微生物第六章
第六章微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。
生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。
既有量变也有质变。
三者之间的关系：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。
将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。
又叫30 min沉淀率。
该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。
正常范围为15-30%。
2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。
包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。
如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
第六章微生物生长
微生物的生长与环境条件
目的要求： 1、微生物生长量的测定方式。 2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点。 3、物理因子，化学药物对微生物生长的影响。 重 点：
细菌纯培养生长曲线。 难 点：
如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来 计算细菌的代时和代数。
第一节 微生物的个体与群体生长和繁殖
利用选择培养基法
适用于分离某些生理类型较特殊 的微生物
三. 微生物生长的测定方法
评价培养条件、营养物质
微
等对微生物生长的影响；
生
物
评价不同的抗菌物质对微生物
生
产生抑制(或杀死)作用的效果；
长
客观地反映微生物生长的规律。
（一） 细胞数量的测定
1. 细胞总数的测定
(1) 显微镜直接计数法： 计数板法（如：血球计数板法、细胞计数板） 改进：用染色剂可区别死活细胞，如酵母用美蓝， 细菌用吖叮橙（紫外光）
3. 连续培养优缺点
1) 优点：
高效：简化了操作; 自控：便于各种仪表进行自动控制; 产品质量稳定; 节约大量动力、人力、水和蒸汽。
3. 连续培养优缺点
2) 缺点：
菌种易于退化； 易于遭到杂菌污染； 营养物利用率低于单批培养。 连续发酵，一般只能维持数月~ 1年。
二第. 获一得节 纯测培定养生的长繁方殖法的方法
在中等浓度下，增加养料浓度只提高最大收获量。
在高等浓度下，增加养料浓度不能对菌体生长速度和 最大收获量起促进作用。
（二）二次生长
当培养液中同时存在两种均能被微生物所利用的主 要营养物质时，微生物将首先利用其中较易利用的营 养物质开始生长。当较易利用的营养物质被消耗完， 进入稳定期后，微生物经过短暂的适应，开始利用第 二种营养物质，再次开始新的对数生长，并进入新的 稳定期，表现为二阶式的双峰生长曲线，称为二次生 长曲线（diauxic growth curve）.
第六章微生物的生长及其控制
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1) t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
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一些细菌的代时
菌名
培养基 培养温度 代时
E. coli（大肠杆菌） 肉汤
37℃ 17min
E. coli
牛奶
37
12.5
Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）
肉汤或牛奶 37
一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
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（1）恒浊器 — 恒浊连续培养
Ø特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长 ，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺 复杂，烦琐。 Ø使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相 平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
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（二）指数期
1、特点： Ø 生长速率常数R最大，即代时最短; Ø细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致; Ø酶系活跃，代谢最旺盛。
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x2
2、指数期中的的
三个重要参数
x1
t1
t2
u繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
u生长速率常数R= u代时G=
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（三）稳定期
1、特点： （1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 （2）菌体产量达到了最高点。 （3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。 （4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢； （5）通过复杂的次生代谢途径合成各种次生代谢物。
微生物学 第六章 微生物的代谢
6-磷酸-果糖
磷酸己糖酮解酶
4-磷酸-赤藓糖 +-核糖
戊糖酮解酶
乙酸
3--磷酸甘油醛+ 乙酰磷酸
乳酸 乙酸
1 G 乳酸 + 1.5乙酸 + 2.5 ATP
三、发酵（fermentantion） 1、定义
广义：利用微生物生产有用代谢一种生产方式。 狭义：厌氧条件下，以自身内部某些中间代谢 产物作为最终氢（电子）受体的产能过程 特点： 1）通过底物水平磷酸化产ATP； 2）葡萄糖氧化不彻底，大部分能量存在于 发酵产物中； 3）产能率低； 4）产多种发酵产物。
乙醛脱氢酶
乙醇脱氢酶
乙酸 乙醇
草酰乙酸
丙酸
志贺氏菌无此酶，故发酵G 不产气。
b 丁二醇发酵（2，3--丁二醇发酵） —— 肠杆菌、沙雷氏菌、欧文氏菌等 丙酮酸
V.P.试验的原理：
乙酰乳酸
红色物质
（乙酰乳酸脱氢酶）
3-羟基丁酮
（OH-、O2）
精氨酸胍基
乙二酰
丁二醇
中性
其中两个重要的鉴定反应：
1 、V．P．实验 2、甲基红（M.R）反应
微生物学-第六章 微生物的生长及其控制
步骤：
菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜 培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始 洗脱液 后就可 以得 到刚刚分裂下来 的新生细胞， 即为同步培养。
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二、单细胞微生物的典型生长曲线
1.平板菌落计数法
最常用的活菌计数法。将适当稀释的菌液倾注平板 或涂布在平板表面，经适当温度培养后，以平板上出 现的菌落数乘以稀释度就可计数出原菌液的含菌量。 直径9cm 的平板上出现菌落数一般以50～500个为 宜。按照国家标准规定的样品菌落数总数测定的计数 原则，以平板菌落数在30～300个之间为报告依据。 适用范围： 中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微 生物。
生长曲线概念： 定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的 实验曲线，称为生长曲线。 生长曲线的制作： 把少量纯种单细胞微生物接种到一定体积的培养液 中后，在适宜的条件下培养，如果以细胞数目的对数 值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以绘制出分 批培养条件下微生物的生长曲线。
每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长 过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为 四个时期，即迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
技术要求： 样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操 作），严格无菌操作； 注意事项： 每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理， 倾注平板时的培养基温度； 误差： 多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样 品内菌体分布不均匀、以及不当操作。
2. 液体稀释法
对样品做10倍连续稀释，从适宜的3个连续稀 释度 中各取5ml 试 样，接 种 3组共9 支装有培养液 的试管中（每管接入1ml ）。经培养后，记录每个 稀 释 度 出 现 生 长 的 试 管 数 ， 然 后 查 M.P.N. 表 （most probable number，最大可能数），根据 样品稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。
微生物第六章总结
2.厌氧菌的液体培养：厌氧罐，厌氧手套箱。
二， 生产实践中培养微生物的装置
（一）固态培养法
1.好氧菌的曲法培养
通风曲：是一种机械化程度和生产效率都较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业种广泛应用。
衰亡期的原因有：外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌体死亡。
三， 微生物的连续培养
连续培养：又称开放培养，是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的那种单批培养或密闭培养而言的。
1.连续培养的类型：（1）按控制方式分<1>恒浊器：是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养。<2>恒化器：与恒浊器相反，是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于某最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。
3.生长限制因子：凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。
（三）稳定期：又称恒定期或最高生长期。特点是：生长速率常数R等于零，处在新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等。
1. 生长产量常数Y（生长得率）可表示菌体产量与营养物的消耗关系：y=x-x0/c0-c=x-x0/c0（x为稳定期的细胞干重g/mL，x0为刚接种时的细胞干重，c0为限制性营养物的最初浓度g/mL，c为稳定期时限制性营养物的浓度）
（2）按培养器级数分：单级连续培养器和多级连续培养器两类。
2.连续培养用于生产实践称为连续发酵。连续发酵与单批发酵相比优点是：（1）高效（2）自控（3）产品质量较稳定（4）节约了大量动力。缺点是：（1）菌种易退化（2）易污染杂菌。
第6章-微生物的代谢
新陈代谢 = 分解代谢 + 合成代谢 分解代谢：指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系 的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式 的能量和还原力的作用。
合成代谢：指在合成代谢酶系的催化下，由简单小 分子、ATP形式的能量和还原力一起合成复杂的大 分子的过程。
合成代谢按产物在机体中作用不同分： 初级代谢： 提供能量、前体、结构物质等生命活动所 必须的代谢物的代谢类型；产物：氨基酸、核苷酸等。 次级代谢： 在一定生长阶段出现非生命活动所必需的代 谢类型；产物：抗生素、色素、激素、生物碱等。
•反应步骤简单，产能效率低.
• 此途径可与EMP途径、HMP途径和TCA循环相连接， 可互相协调以满足微生物对能量、还原力和不同中间 代谢物的需要。好氧时与TCA循环相连，厌氧时进行 乙醇发酵.
相关的发酵生产：细菌酒精发酵
葡萄糖三条降解途径在不同微生物中的分布
菌名 酿酒酵母 产朊假丝酵母 灰色链霉菌 产黄青霉 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 嗜糖假单胞菌 枯草杆菌 氧化葡萄糖杆菌 真养产碱菌 运动发酵单胞菌 藤黄八叠球菌
氧被消耗而造成局部的厌氧环境
硝酸盐还原细菌进行厌氧呼吸
土壤中植物能利用的氮 （硝酸盐NO3-）还原成 氮气而消失，从而降低 了土壤的肥力。
松土，排除过多的水分， 保证土壤中有良好的通 气条件。
反硝化作用在氮素循环中的重要作用
硝酸盐是一种容易溶解于水的物质， 通常通过水从土壤流入水域中。如果 没有反硝化作用，硝酸盐将在水中积 累，会导致水质变坏与地球上氮素循 环的中断。
2、 HMP途径 (戊糖磷酸途径)
（Hexose Monophophate Pathway）
葡萄糖经转化成6磷酸葡萄糖酸后， 在6-磷酸葡萄糖酸 脱氢酶的催化下， 裂解成5-磷酸戊糖 和CO2。
第六章微生物的生长繁殖及其控制
第六章微生物的生长生殖及其操纵一、微生物生长生殖的概念微生物的生长是指细胞物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。
当细胞个体生长到一定时期，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加即生殖。
在高等生物里这两个过程能够明显分开，但对低等特别是单细胞的微生物，由于细胞小，这两个过程紧密联系、特别难划分，因此，微生物的生长生殖，一般指群体生长，这一点与研究动物、植物有所不同。
1、细菌一般没有有性生殖，多采纳二分裂方式。
2、真菌除了进行无性生殖，产生大量孢子如分生孢子、节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子等外，还能进行有性生殖，产生有性孢子如卵孢子、接合孢子、孢囊孢子等。
二、微生物生长的测定微生物生长：单位时刻里微生物数量或生物量〔Biomass〕的变化个体计数微生物生长的测定：群体重量测定群体生理指标测定〔一〕以数量变化对微生物生长情况进行测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长或样品中所含微生物个体的数量〔细菌、孢子、酵母菌〕。
1、培养平板计数法样品充分混匀后，取一定量的稀释液涂布或倾注在平板上，进行培养，统计平板上长出的菌落数。
注重：1）同一稀释度三个以上重复,取平均值；2）每个平板上的菌落数目适宜，便于正确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，因此在科研中一般用菌落形成单位〔colonyformingunits，CFU〕来表示，而不是直截了当表示为细胞数。
2、膜过滤培养法当样品中菌数特别低时，能够将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。
3、Themostprobablenumbermethod〔液体稀释法〕1〕未知样品进行十倍稀释；2〕取三个连续的稀释度平行接种多支试管并培养；3〕长菌的为阳性，未长菌的为阴性；4〕查表推算出样品中的微生物数目；4、显微镜直截了当计数法采纳细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直截了当计数，计算一定容积里样品中微生物的总数量。
第六章微生物的生长及其控制
第六章微⽣物的⽣长及其控制第六章微⽣物的⽣长及其控制1.概述⽣长:细胞物质有规律地,不可逆地增加,导致细胞体积扩⼤的⽣物学过程.繁殖:微⽣物⽣长到⼀定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定的⽅式产⽣新的⽣命个体，即引起⽣命个体数量增加的⽣物学过程。
⽣长是⼀个量变的过程，繁殖是⼀个质变的过程2.细菌的个体⽣长1.染⾊体DNA的复制和分离细菌的染⾊体为环形双链DNA分⼦。
染⾊体⼀双向的⽅式进⾏连续的复制，在细胞分裂之前不仅完成了染⾊体的复制，⽽且也开始了2个⼦细胞DNA分⼦的复制。
当细胞的⼀个世代即将结束时，不仅为即将形成的2个⼦细胞各备有⼀份完整的遗传信息，⽽且也具有已经按亲本⽅式复制的基因组。
其复制点附着在细胞膜上，随膜的⽣长和细胞分裂，2个未来的⼦细胞基因组不断地分离，最后达到2个⼦细胞中。
细菌在个体⽣长中通过染⾊体DNA的复制，使其遗传特性能保持⾼度的连续性和稳定性。
2.细胞壁的扩增细胞在⽣长过程中，细胞壁只有通过扩增，才能使细胞体积扩⼤。
3.细菌分裂的调节细菌进⼊分裂时期，此时在细菌长度的中间位置，通过细胞质膜内陷并伴随新合成的肽聚糖插⼊，导致横隔壁向⼼⽣长，最后在中⼼回合，完成⼀次分裂，将细菌分裂成2个⼤⼩相等的⼦细菌。
细胞在⽣长和分裂伴随细胞壁的裂解和闭合2个过程。
前者将细胞壁打开，有利于细胞壁物质插⼊；后者在新合成的细胞壁物质插⼊后的开⼝处重新闭合形成完整的细胞壁，以利于机体⽣存。
影响细菌的⽣长和分裂的主要因素是：转肽酶（催化2个肽聚糖的短肽链的链接）；D-Ala-D-Ala-梭肽酶（催化五肽转变为四肽）青霉素竞争性抑制转肽酶。
3. 细菌的群体⽣长繁殖1.⽣长的规律细菌以⼆分裂繁殖,即细胞核⾸先进⾏有丝分裂,然后细胞质通过胞质分裂⽽分开,形成2个相同的个体.分批培养:在封闭系统中对微⽣物进⾏的培养,既不补充营养也不移去培养物质，保持整个培养液体积不变的培养⽅式。
培养曲线：以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，依据不同培养时间⾥细菌数量变化，作出培养期间菌数变化规律的曲线。
沈萍微生物学第六章
丝状真菌细胞的顶端生长
图 4
丝状真菌菌丝细胞顶端生长模型
图 示 Allomyces macrogynus 菌丝的顶端生长
第四节
环境对生长的影响及 生长的测定
一.环境对微生物生长的影响
1.营养物质 1.营养物质 (nutrient) 2.水的活性 2.水的活性 (water activity) 微生物aw 微生物aw范围 aw= 0.6 --- 0.99 aw范围 细菌要求 aw 较高 霉菌要求 aw 较低
图示 丝状真菌的沉淀生长
起始培养时菌丝体
培养18小时后的菌丝体 培养18小时后的菌丝体
影响因素： 影响因素： 接种体积的大小、接种物是否凝集、 接种体积的大小、接种物是否凝集、以及菌丝体是 否易于断裂等因素的综合作用决定着丝状微生物是 丝状生长还是沉淀生长。 丝状生长还是沉淀生长。 工业发酵意义： 工业发酵意义： 丝状微生物在液体培养中的生长方式在工业生产中 很重要，因为它影响发酵过程的通气性、 很重要，因为它影响发酵过程的通气性、生长速率 搅拌能耗及菌丝体与发酵液的分离难易等。 、搅拌能耗及菌丝体与发酵液的分离难易等。
2）对数生长期
特点 • 生长速率最快，细胞呈指数增长 生长速率最快， • 生长速率恒定，代时最短 生长速率恒定， • 代谢旺盛，细胞成分平衡发展 代谢旺盛，细胞成分平衡发展, • 群体的生理特性较一致
微生物学-第六章微生物的遗传
2，T2噬菌体感染实验
用 32P 标 记 病 毒 的 DNA ， 35S 标 记 病 毒 的 蛋白质外壳。然后将这两种不同标记的病毒
分别与宿主大肠杆菌混合，结果发现：用含 有35S蛋白质的T2噬菌体感染大肠杆菌时，大 多数放射性留在宿主细胞的外边，而用含有 32PDNA的T2噬菌体感染大肠杆菌时，32PDNA 注入宿主细胞，并产生噬菌体后代，这些T2 噬菌体后代的蛋白质外壳的组成、形状大小
• 2) 如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基 因仅经过转录而得到表达，就成为流产转导 （abortive transduction），其特点是在选择培养 基平板上形成微小菌落。DNA不能复制，因此群 体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到 其基因产物，形成微小菌落。
• 3）被降解, 转导失败，在选择平板上无菌落形成。
大肠杆菌基因组特点：
1，遗传信息是连续的。
2，功能相关的结构基因组成操纵子结构， 有些功能相关的RNA基因也串联在一起。4100 个 基 因 ， 2584 个 操 纵 子 ， 16SrRNA 基 因 ---23SrRNA基因----5SrRNA基因串联在一起。
3，结构基因在基因组中多为单拷贝。rRNA 基因多拷贝，7个rRNA操纵子。
将待测样品与从老鼠肝脏抽提的酶混合在 一起适当保温后，用直径约2~3mm的圆形滤纸 片吸取待测样品，放置在含有鼠伤寒沙门氏细 菌组氨酸缺陷型突变株的基本培养基平板中央， 370C培养16~24小时。如有诱变作用，则在滤纸 片周围即可长出回复突变的菌落，由于试验纸 片的化学药剂向四周扩散而形成自然的浓度梯 度，故在浓度最高即离试验纸片近的地方，细 菌会全部被杀死，因而无菌落形成；而离试验 滤纸片较远的适宜地方形成回复突变的菌落最 多。
第六章 微生物的生长及控制
第一节
生长 （量变） 繁殖 （质变）
微生物的培养
生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分 与量方面结构在的增加 指生物个体数目的增加
群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者 始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实
际上常以群体生长作为衡量微生物生长的指标。
或密度梯度离心的方法，选择同一生长阶段的细 胞。
18
第二节
微生物的生长规律
离 心 沉 降 分 离 法
19
膜 洗 脱 法
第二节
2.诱导法
微生物的生长规律
诱导法：采用物理、化学因子使微生物细胞生长进
行到某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微生物
细胞不能进入下一个生长阶段，以达到诱导微生物
细胞同步生长的目的。
第二节
微生物的生长规律
延滞原因：适应新的环境条件，合成新的酶，
积累必要的中间产物。
影响延迟期长短的因素： ①菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般 较短； ②接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时， 其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； ③接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至 消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种 量）；
最高菌体产量。
应用范围：实验室科学研究
35
第二节
微生物的生长规律
恒 化 培 养 器
36
第二节
微生物的生长规律
连续培养技术——恒浊培养
概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连 续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速 度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器， 当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则 减慢培养基的流速。 特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可 在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。 使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的 某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
第六章__微生物的生长繁殖与生存案例
相关定义
生长：微生物利用营养物质，细胞
物质的量增多，体积增大。
繁殖：微生物细胞体积增大到一定
程度时，细胞数目增多的过程。
研究微生物生长的方法
单个体微生物生长 生长 分批培养
群体微生物生长
连续培养
在污水生物处理中这两种方法均有应用。
分批培养概念：将定量的微生物接种到封
闭的具有定量培养基的容器中，保持一定的温 度、pH、DO，微生物进行生长繁殖,一定时间 后停止培养。
测定微生物总数：计数器直接计数；比 例计数法；比浊法 测定活细菌数：平板菌落法（CFU）计 数；液体稀释培养计数 计算生长量：测细胞干重法；通过测细 胞含氮量确定细胞浓度
四、微生物生长量 的测定方法
（一）测定微生物总数 1、计数器直接计数:用血球计数板（可 测细菌、酵母菌等）在显微镜下直接计数。 优点：能测定一定容积中细胞总数；简 单方便，测定速度快； 缺点：所测数目包括活菌和死菌，要求 检测人员较高技术，能分辨活、死菌。
2）恒化连续培养
恒化——进料营养物总量恒定 恒定的流速进水，恒定流速出水 尤其适合污水生物处理，除SBR法外；
lg细胞数（个/ml）
连续流入 新鲜培养 液
ห้องสมุดไป่ตู้单批培养
恒浊法 连续培养
恒化法
单批培养 时间
连续培养
目前,
污水连续生物处理法均 类似于恒化连续培养；（流速不 完全恒定）
恒浊培养
恒化 器
培养基 流速 （外控 制）
有限 制生 长因 子
恒定
低于最 高
实验 室为 主
微生物生长量的测定方法
微生物的生长量测定常用的方法有: 称重法、含N量测定法、DNA含量测定 法和 代谢活性法 。 而测定微生物数量变化常用的方法 有直接计数法、稀释平板计数法、最 大概率法 和 比浊法。
微生物学课件 第六章 微生物代谢
ATP ADP+P
Fd
(Fe4S4)2
FeMoCo N2
3、CO2同化
①乙醛酸循环 ②丙酮酸羧化支路 ③甘油酸途径：乙醇酸、草酸、甘氨酸底物， 转化为乙醛酸，缩合成羟基丙酮酸半醛，还原成甘 油酸进入EMP途径。
4、糖类的合成
单糖的合成；多糖的合成。
5、氨基酸的合成
氨基化作用；转氨基作用；前体碳骨架合成。
e-
e- Bph
e- QA e- QB e-
Q库
ADP+Pi Cyt.bc1 ATP
逆电子传递 外源H2
NAD(P) NAD(P)H2
P700 e- Cyt.c2
外源电子供体H2S等
非环式光合磷酸化 （non-cyclic photophosphorylation）
1/202 2H+
叶绿素b
e- Ⅱ
③膜透性调节； ④能荷调节； ⑤诱导作用：类似物诱导； ⑥磷酸盐调节。
（1）CO2的固定：空气中的CO2同化成细胞物质的 过程。
①卡尔文循环
②还原性三羧酸循环固定CO2
乙酰CoA
丙酮酸
磷酸烯醇式丙酮酸
草酰乙
酸
琥珀酰CoA
α-酮戊二酸
柠檬酸
乙酸
乙酰CoA
③还原单酸循环
不消耗能量，Fd由H2或NADH2提供电子，由乙酰
CoA 丙酮酸
草酰乙酸
乙酸
2、生物固氮
固氮微生物(nitrogen –fixing organisms, diazotrophs）
代谢调控：利用遗传学方法或其它生物学方法，人 为地改变和控制生物的代谢途径，生产有用物质或进行 有益服务。
二、微生物产能代谢
微生物第六章
体型效应（体型与增长率、体型与寿命）
体型大小与内禀增长率的关系
生殖对策
r-选择和K-选择理论
（1）MacArthur&Wilson(1967) 将 生物按栖息环境和进化对策分为 r-对策者和K-对策者两大类： r-选择种类是在不稳定环境 中进化的，因而使种群增长率r 最大。 K-选择种类是在接近环境容 量K的稳定环境中进化的，因而 适应竞争。
Grime的 CSR生境
C：竞争型
Hale Waihona Puke 植物生活史策略的三型理论 S：耐忍型
R：杂草型
滞育和休眠
• 休眠 • 滞育 • 潜生现象 • 蛰伏 • 冬眠和夏眠
迁
移
• 迁徙 • 扩散 • 迁移模式
– 反复往返旅行 – 单次往返旅行 – 单程旅行
复杂的生活史周期
• 变态：个体生活史中形态学的变化 • 世代间变化：包括形态转换 • 扩散与生长间平衡 • 生境利用最优化
生活史进化对策中r- 选择和K- 选择的某些相关特征
r-选 择 气候 死亡 存活 数量 种内, 种间竞争 多变, 不确定, 难以预测 灾 变 性 ,无 规 律 ; 非 密 度 制 约 (幼 体 存 活 率 )低 时间上变动大, 不稳定; 远低于环境承载力 多变, 通常不紧张 1. 发 育 快 2. 增 长 力 高 选择倾向 3. 提 高 生 育 4. 体 型 小 5. 一 次 繁 殖 寿命 最终结果 短, 通常少于一年 高繁殖力 K -选 择 稳定, 较确定, 可预测 比较有规律; 密度制约 (幼 体 存 活 率 )高 时间上变动小, 稳定; 通常临近 K 值 经常保持紧张 1. 发 育 缓 慢 2. 竞 争 力 高 3. 延 迟 生 育 4. 体 型 大 5. 多 次 繁 殖 长, 通常大于一年 高存活力
微生物第六章
前，把用量限制在最低水平。
关于亚硝酸盐替代品问题
到19世纪末，才认识到亚硝酸盐可使腌肉产生颜
色。有些国家在没有使用亚硝酸盐之前，肉毒梭
菌中毒率很高，使用后，肉毒梭菌中毒才得到了 控制。
亚硝酸盐除抗菌作用外，还有抗氧化及增强风味 的作用。尽管如此，
由于亚硝酸盐的安全性即致癌问题，使其应用越 来越受到限制，全世界都在寻找理想替代品。
亚硝基（NO）：
HNO2→ H＋ ＋ NO3- ＋ NO ＋ H2O
所生成的NO很快与肌红蛋白反应生成鲜艳的、亮
红色的亚硝基肌红蛋白（MbNO）：
Mb ＋ NO → MbNO
亚硝基肌红蛋白遇热后放出巯基（－SH），生
成较稳定的具有鲜红色的亚硝基血色原。
硝酸盐
亚硝基化菌
※
亚硝酸盐
红菌酶
亚硝酸
低PH值 还原性化合物
第二节
食品添加剂的使用要求与卫生管理
食品添加剂的使用要求 1.经过食品安全性毒理学评价，证明在使用限 量范围内对人体无害。 2、添加剂到体内后能参加正常的人体代谢或 参加正常的解毒过程，全部排出体外，不会对 机体起任何作用 3. 食品添加剂在达到一定使用目的后，经过 加工、烹调或贮存时能被破坏或排除则更加安 全
高铁肌 红蛋白
亚硝基血色 原
放出-SH
一氧化氮
亚硝基肌 红蛋白
红蛋白
硝酸盐和亚硝酸盐生色反应途径
食品添加剂
助发色剂：L－抗坏血酸的作用。
L－抗坏血酸用来防止肌红蛋白氧化，且可把氧
化型的褐色高铁肌红蛋白还原为红色的还原型肌
红蛋白。
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第六章纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.纯培养的方法：见PPT第七章里的第七张稀释倒平板法首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.平板划线分离法分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）选择培养基分离法倾注平板法平板涂布分离法简单易行，但易造成机械损伤单细胞（单孢子）分离法要在显微镜下进行倾注平板法比较常用的方法,但对热敏感菌及严格耗氧菌不太适合.典型的生长曲线：课本153典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。
指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后,在开始培养的一段时间内,因代谢系统适应新环境的需要,细胞数目没有增加的一段时期。
该期的特点为:①生长速率常数为零;②细胞形态变大或增长,许多杆菌可长成丝状③细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高,原生质呈嗜碱性;④合成代谢十分活跃,核糖体、酶类和ATP的合成加速,易产生各种诱导酶;⑤对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。
影响延滞期长短的因素很多,除菌种外,主要有3种:1.接种龄指接种物或种子的生长年龄, 即它生长到生长曲线上哪一阶段时用来作种子的。
这是指某一群体的生理年龄。
实验证明,如果以对数期接种龄的种子接种,则子代培养物的延滞期就短;反之,如以延滞期或衰亡期的种子接种则子代培养物的延滞期就长; 如果以稳定期的种子种, 则延滞期居中。
2.接种量接种量的大小明显影响延滞期的长短。
一般说来,接种量大,则延滞期短,反之则长因此,在发酵工业上,为缩短延滞期以缩短生产周期,通常都采用较大的接种量(种子∶发酵养基= 1∶10 ,V/ V)。
3.培养基成分接种到营养丰富的天然培养基中的微生物,要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。
所以,一般要求发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近,且应适当丰富些。
出现延滞期的原因,是由于接种到新鲜培养液的种子细胞中,一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶,或是缺乏充足的中间代谢物。
为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物,就需要有一段用于适应的时间,此即延滞期。
指数期：指数期又称对数期( logarithmic phase ) ,指在生长曲线中,紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。
指数期的特点是:①生长速率常数R最大,因而细胞每分裂一次所需的时间--代时，或原生质增加一倍所需的倍增时间最短; ②细胞进行平衡生长, 故菌体各部分的成分十分均匀;③酶系活跃,代谢旺盛。
影响指数期微生物代时长短的因素很多,主要是:①菌种:不同菌种其代时差别极大,②营养成分:同一种微生物,在营养丰富的培养基上生长时,其代时较短,反之则长③营养物浓度:营养物的浓度既可影响微生物的生长速率,又可影响它的生长总量，只有在营养物浓度很低( 0.1～2.0 mg/ mL) 时, 才会影响微生物的生长速率。
随着营养物浓度的逐步提高( 2.0～8.0 mg/ mL ) ,生长速率不受影响,而仅影响到最终的菌体产量。
如进一步提高营养物浓度,则已不再影响生长速率和菌体产量了。
凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物,就称生长限制因子④培养温度:温度对微生物的生长速率有明显的影响指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点,故是用作代谢、生理等研究的良好材料,是增殖噬菌体的最适宿主,也是发酵工业中用作种子的最佳材料稳定期稳定期又称恒定期或最高生长期。
其特点是生长速率常数R等于零,即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等,或正生长与负生长相等的动态平衡之中。
这时的菌体产量达到了最高点,而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系,进入稳定期时,细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物;芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢;有的微生物在这时开始以初生代谢物作前体,通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。
所以,次生代谢物又称稳定期产物。
由此还可对生长期进行另一种分类,即以指数期为主的菌体生长期和以稳定期为主的代谢产物合成期。
稳定期到来的原因是:①营养物尤其是生长限制因子的耗尽;②营养物的比例失调稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义,例如,对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵生产来说,稳定期是产物的最佳收获期;对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定(bioassay)来说,稳定期是最佳测定时期;此外,通过对稳定期到来原因的研究,还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建衰亡期( decline phase 或death phase)在衰亡期中,微生物的个体死亡速度超过新生速度,整个群体呈现负生长状态。
这时,细胞形态发生多形化,例如会发生膨大或不规则的退化形态;有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶( autolysis) ;有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物;而在芽孢杆菌中,往往在此期释放芽孢;等等。
产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利,从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢,继而导致大量菌体死亡。
恒浊与恒化培养的区别装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度无限制生不恒定最高速率大量菌体或与菌体相平生产为主( 内控制)长因子行的代谢产物恒化器培养基流速有限制生恒定低于最高速不同生长速率的菌体实验室为主( 外控制)长因子率厌氧菌因不能合成SOD,所以根本无法使O2·歧化成H2O2,因此,在有氧存在时,细胞内形成的O2·就使自身受到毒害PH调节：过酸时:加NaOH、Na2CO3等碱液中和“治标”过碱时:加H2SO4、HCl等酸液中和过酸时加适当氮源: 加尿素、NaNO3、NH4 OH或蛋白质等提高通气量“治本”过碱时 加适当碳源: 加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等降低通气量灭菌( sterilization)：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施,称为灭菌,灭菌实质上还可分杀菌( bacteriocidation)和溶菌( bacteriolysis)两种,前者指菌体虽死,但形体尚存;后者指菌体被杀死后,其细胞因发生自溶、裂解等而消失的现象消毒：是采用较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施1.干热灭菌法(dry heat sterilization)把金属器械或洗净的玻璃器皿放入电热烘箱内,在150～170℃下维持1～2 h后,可达到彻底灭菌的目的。
干热可使细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥,并可使各种细胞成分发生氧化变质。
灼烧是一种最彻底的干热灭菌法,可是因其破坏力很强,故应用范围仅限于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。
2.湿热灭菌法(moist heat sterilization)湿热灭菌法是指用100℃以上的加压蒸气进行灭菌。
在同样温度和相同作用时间下,湿热灭菌法比干热灭菌法更有效,原因是湿热蒸气不但透射力强,而且还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键,从而加速这一重要生命大分子物质的变性。
在湿热温度下,多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10 min后即被杀死,酵母菌细胞和真菌的孢子稍耐热些,要在80℃下才被杀死,细菌的芽孢最耐热,一般要在120℃下处理15 min 才被杀死。
①巴氏消毒法( pasteurization) :因最早由法国微生物学家巴斯德用于果酒消毒,故名。
这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。
此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌,又不影响其原有风味。
巴氏消毒法是一种低温湿热消毒法,处理温度变化很大,一般在60～85℃处理30 min至15 s。
具体方法可分两类:第一类是经典的低温维持法, 例如用于牛奶消毒只要在63℃下维持30 min 即可; 第二类是较现代的高温瞬时法,用此法作牛奶消毒时只要在72℃下保持15 s。
②煮沸消毒法:采用在100℃下煮沸数分钟的方法,一般用于饮用水的消毒。
3.间歇灭菌法(fractional sterilization或tyndallization) :又称分段灭菌法或丁达尔灭菌法。
适用于不耐热培养基的灭菌。
方法是:将待灭菌的培养基放在80～100℃下蒸煮15～60 min ,以杀灭其中所有的微生物营养体,然后放至室温或37℃下保温过夜,诱使其中残存的芽孢发芽,第二天再以同法蒸煮和保温过夜,如此连续重复3天即可在较低的灭菌温度下同样达到彻底灭菌的良好效果。
4常规加压蒸气灭菌法( normal autoclaving) :一般称作“高压蒸气灭菌法”,但因其压力范围甚低(仅在1个大气压左右) ,故改用“加压”两字更合适。
这是一种利用高温(而非压力)进行湿热灭菌的方法,优点是操作简便、效果可靠,故被广泛使用。
其原理是:将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压灭菌锅(或家用压力锅)内,盖上锅盖,并打开排气阀,通过加热煮沸,让蒸气驱尽锅内原有的空气,然后关闭锅盖上的阀门,再继续加热,使锅内蒸气压逐渐上升,随之温度也相应上升至100℃以上。
为达到良好的灭菌效果,一般要求温度应达到121℃(压力为1 kg/ cm2或15磅/英寸2) ,时间维持15～20 min。
有时为防止培养基内葡萄糖等成分的破坏,也可采用在较低温度( 115℃即0.7 kg/ cm2或10磅/英寸2)下维持35 min的方法。
加压蒸气灭菌法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材或物料的灭菌热死时间( thermal death time ) ,指在某一温度下,杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。
热死温度( thermal death point ) ,又称热死点,指在一定时间内(一般为10 min ) ,杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度影响加压蒸气灭菌效果的因素1.灭菌物体含菌量2.灭菌锅内空气排除程度3.灭菌对象的pH4.灭菌对象的体积5.加热与散热速度灭菌锅空气木有排尽有啥影响：抗生素是一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物,它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物(包括病原菌,病毒,癌细胞等)的生命活动,因而可用作优良的化学治疗剂。