛被

结缕草叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的构建

第 32 卷第 7 期Vol.32，No.761-712023 年 7 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA管瑾，郭一荻，刘凌云，等. 结缕草叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的构建. 草业学报， 2023， 32（7）： 61−71.GUAN Jin，GUO Yi-di，LIU Ling-yun，et al. An efficient protocol for Zoysia japonica mesophyll protoplast isolation and transformation，and its application in subcellular localization and protein interaction analysis. Acta Prataculturae Sinica， 2023， 32（7）： 61−71.结缕草叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的构建管瑾1，郭一荻1，刘凌云1，尹淑霞1*，滕珂2*（1.北京林业大学草业与草原学院，北京 100083；2.北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所，北京 100097）摘要：为了结合转基因方法探索结缕草基因功能，建立高效、快速的结缕草原生质体制备及瞬时基因表达系统，利用正交试验对影响原生质体制备的主要因素进行优化，同时利用原生质体进行亚细胞定位和蛋白互作研究。

结果表明，当酶配比为2% （w/v） cellulase R10和1.5% （w/v） macerozyme R10，酶解时间为7 h时，原生质体产量和活性均达到最高，分别为1.23×107个·mL-1和98%以上，满足后续转化所需。

多次重复试验表明，加入5~10 μg质粒，原生质体转化率可达75%以上。

利用原生质体转化体系进行了亚细胞定位检测，结果发现结缕草ZjNOL和ZjNYC1定位在叶绿体中，ZjZFN定位在细胞核中。

二穗短柄草SPL家族基因的鉴定、系统发育和表达分析

麦类作物学报 2023,43(11):1372-1383J o u r n a l ofT r i t i c e a eC r o p s d o i :10.7606/j.i s s n .1009-1041.2023.11.02网络出版时间:2023-09-19网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1359.S .20230918.1251.006二穗短柄草S P L 家族基因的鉴定、系统发育和表达分析收稿日期:2022-12-07 修回日期:2023-03-17第一作者E -m a i l :s h u t i n g w a n g@n w a f u .e d u .c n 通讯作者:马翎健(E -m a i l :m a l i n g ji a n @n w a f u .e d u .c n )王淑婷1,朱婷1,马浩森1,李小鹏2,牛娜1,马翎健1(1.西北农林科技大学农学院,陕西杨凌712100;2.渭南市农资农产品质量检测中心,陕西渭南714000)摘要:植物特异性S P L 家族基因编码S B P (s q u a m o s a p r o m o t e r -b i n d i n gpr o t e i n -l i k e )保守结构,参与调节植物的生长和发育㊂为了解二穗短柄草中S P L 家族基因的分布㊁结构及功能,对二穗短柄草全基因组中S P L 家族成员进行了系统分析㊂结果表明,在二穗短柄草全基因组中鉴定出17个B d S P L 基因,在5条染色体上呈不均匀分布,b d 03号染色体上分布最多;根据系统发育树,17个B d S P L 被分为6个组,同组成员有保守的结构和基序;其中6对B d S P L 基因发生基因复制事件;在B d S P L 基因启动子区域发现了各种顺式元件,如A B R E ㊁C G T A C -m o t i f 和L T R ㊂转录组数据和q R T -P C R 分析显示,B d S P L 基因在二穗短柄草花中表达量较高,而在根系中表达量较低,在不同植物激素处理下表达量有差异㊂关键词:二穗短柄草;S P L 基因家族;系统进化;表达分析中图分类号:S 519;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2023)11-1372-12I d e n t i f i c a t i o n ,P h y l o g e n y a n dE x p r e s s i o nA n a l ys i s o f t h e S P LG e n e F a m i l y i n B .d i s t a c h yo n .W A N GS h u t i n g 1,Z H UT i n g 1,M A H a o s e n 1,L IX i a o p e n g 2,N I UN a 1,M AL i n g ji a n 1(1.C o l l e g e o fA g r o n o m y ,N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y ,Y a n g l i n g ,S h a a n x i 712100,C h i n a ;2.W e i n a nA gr i c u l t u r a l P r o d u c t s Q u a l i t y T e s t i n g Ce n t e r ,W e i n a n ,S h a a n x i 714000,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p l a n t -s p e c if i cS P Lf a m i l y (s q u a m o s a p r o m o t e r -b i n d i n gpr o t e i n -l i k e )g e n ee n c o d e st h e S B Pc o n s e r v e dd o m a i n t h a t i s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o no f p l a n t g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t .T ou n d e r -s t a n d t h e d i s t r i b u t i o n ,s t r u c t u r e a n d f u n c t i o no f S P L g e n e s i n B r a c h y p o d i u md i s t a c h yo n ,t h e S P L g e n e f a m i l y w a s a n a l y z e d s y s t e m a t i c a l l y i n t h e w h o l e g e n o m e i n t h i s s t u d y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 17B d -S P L g e n e sw e r e i d e n t i f i e d i n t h ew h o l e g e n o m e o f B r a c h y p o d i u m d i s t a c h y o n .A c c o r d i n g t o t h e p h y l o ge -n e t i c t r e e ,t h e 17B d S P L g e n e sw e r e d i v i d e d i n t o s i x g r o u p s ,a n dm e m b e r s of t h e s a m e f a m i l y sh a r e d t h e c o n s e r v e d g e n es t r u c t u r e sa n d m o t i f s .G e n ed u pl i c a t i o ne v e n t so c c u r r e di n6p a i r so f B d S P L g e n e s .P r o m o t e r a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e v a r i o u s c i s -e l e m e n t s ,s u c ha sA B R E ,C G T A C -m o -t i f ,a n dL T R.T r a n s c r i p t o m ea n d q R T -P C Ra n a l y s i s r e v e a l e dt h a t t h ee x pr e s s i o n l e v e l o f S P L g e n e w a s h i g h e r i n f l o w e r s ,b u t l o w e r i n r o o t s ,a n dd i f f e r e n t e x pr e s s i o n p a t t e r n sw e r e o b s e r v e du n d e r d i f -f e r e n t p l a n t h o r m o n e t r e a t m e n t s .K e y w o r d s :B r a c h y p o d i u md i s t a c h y o n ;S P L g e n e f a m i l y ;P h y l o g e n y ;E x p r e s s i o n p a t t e r n s 基因家族由结构和功能相似的多个基因组成,在特定的生物体中扮演着重要的角色㊂目前,在真核生物中已经发现了各种基因家族,如b H L H [1]㊁T C P [2]和P r x [3]等㊂S P L 家族基因(A m S B P 1和A m S B P 2)在金鱼草的花分生组织中首次被发现,后在多种植物中被鉴定出㊂S P L 蛋白均含有一个高度保守结构域(也称为S B P结构域),由两个独立的锌指结构组成,其中包含Z n-1 (C y s3H i s或C y s4)和Z n-2(C y s2H i s C y s)[6-7];每个锌指位点由4个氨基酸残基结合一个锌离子,在维持蛋白质构象稳定方面发挥重要作用[8]㊂在S B P结构域的C末端,有一个保守的核定位信号重叠在第二个锌指结构上,将S B P蛋白引导到细胞核中,调节下游基因的转录[9]㊂目前,S P L家族基因已经在拟南芥[10-11]㊁水稻[7]㊁大豆[12]㊁矮牵牛[13]㊁棉花[14]㊁烟草[15]㊁泡桐[16]㊁藜麦[17]和水曲柳[18]中得到研究㊂但还没有关于二穗短柄草S P L家族基因的报道㊂研究表明,S P L家族基因由m i R156/157调控,在植物生长和生理的各个方面发挥着作用[11,19-20];在拟南芥17个S P L s中,有11个含有m i R156/157识别位点[23-24]㊂S c h w a b等[25]发现,拟南芥中过表达m i R156使多个S P L s的表达下调,这些S P L s都含有m i R156/157识别位点,而其他没有该识别位点的S P L s不受影响;突变5个A t S P L3的m i R156/157识别位点碱基后,A t-S P L3的转录水平显著提高㊂在番茄中,大部分S P L基因在茎尖㊁花序和果实中高表达,而m i R156/157在这三个组织中的表达较低,表明m i R156/157与S P L s的表达水平呈负相关㊂S P L 基因参与植物的信号转导,如A t S P L8可抑制促进种子萌发和根生长的下游基因的表达[27]; V v S B P3和V v S B P5参与葡萄的低温反应[28]㊂二穗短柄草基因组较小,与粮食作物如小麦㊁大麦和水稻关系密切[29]㊂目前,关于拟南芥和水稻S P L 家族基因的功能研究较多,但其在二穗短柄草中的信息还不清楚㊂本研究拟对二穗短柄草中的S P L家族基因进行鉴定,分析其基因结构㊁基序㊁顺式元件㊁系统发育㊁基因复制㊁G O注释和表达模式等,并对其功能进行预测,为粮食作物功能基因的发现与利用提供参考㊂1材料和方法1.1二穗短柄草中S P L基因的鉴定从E n s e m b l p l a n t数据库(h t t p://p l a n t s.e n-s e m b l.o r g/)下载二穗短柄草的全基因组数据,包括基因组序列文件和蛋白序列文件㊂从P F AM 数据库(h t t p://p f a m.x f a m.o r g/)下载S B P结构域(P F03110);使用HMM E R3.0程序将S B P 结构域作为查询序列,在二穗短柄草中寻找包含S B P结构域的蛋白质;以水稻和拟南芥的S B P蛋白序列为查询序列,利用B L A S T P程序对二穗短柄草蛋白序列进行检索㊂分析HMM和B L A S T P 的结果,鉴定出B d S P L蛋白㊂利用N C B I-C D D网络服务器(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c-t u r e/b w r p s b/b w r p s b.c g i)和P F AM数据库对候选的B d S P L蛋白进行鉴定㊂共得到17个B d S P L 蛋白,其相应基因依次命名为B d S P L1~B d-S P L17㊂从E x P A S Y服务器(h t t p s://w e b.e x-p a s y.o r g/c o m p u t e_p i/)[30]获得B d S P L蛋白质的理论等电点(P I)和相对分子质量(MW),并使用C e l l o W e b服务器(h t t p://c e l l o.l i f e.n c t u.e d u. t w/)预测这些蛋白质的细胞定位㊂1.2B d S P L蛋白的系统发育分析使用C l u a s t X2.0软件[31]对二穗短柄草㊁水稻和拟南芥的S P L蛋白氨基酸序列进行比对,利用M E G A8.0软件的邻接法(N e i g h b o r-J o i n i n g)构建系统发育树,b o o t s t r a p参数设置为1000[32]㊂1.3B d S P L基因的结构及保守基序分析利用G e n e S t r u c t u r e D i s p l a y S e r v e r(h t-t p://g s d s.g a o-l a b.o r g/)对其基因结构和编码序列(C D S)进行分析[33]㊂利用M E M Ev4.9.0(h t-t p://m e m e-s u i t e.o r g/t o o l s/m e m e)分析B d-S P L蛋白的保守基序,基序最佳氨基酸数10~ 250,最大基序数量设置为15个[34]㊂1.4二穗短柄草㊁水稻㊁小麦和玉米的S P L s共线性分析利用M C S c a n X[35]软件检测二穗短柄草与水稻㊁玉米㊁小麦之间的S P L区域㊂使用C i r c o s0.67比较B d S P L与上述物种之间的共线性关系[36]㊂比较共线基因对的C D S和蛋白质序列,使用K A K S_C a l c u l a t o r软件计算K A K S比率[37]㊂用W a n g[3]的方法计算共线基因对的发散时间(T)㊂1.5S P L的G O注释及其与其他蛋白质相互作用分析二穗短柄草中S P L蛋白的G O注释来自P L A Z A数据库(h t t p s://b i o i n f o r m a t i c s.p s b. u g e n t.b e/p l a z a/v e r s i o n s/p l a z a_v5_d i c o t s/)[38]和P l a n t T r a n s c r i p t i o n a l R e g u l a t o r y M a p数据库(h t t p://p l a n t r e g m a p.g a o-l a b.o r g/)㊂使用A r e-n a n N e tV2[39]和C y t o s c a p e软件[40]构建B d S P L 与其他二穗短柄草蛋白之间的相互作用网络㊂1.6B d S P L s的启动子分析从E n s e m b l p l a n t数据库下载B d S P L基因上㊃3731㊃第11期王淑婷等:二穗短柄草S P L家族基因的鉴定㊁系统发育和表达分析游1.5k b的D N A序列,提交到P L A C E数据库(h t-t p://b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t-c a r e/h t m l/),预测启动子区域的顺式调控元件[41]㊂1.7B d S P L s的基因表达分析从S R A数据库(h t t p s://w w w.n c b i.n l m. n i h.g o v/s r a)中获得17个B d S P L基因在九种组织[42]和不同植物激素处理下[43]的数据,分析其表达模式㊂将二穗短柄草B d21的种子铺在有滤纸的培养皿中,使水轻微没过种子,发芽3~5d㊂将泥炭土㊁蛭石㊁营养土按照1ʒ1ʒ1的比例充分混匀,装到培养盆(10c mˑ10c mˑ8.5c m)中㊂挑选长势一致且健壮的二穗短柄草幼苗移栽至培养盆中,每个培养盆3株,于16/8h昼夜光周期㊁23ħ㊁相对湿度55%~60%的温室培养;3~5d浇水并施肥一次,在抽穗期采集根㊁叶㊁茎和花序进行S P L基因表达分析㊂同上述方法将二穗短柄草在铺有滤纸的培养皿培养至3周龄,分别用200mm o l㊃L-1N a C l㊁100μm o l㊃L-1G A㊁100μm o l㊃L-1A B A和20%P E G600处理液没过幼苗根部,并用相应处理液喷湿茎和叶;同时设低温(-4ħ)处理[44],均保持2h后用流水冲洗幼苗;将所有样品用液氮速冻,于-80ħ保存备用㊂使用艾科瑞公司的R N A提取试剂盒(A G21019)提取上述材料的总R N A;使用E v o M-M L V R T-P C R试剂盒(A c c u r a t eB i o l o g y,中国湖南)合成c D N A,使用P r i m e r P r e m i e r5.0软件设计17个B d S P L基因的q R T-P C R特异性引物(表1)㊂使用艾科瑞公司的P r oT a q H S预混型q P C R试剂盒(含R O X)(A G11718)参照说明书用Q u a n t S t u d i o T M R e a lT i m eP C R仪进行实时定量P C R㊂B d U B C18为参考基因,相对表达量通过2-ΔΔC T方法计算㊂2结果2.1二穗短柄草S P L家族基因的鉴定和染色体定位所得17个编码S B P蛋白的基因(表2)㊂在二穗短柄草的5条染色体上分布不均,其中6个分布在第3染色体上,占35%,第1㊁2㊁4染色体上均有3个,有2个位于第5染色体上㊂表1q R T-P C R所用引物T a b l e1P r i m e r s u s e d f o r t h e q R T-P C R基因名称G e n en a m e正向引物F o r w a r d p r i m e r(5'-3')反向引物R e v e r s e p r i m e r(5'-3')B d S P L001C T G T C A C T G A A T A G T T C G C C G T C T T T G A G C A C C C T G C C A T T G T T A T C CB d S P L002G G A A G G AC A A G T C C C G G A A G T A G G T T C G G C T T C T G G T C C T C A TB d S P L003C A T C A T C A G G A G C A G C A C T T C A T C T A C A T G A A G T C C A C C T C G A A C A G AB d S P L004A G T G G G A T T T G A AC G A C T G G A G A T A C T G G T G A A A C T C T C C T C C T C T T G TB d S P L005G A T G T GC T A A G T G C T C C A A C C T G T A C T T G A A T G A A A T G C G T C C T G T G GB d S P L006TC T T C G C T A A T C A C C A C G G A G G A G T A G T A C T G C T C G A C C T G G A A C G C GB d S P L007T TC T A T T C A G T G A G G C T C C G T A T G T A C C G T G T G G C A T A A T A C T G T T C GB d S P L008A T T AC C T G A T C C T G C A C A G C A A G C A G A C C G A A G A A T G T G G T G T C A T A G C CB d S P L009C C A C A A G G T C T G C G A G T A C C A C G G C T C C T C T T G G C C T C G T C A A A C TB d S P L010G T TC C A C C A G T T G C C T G A A T T T G A C T C G G A A C A C G T G G G T A T G A G A A A TB d S P L011C C A C A G A T G T T G C T T C A C A G T T G C A A T G A C T T C C G A T G G A G G A G A C T T TB d S P L012GC A G G A A G C C A C A G C C A G A T T C A C C C C T G T G G C G A A G T T T A T TB d S P L013TC T C C A T C T C A T T C T C G G G A A C C A C C T G C T G G T G T T G T T G C C A T C T T C AB d S P L014C A A G G G T T C C A A G C A G C G T G A G T G C T G C G G T G A G G A T G A T G G AB d S P L015T G T TC C A A G G C C A G A G C C A A G T C C T G T G C T G A A A C T C A T T T G G T C T CB d S P L016C A T G G G A T C T C G G G A T G C A G T A G C T T G A G G C T C G T G A G C T C C TB d S P L017C A A C A A C C C A A G C C C C A A T A A C C T C G G G T A G A A C T G G A G G A T G T C G T GB d U B C18G G A G GC A C C T C A G G T C A T T T C G G C A G T T C C T A A C A T A G C G㊃4731㊃麦类作物学报第43卷亚细胞定位预测发现,所有的二穗短柄草S P L 蛋白定位在细胞核中㊂17个成员的氨基酸长度为192~1126a a ,其中最长的是B d S P L 011,最短的是B d S P L 002㊂相对分子量20.05~122.96k D a ,等电点5.44~9.92㊂2.2 B d S P L s 的序列比对及系统发育分析在17个B d S P L 蛋白中,均有约76个氨基酸组成的S B P 结构域(图1),其C 末端有两个锌指结构,为C y s -H i s 或C y s -C y s -H i s -C y s ,以及一个N S L 位点㊂图1 B d S P L 蛋白的S B P 结构域F i g.1 S B Pd o m a i n i nB d S P L p r o t e i n s 用M E G A 6.0构建二穗短柄草S P L 蛋白与拟南芥㊁水稻S P L 蛋白的系统进化树(图2)㊂根据遗传变异度将这52个S P L 划分成7组;其中D 组和F 组的S P L 最多㊂二穗短柄草的17个S P L 均匀分布在除E 组外的其他6个组里㊂进化树中进化枝相近S P L 可能来自同源基因,例如,A组中的B d S P L 012和O s S P L 016可能是同源基因㊂同一组中,二穗短柄草与水稻的S P L 遗传变异度更小,说明二者关系更近㊂2.3 B d S P L 的基因结构和保守基序分析基因结构分析结果(图3)表明,17个B d S P L基因的外显子数为2~11,58%的B d S P L 基因含有3个外显子,图2中同组B d S P L 基因结构相似㊂17个B d S P L 基序分析(图3)表明,两个基序(m o t i f 1,m o t i f 2)包含在所有B d S P L 蛋白中,推测m o t i f 1和m o t i f 2是S B P 结构域的重要构成部分㊂图2中F 组的B d S P L 蛋白具有最多的基序数,蛋白质最长;不同组有其特定的基序,例如,图2 二穗短柄草㊁拟南芥和水稻S P L 系统发育树F i g .2 P h y l o g e n e t i c t r e e o f S P Lf r o m B .d i s t a c h yo n ,A .t h a l i a n a a n d r i c e ㊃5731㊃第11期王淑婷等:二穗短柄草S P L 家族基因的鉴定㊁系统发育和表达分析表2 二穗短柄草S P L 基因家族的特征T a b l e 2 C h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e s o f S P L g e n e f a m i l yi n B .d i s t a c h y o n 蛋白I D P r o t e i n I D 基因I DG e n e I D基因名称G e n en a m e 亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n 长度L e n g t h /a a 等电点P I 分子重量M o l e c u l a r w e i g h t /D a 染色体位置C h r o m o s o m e 开始位置S t a r t p o s i t i o n /b p 终止位置E n d p o s i t i o n /b pK Q K 12296B R A D I _1g 02760v 3B d S P L 001N u c l e a r 9625.44105093.45118549411861603K Q K 16095B R A D I _1g 26720v 3B d S P L 002N u c l e a r 1929.9220049.3112176897121771995K Q K 16912B R A D I _1g 31391v 3B d S P L 003N u c l e a r 4169.0544743.6912696896926972090K Q K 04023B R A D I _2g 11240v 3B d S P L 004N u c l e a r 8877.9698502.51294986889504415K Q K 06300B R A D I _2g 25580v 3B d S P L 005N u c l e a r 8495.6992840.3122366060923671447K Q K 11264B R A D I _2g 59110v 3B d S P L 006N u c l e a r 3959.1041667.1225665182256657004K Q J 93258B R A D I _3g 03510v 3B d S P L 007N u c l e a r 4858.3452242.01322901492296008K Q J 93579B R A D I _3g 05510v 3B d S P L 008N u c l e a r 3299.3135413.56339058733909655P N T 66007B R A D I _3g05720v 3B d S P L 009N u c l e a r 4846.6252083.88340794364082696K Q J 98926B R A D I _3g 40030v 3B d S P L 010N u c l e a r 3919.1640509.6134200945442013977K Q J 98959B R A D I _3g 40240v 3B d S P L 011N u c l e a r 11266.92122962.7634217730942183011K Q J 99120B R A D I _3g 41250v 3B d S P L 012N u c l e a r 4257.1144358.0834295057542955786K Q J 88495B R A D I _4g 18891v 3B d S P L 013N u c l e a r 3969.1842421.6042141557021423382K Q J 90760B R A D I _4g 33770v 3B d S P L 014N u c l e a r 4077.8042510.5943937120739375028K Q J 90930B R A D I _4g 34667v 3B d S P L 015N u c l e a r 4217.2244677.0644011520640120965K Q J 83945B R A D I _5g 17722v 3B d S P L 016N u c l e a r 3609.5537889.7852107011321074001K Q J 85066B R A D I _5g24670v 3B d S P L 017N u c l e a r4207.5145811.2652640263426406908图3 B d S P L s 基因结构和保守基序分析F i g.3 G e n e s t r u c t u r e a n d c o n s e r v e dm o t i f s o fB d S P L s m o t i f 3㊁9㊁10和11仅存在于F 组和G 组的B d -S P L 蛋白中;m o t i f7存在于F 组亚家族的B d -S P L 001㊁004和011中㊂推测同一组成员具有相似的功能㊂2.4 二穗短柄草与水稻、小麦和玉米的S P L 基因共线性分析在二穗短柄草(图4A )中检测到6对基因复制事件,其中5对与片段复制事件有关,1对为串联复制事件㊂这表明片段复制事件对B d S P L 的进化起主要作用㊂所有B d S P L s 的K a /K s 均小于1;复制事件的发散时间约为76M ya ㊂在其他3个物种中检测到125个基因与B d S P L 基因是共线的,其中,水稻有23个(图4B ),小麦有62个(图4C ),玉米有40个(图4D )㊂这表明与水稻和玉米相比,小麦与二穗短柄草S P L 基因相似性更高㊂除B d S P L 012/O s 01t 0922600㊁B d S P L 015/O s 01t 0922600㊁B d -S P L 006/T r a e s C S 7A 02G 260500等10对基因的K a /K s 值大于1外,其余115对基因的K a /K s 值均小于1㊂B d S P L s 与水稻的分化时间约为53M y a ,早于小麦的45M y a ,晚于玉米的57M y a ㊂这表明B d S P L 基因经过了纯化选择,其中K a /K s >1的基因对在进化过程中起着重要作用㊂㊃6731㊃麦类作物学报第43卷2.5B d S P L s的G O注释及与其他蛋白质相互作用分析G O注释显示(图5),17个B d S P L蛋白共得到22个G O注解,其中14个与生物过程有关,2个与分子功能有关,6个与细胞组分有关㊂在细胞组分中,17个B d S P L s与细胞和细胞器组成有关,不到30%的B d S P L s参与膜的形成㊂在分子功能中,17个B d S P L s均与D N A结合,不到10%的B d S P L s具有转录调节功能㊂在生物过程中,超过60%的B d S P L蛋白参与了二穗短柄草的生长和发育,包括发育过程㊁代谢过程和生物过程㊂不到40%的B d S P L s能对环境压力作出反应㊂这说明B d S P L蛋白参与各种生理过程㊂构建B d S P L s与二穗短柄草中其他蛋白之间的相互作用网络(图6),共检测到678个相互作用的蛋白分支,每个B d S P L与至少4个其他蛋白发生15次相互作用㊂其中,47%的B d S P L s与至少61个蛋白相互作用,如B d S P L006㊁007和008,表明这些S P L蛋白在蛋白网络的调节中发挥重要作用㊂将与B d S P L蛋白相互作用的其他A:二穗短柄草基因组中的重复基因对;B㊁C㊁D:二穗短柄草与水稻㊁小麦㊁玉米间的共线性;浅色背景代表四个物种整个基因组中的共性区块,深色线条代表B d S P L s的共线基因对㊂A:D u p l i c a t e d g e n e p a i r s i nt h e B.d i s t a c h y o n g e n o m e;B,C,a n dD:C o l i n e a r i t y b e t w e e n B.d i s t a c h y o n a n dr i c e,w h e a t,a n d m a i z e,r e s p e c t i v e l y.T h e l i g h t b a c k g r o u n d r e p r e s e n t s s y n t e n y b l o c k s i nt h ew h o l e g e n o m eo f t h e f o u r s p e c i e s,a n dd a r k l i n e s s t a n d f o r c o l l i n e a r g e n e p a i r s o f B d S P L s.图4B d S P L s基因的共线性分析F i g.4C o l i n e a r i t y a n a l y s e s o f B d S P L g e n e s㊃7731㊃第11期王淑婷等:二穗短柄草S P L家族基因的鉴定㊁系统发育和表达分析图5 B d S P L 蛋白的G O 注释F i g.5 G Oa n n o t a t i o n s o fB d S P L p r o t e i ns B d S P L s 蛋白标记为红色,其他蛋白标记为蓝色㊂T h eB d S P L p r o t e i n s a r em a r k e d i n r e d ,a n d t h e o t h e r p r o t e i n s a r em a r k e d i nb l u e .图6 B d S P L s 和其他二穗短柄草蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用网络F i g .6 P r o t e i n -pr o t e i n i n t e r a c t i o nn e t w o r kb e t w e e nB d S P L sw i t ho t h e r p r o t e i n s i n B .d i s t a c h y o n 蛋白的序列提交到C D D 数据库,发现多数为A P 2和MA D S 超家族㊂据报道,A P 2家族在激素调节和花发育中具有重要作用[45]㊂推测B d -S P L 蛋白与A P 2家族的蛋白相互作用调节植物的花发育㊂2.6 B d S P L s 基因的启动子分析为了确定B d S P L 基因中包含的顺式作用元件,我们分析了这些基因上游启动子部位的1.5k bD N A 序列㊂结果(图7)表明,B d S P L 基因启动子区域包含多种顺式元件,可分为激素和胁迫反应元件㊁光响应元件和植物生长发育元件三类㊂其中,有47%属于光反应元件㊂59%的基因含有G -b o x ,推测B d S P L 基因可能受光调控;88%的B d S P L 基因含有与脱落酸反应相关的A b r e 元㊃8731㊃麦类作物学报第43卷件,推测其参与A B A 代谢途径的调节;大约58%的B d S P L 基因含有A R E ㊁C G T C A -M o t i f㊁T G A C G -M o t i f 三种元件,推测其参与厌氧诱导和M e J A 介导的反应㊂此外,启动子序列中还有一些与植物生长发育相关的元件,如C A T -b o x㊁O 2-S i t e 和H D -Z I P -1㊂推测B d S P L 基因在调节植物生长发育㊁光调节和激素反应等生理过程中发挥作用㊂2.7 B d S P L s 基因的表达分析为了确定B d S P L 基因的组织特异性表达模式,通过S R A 数据库分析其在二穗短柄草的9个组织(叶片㊁早期花序㊁出苗花序㊁花药㊁雌蕊㊁授粉后5d 的种子㊁授粉后10d 的种子㊁植物胚胎和胚乳)的转录数据,并绘制了热图㊂结果(图8A )表明,同一亚族的B d S P L 基因具有相似的组织表达模式;其中B d S P L 009㊁-010㊁-014㊁-017等12个基因在花序早期和萌发组织中高表达,推测其与花的发育过程有关㊂B d S P L 001㊁-004㊁-006等8个基因主要在雌蕊中表达,B d S P L 001㊁-004㊁-008和-011在授粉后5d 的种子中表达㊂只有少数基因在授粉后10d 的叶片㊁种子㊁植物胚胎或胚乳中表达水平较高,如B d S P L 004㊁-005和-010㊂推测B d S P L s 主要参与花的发育㊂通过S R A 数据库分析了14个B d S P L s 在8种植物激素高低水平处理下的表达数据(图8B )发现,与低浓度激素处理相比,B d S P L 基因在高浓度下的表达一致㊂例如,B d S P L 001㊁-009和-014在高浓度激素下有较高的表达水平;在低浓度条件下,B d S P L 001和-014被细胞分裂素㊁A B A 和生长素等6种植物激素上调,并被G A 下调;B d S P L 009在生长素㊁A B A 和G A 处理下高表达,但在B R 处理下表达很低㊂这表明B d S P L s 对低浓度激素处理更敏感㊂在低浓度植物激素处理下,大多数基因上调,B d S P L 015在A B A 处理下高表达,B d S P L 002㊁-005和-006在J A 处理下高表达,B d S P L 005㊁-007和-012在乙烯处理下高表达而B d S P L 002㊁-006㊁-008㊁-009㊁-012和-014等大多数基因被B R 或G A 处理下调㊂由此认为,B d S P L s 可以正向调节J A 和乙烯途径,负向调节G A 和B R 途径㊂图7 B d S P L 基因中包含的顺式作用元件F i g .7 C i s -a c t i n g el e m e n t s c o n t a i n e d i n B d S P L g e n e s 2.8 B d S P L s 基因的表达分析为了研究B d S P L s 的功能,采用q R T -P C R 技术检测17个B d S P L s 在四个组织(根㊁叶㊁茎和花序)的表达模式㊂从图9A 发现,大多数B d S P L 基因在花序中的表达高于根㊁茎和叶;除了B d -S P L 006㊁-008㊁-009和-012外,其余13个基因在花序中有高水平表达,进一步证明B d S P L s 与花的发育密切相关㊂B d S P L 001㊁-003和-005等14个B d S P L s 基因在叶中的表达高于根和茎,表明这14个基因参与了叶的发育㊂B d S P L 006和B d S P L 012基因在茎中高表达,表明这两个基因可能影响茎的发育㊂分析胁迫㊁温度㊁激素5个不同处理下17个B d S P L s 的表达水平(图9B )发现,约有50%的㊃9731㊃第11期王淑婷等:二穗短柄草S P L 家族基因的鉴定㊁系统发育和表达分析B d S P L s 在所有处理下呈下调趋势㊂例如,G A 处理下所有B d S P L s 的表达均下调,A B A 处理下85%的B d S P L s 表达下调,P E G 处理下94%的B d -S P L s 表达下调,低温下,B d S P L 004㊁-005㊁-007㊁-008㊁-013㊁-014㊁-016和-017共8个基因表达降低㊂有少数B d S P L s 基因表达上调,如B d -S P L 005㊁-013㊁-014和-016在盐处理下表达上调,B d S P L 009㊁-011和-012在低温处理下高表图8 B d S P L s 基因在9种组织(A )㊁8种植物激素和胁迫(B )下的表达谱F i g .8 E x p r e s s i o n p a t t e r n s o f B d S P L g e n e s i nn i n e t i s s u e (A )a n d e i g h t p h yt o h o r m o n e s t r e a t m e n t s (B)图9 17个B d S P L s 基因在4个组织(A )和5种不同处理(B )下的相对表达水平F i g .9 R e l a t i v e e x pr e s s i o n l e v e l s o f t h e 17g e n e s i n f o u r t i s s u e s (A )a n d f i v e d i f f e r e n t t r e a t m e n t s (B )㊃0831㊃麦类作物学报第43卷达,B d S P L006㊁-010和-015在盐和低温处理下均表达上调㊂这些结果表明,B d S P L s对G A和A B A处理及干旱处理可能有负调控作用㊂3讨论3.1二穗短柄草中S P L家族基因的特征本研究采用比较基因组学的方法,从二穗短柄草全基因组中获得了17个B d S P L基因,多于拟南芥(16)[11],但少于玉米(31)[46]㊁水稻(19)[47]和荞麦(24)[48]㊂17个S P L蛋白序列长度㊁分子量及等电点均存在较大的差异,亚细胞定位其均在细胞核中,这与上述植物的结果一致,推测其功能保守㊂系统发育树将二穗短柄草㊁拟南芥和水稻的S P L基因分为7个组,同一组中同源性较高的基因可能具有相似的功能,如B组二穗短柄草B d S P L003和水稻O s S P L010具有较高的同源性,而水稻O s S P L010已被证明参与逆境胁迫响应及水稻生长发育过程[49],推测B d S P L003参与二穗短柄草逆境胁迫和生长发育㊂鉴定到17对二穗短柄草和水稻的同源S P L基因,但没有鉴定出二穗短柄草和拟南芥间的S P L同源基因对,这表明B d S P L基因与水稻的同源性高于拟南芥㊂本研究发现5对B d S P L基因归因于片段复制事件,只有1对B d S P L基因经历了串联复制事件,这与L i u 等[48]结果一致㊂共线性结果表明,B d S P L s与小麦的同源基因比水稻和玉米的同源基因更多㊂3.2B d S P L s的结构基因结构包括外显子和内含子,X u[50]认为,内含子和外显子通过获取㊁丢失㊁插入或缺失进化㊂基因的结构不仅是影响基因功能的主要因素,也是了解基因家族进化的重要基础㊂本研究发现,B d S P L基因有2~11个外显子,大部分基因含有3个外显子㊂推测B d S P L基因在进化过程中因为内含子/外显子的插入和缺失导致其结构和功能产生差异,多数B d S P L基因有3个外显子,表明B d S P L基因较保守㊂G u o[51]认为,生物体中染色体融合或重组的原因之一是基因组进化过程中内含子/外显子数量的变化,这些变化改变了基因的功能㊂在本研究中,B d S P L基因内含子或外显子的数量不同,也影响了二穗短柄草S P L基因的生物学功能㊂在本研究中,在B d S P L蛋白中发现了15个基序㊂M o t i f1和m o t i f2主要编码S P L结构域,不同的亚族含有特定的保守基序,这与水稻[47]研究结果一致㊂特有的基序增加了S P L蛋白功能的多样性,特定的保守基序是其功能的关键㊂3.3B d S P L基因的潜在功能在本研究中,大多数B d S P L基因在花序中高表达,表明B d S P L基因可能对花的发育过程中具有重要作用㊂C h a o[52]报道了A t S P L1基因可以通过调节营养生长期下游靶基因的表达增强花序的耐热性;L i u[48]发现A t S P L2㊁-9㊁-10㊁-11㊁-13和-15促进了苦荞从营养生长到生殖生长的转化,并调控其花和茎的发育;C u i[53]报道A t S P L9缩短了植物的开花时间,调节侧根的生长㊂同源基因一般具有相似的功能㊂在本研究中,进化分析结果表明,A t S P L1和A t S P L12与B d S P L001㊁-004和B d S P L014高度同源;A t S P L2㊁-10和-11与B d S P L007㊁-008高度同源;A t S P L9㊁-15与B d-S P L010㊁-014和-016密切相关;A t S P L13与属于A组的B d S P L基因高度同源㊂许多与上述A t-S P L基因同源的B d S P L基因在花序中的表达水平高于其他三个组织,表明B d S P L基因可能参与花的发育㊂此外,在茎中低表达的B d S P L006和-012基因与A t S P L13同源,表明这两个基因可能参与了茎的发育㊂通过基因芯片和m i R N A测序发现,植物中很多m i c r o R N A基因响应生物和非生物胁迫,而S P L基因作为m i c r o R N A156的靶基因,也在响应环境胁迫中发挥着关键作用[54]㊂本研究发现, S P L基因在苗期的表达水平都很低㊂W u[55-56]和W a n g[57]报道m i R156在苗期的表达水平最高,随着植物从苗期向成熟期转变,其表达水平逐渐降低㊂A t S P L3和A t S P L9的表达水平在苗期较低,在整个营养生长期逐渐升高㊂因此,推测m i R156在苗期抑制S P L基因的表达㊂17个B d S P L基因均在G A和A B A胁迫下下调,表明B d S P L基因在G A和A B A介导的植物生长中起负调控作用㊂在P E G㊁盐和低温处理下,不同B d S P L基因或上调或下调㊂C u i[53]发现盐和干旱处理下调了A t S P L9的表达,推迟了拟南芥的开花㊂本研究发现,B d S P L010㊁-014和-016基因与A t S P L9有很高的同源性,推测这3个基因延缓开花时间㊂参考文献:[1]G U O XJ,WA N GJR.G l o b a l i d e n t i f i c a t i o n,s t r u c t u r a l a n a l y-s i s a n d e x p r e s s i o n c h a r a c t e r i z a t i o n o f b H L Ht r a n s c r i p t i o n f a c-㊃1831㊃第11期王淑婷等:二穗短柄草S P 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摘要
将拟南芥中衰老特异启动子 C; 6 基因导入结缕草胚性愈伤组织 , 经抗性筛 ) 7 M ! " 控制下的-
选、N A G 扩增和 Q @ 2 = 1 < F 7 杂交 , 共获得 & ’ 株转6 基因植株 # 其中有 * 个转基因株系衰老延缓 , ) 绿色期延长 , 生育后期其体内细胞分裂素、可溶性糖、可溶性蛋白等含量明显高于野生型 , 而脱落酸的含量明显下降 # 通过测定离体叶片培养过程中光合速率的变化 , 也证实了转基因植株叶片衰老速度明显减慢 # 其中 ? ) !和 ? ) ! " 两个转基因株系能延长绿色期达 " + ; 以上 # 关键词
滞绿 ) 效果观察 $% C 离体叶片的 ( 分别取转基因植株和野生型上叶位相同、刚展开的完全叶 , 放在铺有湿滤纸的培养皿中 , 保湿离 / , 光照强度体培养, " ; +g 下光照 % 1 " -- ) ,每( 天用 O / ( 6 _* ( $ $光合系统试 ! " $$ @ 0 剂测量叶片的光合速率 #
[$, ] ! ! +] 育的干扰 [ 、水 # 用 C; 6 基因转化烟草 ! 7 M ! " ) ] ] ! " ! & ! (] ! +] 稻[ 、番茄[ 、牧草白三叶[ 、花椰菜[ 、莴 ] ! * ! ’] ! %] 苣[ 和小麦[ 、青菜 [ ,都已获得了延缓叶片衰
% " $
第! "卷
第#期 $ % % "年#月
& 结果与分析
&% $ 结缕草愈伤组织的诱导和分化种子胚诱导出的愈伤组织呈 & 种形态 : ) 型生长较慢 , 结构致密 , 表面有颗粒状的胚性愈伤组织 ; * 型为非胚性愈伤组织中镶嵌胚性愈伤组织 ; 图 , 型为生长迅速 , 呈水泡状的非胚性愈伤组织 ( ) ;) 型和 * 型的愈伤组织分化成苗率分别为 " ! $ $f 和 % "# (f , 而 , 型未能分化出幼苗 # 故本实验以 ) 型和 * 型愈伤组织为转化受体 #
D] 副作用 [ # 为了减少负面效应 ,C . 7 等利用来源于
绿色期 , 对其推广和应用具有重要的意义 # 植物叶片衰老是一个典型的细胞程序性死亡过程 , 伴随着叶绿素、脂类、总蛋白及 G 9: 的降解
[ ] &
拟南芥中高度特异的衰老基因 ; 7 M ! "的启动子与
% ! %
第! "卷
第#期 $ % % "年#月
转% . 基因结缕草的获得及 " , & ) + $ & 其衰老特性分析 "
章家长! 孙振元" 李召虎! 何钟佩! 段留生!**
中国农业大学作物化学控制研究中心国家植物生理生化重点开放实验室 , 北京 ! !# $ $ $ D (; 中国林业科学院林业研究所 , 北京 ! "# $ $ $ % !
图 $ 质粒 % & + / 0 1 基因结构图
$% B 植物激素细胞分裂素和脱落酸的测定待野生型下部叶片开始出现衰老时 , 取地上叶片混合 , 用 % $f 甲醇溶液提取植物激素 , 采用、二氢玉米 V) , O _ Q : 方法测定细胞分裂素玉米素 ( ,以及脱落酸素( 、异戊烯基腺嘌呤 ( / N) 8L V) 含量 , 具体方法参见文献 [ ( + : K :) " " # $% . 可溶性蛋白含量的测定取样与 !# + 中相同p 将 $# +B 鲜叶匀浆 ,! $ $ $B 离心 ! , 取上清液稀释后 , 加考马斯亮兰 C $/ 7 " + $ 溶液 , 用 ^S ’ " !型紫外分光光度计测量波长制 + D + 7 -处的 U 8 值,同时用牛血清白蛋白 ( K Q :)
[ ! D, " $+
/ 用 $# O 甘露醇或山梨醇预处理愈伤组织 " +@ 0 / " $/ 7# 采用 K / @ ) F . ; 公司的 N 8 Q ) ! $ $ $ L <基因枪 , 轰击培养皿中愈伤组织 , 转化条件同文献 [ ! "+ # 转化后的愈伤组织在_ E 培养基上培养’ ; 后 , 转入选择培养基上培养 # 选择培养基是在继代、分化、 / ( 壮苗培养基中加入 ! 经多次预备试验 $ $OC ( ! % B 确定的筛选压 ) #
如光强、温度、水分、无机营养 #外部刺激 (
7 6 基因融 + ( 8 1 ’ 6 * + / 26 / 2 * 1 ’ * . ,中? /质粒的E F ) 合 , 构建了一种能自我调节的细胞分裂素产生系
统 , 有效避免了细胞分裂素累积对植物正常生长发
$% : 转基因植株的分子鉴定采用 N A G和Q @ 2 = 1 < F 7杂交结合的方法进行转
[D + 基因植株的鉴定 ,A , ? : K 法提取其基因组 8 9: !
以 NC ) ? A C C A ? :? ) H I I 上一对特异性引物 +, , 和 , C: A ? C C C A : A :: A :C: ) & + ) ::C::C ) C A C:? :C::C C A C:? C A C ) & , (两者相距 ) 对转基因植株 8 ’ $ $M 9: 进行扩增 , 其程序同付 4
$ 材料与方法
$% $ 结缕草品种和质粒结缕草品种为中华结缕草 ( N ( , 1, . ’ 1 & ) , 来源于中国林业科学院 ; 质粒 N L . 7 5 < Q C + " D由 X / 6 5 @ 7 6 / 7 大பைடு நூலகம் G / 5 1 . F ; E#:. 6 / 7 @教授提供,含有衰老特异性启动子 C; 7 M ! " 和异戊烯基转移酶基因图! ) , 筛选基因为 NH ( ( _ N ?) C* # 6 )
第! "卷
第#期 $ % % "年#月
% ! D
的改良方法主要依赖于种间或品种间的杂交, 但 # 本研究采用转基因方法将 C; 6 转入结缕草, ) 7 M ! " 获得转基因植株,并对转基因植株体内细胞分裂素、可溶性糖、可溶性蛋白等含量对叶片衰老的影响进行分析# 由于其育性和倍性的关系, 育种速度较慢
目前 , 从植物中鉴别出与细胞分裂素合成有关的基因很少
[ ] ’
#K . F F > 等从野生型农杆菌中分离出
细胞分裂素合成途径中的第一关键酶 ( 即异戊烯基
" $ $ ( ) ! ! ) & $ 收稿 ," $ $ ( ) ! " ) " ’ 收修改稿八六三 " 计划 ( 批准号 :" 资助项目 ) $ $ " :: " ( ! $ * ! * 国家 " :; , ) . / 0 2 . 7 0 6 1 . 2# < ; 2# 5 7 * * 通讯作者 , @5
结缕草细胞分裂素 % " , . 延缓衰老 & ) + $ & -
结缕草 ( N ( , 1, . ’ 1) 是我国最重要的暖季 & 型草坪草之一 , 具有良好的耐干旱、耐践踏、耐瘠薄、耐盐碱和抗病能力 , 已成为运动场、开放绿地、边坡绿化和水土保持的重要草种 # 但结缕草返
图 ’ 转基因结缕草的 J = + 分析
!*%, 转基因植株 ;D,C ; M O P Q; ! $, 阴性对照 ; E, 为 8 9: 分子标志
图 & 胚性愈伤组织形态
图 : 部分转基因植株的杂交
, 阴性对照 ;"*(, 转基因植株 ; 其中 " 的 8 9: ! 未经酶切 ;+,C / ; E,8 L _ 9: 标志 ; M O P Q
和病原物侵袭等 ) 和内部因子( 如植株和叶片年龄、碳水化合物水平、生殖器官发育、植物激素等 ) 都
(] 能调节叶片衰老 [ ,其中植物激素, 尤其是细胞分 +] 裂素 , 被认为是叶片衰老调控的主导因子 [ #早期
的研究发现 , 在植物衰老过程中内源细胞分裂素水平下降 , 但施用外源细胞分裂素处理能明显延迟衰
] * 老[ #
老的转基因植株 , 且基本不影响植株的正常生长与发育 # 尽管延缓叶片衰老对植物品种改良有很大的潜力,但目前还仅限于几种植物, 迫切需要扩展其应用领域#结缕草的绿色期较短, 其叶片衰老较快一直是限制其推广和应用的一大难题, 传统