农业微生物学1 (3)

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解剖镜
接种针
操作难度与细胞或个体的大小成反比
(二) 选择性培养基分离法
各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵 抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生 物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。
抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离的微生物生长更快；
认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义： ◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的措施有：
①增加接种量； （群体优势----适应性增强）
②采用对数生长期的健壮菌种；
③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养 基的某些成分。
④选用繁殖快的菌种 ◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌
二、细菌分批培养群体生长规律
每次把接种环上的菌烧掉使得新划出的线的菌就是来自于上一 次划线的一个点，这样可以达到逐渐稀释的目的，划到最后的 就会长成单菌落。
连续划线
划线分离后平板上显示的菌落照片
3.单细胞挑取法
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进 行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得 纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下 选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。
将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维 薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培 养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。
（二）细胞生物量测量
1.湿重法：将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。 2.干重法：离心得到的细胞沉淀物置100~105℃的烘箱中干燥 过夜至除去水分，然后称重。 3.含氮量测定法：一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可以用 凯氏定氮法等测其总量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量，蛋 白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。 4.DNA含量测定法：微生物细胞的DNA含量比较稳定，采用 适当的荧光指示剂与菌体DNA作用，荧光比色或分光光度计 法测DNA含量。 5.其它生理指标：如测定碳、磷、RNA、ATP、DAP的含量。
待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制
1. 利用选择平板进行直接分离
牛奶平板： 分离蛋白酶产生菌；
颜色反应： 分离特定的菌株；
待分离的微生物的生 长特征明显不同于其 它微生物
2. 富集培养
特定的环境条件
仅适应于该条件的微生物旺盛生长
待分离微生物在群落中的数量大大增加
从自然界中分离到所需的特定微生物
x2=108 x1=104
lg(x2/x1)=lg108-lg104=8-4=4
代入上式G=240/(3.3 ×4)=240/13.2=18min 细菌繁殖代数n=(t2-t1)/G=240/18=13.3繁代
★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长
速率快，代时长，生长速率慢。
★代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生
微生物纯培养分离方法的比较
分离方法
平皿划线法 稀释平皿法 单细胞挑取法 利用选择培养基法
应用范围
方法简便，多用于分离细菌 即可定性，又可定量，用途广 泛 局限于高度专业化的科学研究 适用于分离某些生理类型较特 殊的
第二节 细菌群体生长的测量
（一）细胞数量的测量
血球计数板法
1.总细胞计数法
比浊法 涂布平板法
优点：传统计数方法 ，对设备要求不高。
10-3
10-4
10-5
10-6
直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以30~300为宜
使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：
稀释！
每毫升样品中微生物细胞数=
每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数
2）薄膜过滤计数法
又叫浓缩法，常用该法测定含菌量较少的空气和水中 的微生物数目。
对数生长期
Nt——对数生长期经过时间t后微生物数量
例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为104/ml,
经过培养4h后，又测得菌液中的细菌数为108/ml，求此
菌的世代时间G和在此时间内繁殖的代数n。 根据公式：G=(t2-t1)/3.3 · 2/x1) lg(x
t2-t1=(4-0) ×60min=240min
2.活菌计数法
滤膜法
（一）细胞数量的测量
利用血球计数 板，在显微镜 下计算一定容 积里样品中微 生物的数量。
适用范围：个体 较大细胞或颗粒
1.细胞总数量
特点：快速，准确。
（1）显微镜测数法
缺点：不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
小
原理：
1mm 大方格： 高0.1mm
生长曲线的制作
生长曲线的制作： 接种 适温培养 定时取样测 定生长量
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜 液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间 取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细 菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。
二、细菌分批培养群体生长规律
☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至 死亡的整个动态变化过程。
2.对数期（指数生长期）
细菌数目以几何级数增加，在生长曲线上，表现为一 条上升的直线。
对数生长期
特点：生长速率常数最大 ，即代时最短 ; 细胞进行 平衡生长， 菌 体大小、形 态、生理特征等比 较一致 ; 代谢最旺盛 ; 细胞对理化 因素较敏感。
应用意义：
①由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄；
分离 基本 步骤 ຫໍສະໝຸດ 养方法倾注平皿分离法 涂布平皿分离法
连续划线分离法 分区划线分离法
平皿划线分离法
单细胞挑取法 利用选择培养基培养法
(一) 稀释分离法 1.稀释平皿分离法 1.稀释平皿分离法
(1)稀释
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
10g
90ml
9ml
9ml
9ml
9ml
9ml
9ml
1/100
1/1000 10-4
使待分离的微生物在群落中的数量上升， 方便用稀释法对其进行纯化。
使待分离的微生物生长“突出”；
直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
＊利用选择培养基进行直接分离 ＊富集培养
1. 利用选择平板进行直接分离
高温下培养： 分离嗜热细菌；
培养基中不含N： 分离固氮菌； 培养基加抗生素： 分离抗性菌；
2.平皿划线分离法
用接种环沾取少许待分离的材料,在 无菌平板表面进行平行划线、扇形 划线或其他形式的连续划线，微生 物细胞数量将随着划线次数的增多 而减少，并逐步分散开来，在平板 表面可得到单菌落。
特点：快速、方便。
(1). 分区划线分离法 适用于浓度较大的样品 (2). 连续划线分离法 适用于浓度较小的样品
采用培养平板计数法要求操作熟练 、准确，否则难以得到正确的结果： 样品充分混匀
每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液
同一稀释度三个以上重复,取平均值
每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数
一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。
计数方法：
（1）16×25规格的计数板
细胞数/1mL＝100 个小方格细胞总数 ×4×106×稀释倍数 100
（2）25×16规格的计数板
细胞数/1mL＝80 个小方格细胞总数 ×4×106×稀释倍数 80
（一）细胞数量的测量
（2）比浊计数法
原理是在一定范围内，菌悬液中的细 胞浓度与混浊度成正比，即与光密度
微生物生长测定方法比较
方法 特点与应用
总 血球计数板法 较快速简便，但较费时 测 细 定 胞 比浊法 快速、简便，但易受干扰 数 细 胞 数 活 平皿菌落计数法 简易价廉，但花费时间较长，不能立刻知道结果 目 细 胞 快速简便，适于含菌数很低的空气、水等中的总菌计数 数 薄膜过滤法
测 定 物 质 量 细胞湿重法 细胞干重法 较为简便，但含水量不定，准确度差 较为费时，易受颗粒杂质干扰，敏感度低
第四章 微生物的生长与环境条件
第一节 纯培养微生物的群体生长
一、获得纯培养的方法 （一）稀释分离法 1.稀释平皿分离法 2.平皿划线分离法 3.单细胞挑取法 （二）选择培养基 第二节 细菌群体生长的测量 （一）细胞数量的测量 （二）细胞生物量的测定 第三节 分批培养中细菌群体的生长 第四节 环境条件对微生物生长和代谢的影响
将1mm2×0.1mm的 薄层空间划分为 大 400小格，从中均 方 匀分布地选取80 格 或100小格，计数 其中的细胞数目， 换算成单位体积 中 中的细胞数。
已知：1mL体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mL 体积应含有小方格数为 1000mm3/1/4000mm3=4×106 个小方格， 即系数 K=4×106
细胞成分含量法 如测定蛋白质、核酸、还原糖的含量等
第三节
分批培养中细菌群体的生长
一、分批培养的概念 采用完全封闭的容器，一次接种，静置培养，最后 一次性收获的过程。 特点：固定的营养物质
结果：细菌在一个容积有限的环 境中不可能无限制地高速生长。 分批培养中细菌的生长在短期内 表现明显的规律性--细菌的生长曲线
群体生长
个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖 由于微生物的个体极小，所以常用群体 生长来反映个体生长的状况。
细菌繁殖示意图
第一节
微生物纯培养的生长
一、获得微生物纯培养的方法 • 纯培养的概念：微生物学中把从一个细胞或