抗AGR2单克隆抗体的制备_鉴定及初步应用
3 章 抗体制备(免疫学)
四、佐 剂
佐剂（adjuvant）： ） 佐剂 同抗原一起或预先注射于机体， 同抗原一起或预先注射于机体，能够增强机 体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 佐剂：可有免疫原性，也可无免疫原性。 佐剂：可有免疫原性，也可无免疫原性。 颗粒性抗原是否用佐剂？ 颗粒性抗原是否用佐剂？
三、人工抗原的制备 人工抗原的制备
(一)人工结合抗原： 一 人工结合抗原 人工结合抗原： 指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原， 后具有免疫原性的半抗原 指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原， 例如多糖、多肽、甾体激素等。 例如多糖、多肽、甾体激素等。 用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。 用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。
(3)冻融法 (3)冻融法 原理：因突然冷冻， 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶 剂浓度的突然改变而破坏细胞。 剂浓度的突然改变而破坏细胞。 •方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结， 方法 融化，如此反复两次， 融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的 颗粒可被融破。 颗粒可被融破。
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（二）可溶性免疫原的提纯 可溶性免疫原的提纯 1．超速离心法 2．选择性沉淀法 利用各种蛋白质分子理化特性的差异， 利用各种蛋白质分子理化特性的差异， 采用不同的沉淀剂或改变某些条件、 采用不同的沉淀剂或改变某些条件、促使某 一蛋白质成分沉淀。 一蛋白质成分沉淀。
常用选择性沉淀法: 常用选择性沉淀法: 选择性沉淀法 1）盐析法 最常用的盐溶液是33%～50%饱和度的硫酸铵。 最常用的盐溶液是33%～50%饱和度的硫酸铵。 33% 饱和度的硫酸铵 简便易行， 纯度不高，只适用于初步纯化。 简便易行，但纯度不高，只适用于初步纯化。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是一种由单一克隆B细胞产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
它在生物医药领域有着广泛的应用，包括疾病诊断、治疗和生物学研究等方面。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。
一、制备原理。
单克隆抗体的制备原理主要包括以下几个步骤，抗原免疫、细胞融合、筛选和鉴定、扩增和保存。
首先，通过将目标抗原注射到实验动物体内，诱导其产生特异性抗体。
然后，从免疫动物体内获得B细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
接着，通过细胞培养和筛选，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
最后，对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
二、制备方法。
1. 抗原免疫。
选择合适的实验动物，根据抗原的特性和研究需要，选择合适的免疫方案，包括抗原的种类、免疫的途径和次数等。
2. 细胞融合。
将获得的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的筛选条件包括杂交瘤细胞的生长条件、培养基的成分和杂交瘤细胞的筛选方法等。
3. 筛选和鉴定。
通过特异性抗原的筛选和鉴定，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
鉴定的方法包括ELISA、免疫印迹、免疫荧光等。
4. 扩增和保存。
对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
扩增的方法包括体外培养、动物体内生长等。
三、实验注意事项。
在进行单克隆抗体的制备过程中，需要注意以下几个方面的实验注意事项，实验动物的选择和管理、抗原的制备和纯化、细胞融合和杂交瘤细胞的培养条件、单克隆抗体的鉴定和保存等。
四、应用前景。
单克隆抗体作为一种重要的生物医药制剂，在疾病诊断、治疗和生物学研究等方面具有广阔的应用前景。
随着生物技术的不断发展，单克隆抗体的制备技术也在不断完善，相信在未来会有更多的应用领域被开发出来。
综上所述，单克隆抗体的制备原理及方法是一个复杂而又具有挑战性的过程，需要研究人员在实验操作中严格把关，以确保所得的单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力。
单抗制备实验报告
一、实验背景单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，由单个B细胞克隆产生。
单抗在生物医学研究、疾病诊断、治疗药物研发等领域具有广泛的应用。
本实验旨在通过细胞融合技术制备小鼠单克隆抗体，并对其特异性、亲和力和效价进行鉴定。
二、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠，体重18-22g。
2. 试剂与耗材：淋巴细胞分离液、Ficoll、RPMI-1640培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、聚乙二醇（PEG）、小鼠抗小鼠IgG-FITC、兔抗小鼠IgG-HRP、ELISA 试剂盒、抗体稀释液、抗体亲和层析柱等。
3. 仪器：超净工作台、显微镜、酶标仪、离心机、冰箱、培养箱等。
三、实验方法1. 动物免疫（1）选择雌性小鼠，将其随机分为两组，每组10只。
（2）对实验组小鼠进行免疫，每次免疫剂量为1mg抗原，间隔2周进行第2次免疫。
（3）对照组小鼠仅给予生理盐水注射。
2. 细胞分离与培养（1）免疫后第3周，处死实验组小鼠，无菌操作取出脾脏。
（2）将脾脏剪碎，加入Ficoll分层液，进行细胞分离。
（3）收集单个核细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数。
（4）将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG进行细胞融合。
（5）将融合后的细胞进行培养，选择杂交瘤细胞。
3. 单抗制备（1）将杂交瘤细胞进行扩大培养，收集培养上清。
（2）用ELISA试剂盒检测培养上清中的抗体效价，筛选出高亲和力抗体。
（3）将高亲和力抗体进行亲和层析纯化。
4. 单抗鉴定（1）用小鼠抗小鼠IgG-FITC和兔抗小鼠IgG-HRP进行Western blot检测，鉴定单抗的特异性。
（2）用ELISA试剂盒检测单抗的效价。
（3）用抗体亲和层析柱对单抗进行亲和力测定。
四、实验结果1. 动物免疫实验组小鼠在免疫过程中未出现明显异常，免疫成功。
2. 细胞分离与培养成功分离出脾细胞和骨髓瘤细胞，细胞融合率为90%。
单克隆抗体的制备及其应用
单克隆抗体的制备及其应用单克隆抗体是一种能够识别特定抗原并结合于它的单一克隆抗体分子。
相对于传统的混合抗体，单克隆抗体具有更加精准的特异性和较高的亲和力，因此在现代医学中应用广泛，尤其在疾病的诊断、治疗和预防方面发挥着重要的作用。
制备单克隆抗体的过程可以分为四个主要步骤：免疫原的制备、小鼠的免疫、脾细胞的融合和单克隆抗体的筛选和鉴定。
免疫原制备免疫原是指能够引起免疫反应并且激发机体产生抗体的物质。
制备免疫原主要有两种方法：一是纯化目标分子，二是化学合成人工抗原。
纯化目标分子是指从生物体内提取目标蛋白质，包括人类血清、细胞培养上清液或从组织中分离的蛋白质，通过高效液相层析或离子交换层析等技术达到纯度要求。
化学合成人工抗原需要建立三级结构，并且通过光谱分析等技术进行鉴定。
小鼠的免疫制作单克隆抗体时，一般使用小鼠进行免疫。
将免疫原注射到小鼠体内，通过免疫系统的识别和选择，产生能够与目标分子特异性结合的抗体，这些抗体被称为多克隆抗体。
免疫时间和免疫剂量都是需要精细控制的参数，以确保得到的多克隆抗体可以覆盖免疫原的所有表位。
脾细胞的融合脾细胞是一个重要的免疫细胞，当它遇到免疫原时，会产生抗体。
将免疫小鼠的脾脏取出，制成单细胞悬液，然后与能够维持无限增殖的癌细胞融合。
融合细胞将产生能够继承小鼠脾细胞产生的抗体特异性和癌细胞的无限增殖能力的“嵌合抗体细胞”。
单克隆抗体的筛选和鉴定通过将“嵌合抗体细胞”进行单细胞分离和分层培养，筛选出特异性结合目标分子的单抗，并经过多重鉴定，包括酶联免疫吸附实验、亲和力检测试验、特异性试验、同工酶分析、生物学鉴定和单克隆抗体的特性鉴定等多项检测，确保得到的单克隆抗体具有较高的特异性、亲和力和稳定性。
单克隆抗体的应用单克隆抗体可应用于医学、生物技术及科学研究等领域，例如基因工程药物、免疫诊断、癌症治疗、疫苗研发、食品安全检验、环境检测和生物学研究等方面。
在基因工程药物开发中，单克隆抗体能够定位特定的蛋白质，从而研制出精确治疗某种疾病的药物，例如格拉西米布是一种单克隆抗体，用于治疗类风湿性关节炎和肠炎。
单克隆抗体的制备与应用
单克隆抗体的制备与应用单克隆抗体是一种高度特异性的生物分子，能够识别并结合特定的抗原，对于现代生命科学研究和临床医学诊治具有重要意义。
一、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：（1）选择合适的免疫原：免疫原应具有较好的生物学活性、易于纯化，并且可以诱导动物产生足够的免疫反应。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、DNA等。
（2）免疫动物：将免疫原注射到小鼠、大鼠、兔子等动物身上，诱导其产生免疫反应。
此过程需要严格控制免疫剂量及免疫间隔时间，以保证动物身体内产生充分的免疫反应。
（3）筛选克隆：从免疫动物获得脾细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，生成杂交瘤细胞。
将杂交瘤细胞进行分离、克隆和筛选，最终获得单克隆细胞系。
（4）制备单克隆抗体：将单克隆细胞系进行扩增，并通过细胞培养和大规模发酵获得充足的单克隆抗体产物。
二、单克隆抗体的应用（1）免疫诊断：通过单克隆抗体对特定分子的识别和结合能力，可以用于免疫诊断。
例如，通过检测患者体液中特定抗原的单克隆抗体结合情况，可以诊断疾病，并对病情进行判断。
（2）药物研发：单克隆抗体在药物研发中具有广泛的应用前景。
例如，在抗肿瘤药物的开发中，单克隆抗体可以针对肿瘤细胞特异性抗原，实现有选择性地杀伤肿瘤细胞。
（3）免疫治疗：单克隆抗体可以作为一种抗体治疗手段，对病原体或某些癌细胞进行特异性杀伤。
例如，在肿瘤治疗中，单克隆抗体能够选择性地结合癌细胞表面的受体，阻断其信号传递，从而抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
（4）生物学研究：单克隆抗体可以用于生物学研究中的诸多方面。
例如，通过单克隆抗体对特定蛋白的结构和功能进行研究，可以深入了解其生物学特性和作用机制。
三、单克隆抗体的前景与挑战单克隆抗体拥有广泛的应用前景，近年来，其在医学、生命科学研究领域得到了广泛的应用。
然而，单克隆抗体的研发仍面临着一些挑战。
（1）制备难度：单克隆抗体的制备要求高度的技术和设备支持，需要在动物免疫、细胞融合、细胞培养等环节中严格把控。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。
1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。
2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。
3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。
4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。
克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。
5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。
6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项制备步骤如下：1.免疫原选择：选择具有免疫原性的抗原作为单克隆抗体制备的靶点。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等。
2.动物模型选择：根据免疫原的性质选择适合的动物模型，如小鼠、兔子等。
应考虑动物模型对免疫原的免疫响应情况以及制备成功的单克隆抗体的应用价值。
3.免疫原注射：将免疫原注射到动物模型体内，通常通过多次注射来诱导免疫反应。
在注射前，可以选择适当的佐剂来增强免疫原的免疫原性，如完全弗氏佐剂或委氏佐剂。
4.混合细胞瘤的制备：在免疫原注射后，等待免疫反应充分发生。
细胞瘤可用于细胞融合，产生融合细胞并筛选单克隆抗体。
常用的细胞瘤包括SP2/0和NS-15.细胞融合：将免疫小鼠脾细胞和癌细胞融合成杂交瘤细胞。
融合的常见方法有聚乙二醇融合法和电融合法。
6.肿瘤细胞筛选：将融合细胞播种在含有选择剂的培养基上，通过选择剂来杀死未融合细胞和不产生抗体的融合细胞，留下产生单克隆抗体的细胞。
7.单克隆抗体筛选：对产生的单克隆细胞进行筛选，常用的方法有ELISA和细胞免疫荧光检测。
8.单克隆抗体培养：将筛选出的单克隆细胞进行扩增培养，获得大量的细胞。
9.单克隆抗体纯化：将培养得到的细胞培养上清进行蛋白A/G亲和层析柱纯化，获得纯化的单克隆抗体。
10. 单克隆抗体鉴定：通过Western blot、免疫组化或其它适当的方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。
注意事项如下：1.免疫原的选择应根据具体实验要求合理选择，确保其免疫原性和制备成功的单克隆抗体的应用价值。
2.在注射免疫原前，应充分考虑动物模型对所选择免疫原的免疫响应情况，并进行充分的预备实验和试验。
3.免疫小鼠注射免疫原时，需要严格控制免疫原注射的剂量和频率，以避免过度免疫导致不良反应。
4.细胞融合时，应根据实验要求选择合适的融合方法，并注意细胞融合的时间和条件，以获得高效的细胞融合率。
5.单克隆抗体筛选和鉴定时，应使用多种合适的方法进行综合评估，确保获得特异性和亲和力较高的单克隆抗体。
单抗制备流程2
单克隆抗体制备标准化操作方案第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。
好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。
小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。
但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。
上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。
常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。
（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。
为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后10天左右应从尾部取血，检查抗体滴度。
单抗和多抗的制备流程
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单克隆抗体多次筛选的原理
单克隆抗体多次筛选的原理单克隆抗体多次筛选的原理单克隆抗体是一种可以识别和结合到特定抗原的抗体分子。
在制备单克隆抗体的过程中，需要经过多次筛选，以确保获得高亲和力和高特异性的单克隆抗体。
下面将介绍单克隆抗体多次筛选的原理。
第一次筛选：免疫原与抗体结合在制备单克隆抗体的第一次筛选中，需要将免疫原与小鼠或兔子等动物的免疫系统接触，激发其产生抗体。
然后从动物体内收集血清，将其与免疫原结合，筛选出与免疫原结合能力较强的抗体。
第二次筛选：抗体与免疫原结合在第一次筛选后，需要将抗体与免疫原结合，筛选出与免疫原结合能力最强的抗体。
这一步通常采用ELISA等技术进行。
第三次筛选：亲和力筛选在第二次筛选后，需要对抗体进行亲和力筛选，以筛选出具有高亲和力的抗体。
亲和力是指抗体与抗原结合的强度，亲和力越高，结合越紧密，抗原的识别和结合能力就越强。
第四次筛选：特异性筛选在第三次筛选后，需要对抗体进行特异性筛选，以筛选出具有高特异性的抗体。
特异性是指抗体只能识别和结合到目标抗原，而不会与其他抗原结合。
通常采用Western blot等技术进行特异性筛选。
第五次筛选：克隆化在第四次筛选后，需要对抗体进行克隆化，以获得单克隆抗体。
克隆化是指将抗体分离成单个细胞，并培养成单个细胞克隆。
通过克隆化，可以获得具有相同特异性和亲和力的单克隆抗体。
总结单克隆抗体的制备需要经过多次筛选，以确保获得高亲和力和高特异性的单克隆抗体。
在筛选过程中，需要进行免疫原与抗体结合、抗体与免疫原结合、亲和力筛选、特异性筛选和克隆化等步骤。
通过多次筛选，可以获得高质量的单克隆抗体，用于科研和临床应用。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗，也被称为抗体药物，是一种能够识别和结合特定分子的抗体衍生物。
制备单抗的过程通常涉及从动物源中获得特异性抗体、制备抗原以及进行抗体组装和纯化等步骤。
下面是单抗制备的详细步骤：第一步：抗原选择与制备抗原是单抗开发的基础，因此抗原选择至关重要。
一般来说，抗原可以是多肽、蛋白质、细胞表面蛋白或其他重要的识别物质。
抗原的制备可以通过合成化学方法或从相关生物样本中提取制备。
第二步：免疫化学动物一旦获得了抗原，下一步是选择合适的实验动物，并进行免疫化学动物。
常见的实验动物包括小鼠、兔子、狗、大猩猩等。
免疫化学动物的目的是刺激动物的免疫系统产生特异性抗体。
第三步：抗体筛选与克隆在动物体内完成免疫程序后，需要收集动物的血浆或脾细胞等样本，进行抗体的筛选和克隆。
常用的抗体筛选方法包括ELISA、免疫磁球分离等。
选出具有高效结合抗原且具有特异性的单克隆抗体细胞，并将其单克隆化。
第四步：抗体生产与纯化一旦获得了单克隆抗体细胞，接下来就需要进行大规模的抗体生产。
最常用的方法是将单克隆抗体细胞悬浮于培养基中，并使用细胞培养技术进行大规模培养。
培养时间可以根据需要进行调整，通常需要数天至数周。
之后，可以通过离心、滤过等方法收集抗体，然后进行纯化。
第五步：抗体表征为了确保获得的单克隆抗体质量良好，需要进行抗体的表征。
常用的表征方法包括西方印迹分析、免疫组化等。
这些方法可以检验抗体在特定条件下的表达水平、特异性和亲和力等相关特性。
第六步：药物开发与临床研究一旦获得了具有良好特性的单克隆抗体，接下来就可以进行药物开发和临床研究。
在这个阶段，需要进行药物的安全性和疗效评估，以及大规模生产和制药工艺的优化。
单抗制备是一个复杂而严谨的过程，涉及到多个步骤和技术。
制备出高质量的单抗药物对于疾病治疗和生物医学研究具有重要意义。
随着技术的不断进步，单抗制备的效率和质量将不断提高，为医药领域带来更多机会和挑战。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。
单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1 单克隆抗体的优点与局限性：1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久〞地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量〞的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、本钱低和可大量生产等。
1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反响，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反响强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2 单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。
擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。
取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。
每次采血量0.1ml。
方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。
二抗制备工艺
二抗制备工艺二抗（Secondary Antibodies）是一种重要的实验工具，广泛应用于生物医学研究领域。
在进行免疫组化、免疫印迹等实验中，二抗能够与特定的原抗体结合，从而实现对目标抗原的检测。
本文将详细介绍二抗制备工艺的步骤和注意事项，帮助读者深入理解并正确使用该工具。
【一、准备工作】在进行二抗制备之前，需要先准备以下材料和设备：1. 目标抗体：根据实验需要选择特定的原抗体。
2. 动物血清：通常使用驱散动物血清，如马、兔、羊等。
3. 化学试剂和缓冲液：例如胍基氯化银、硫氰酸钠等。
4. 离心机和洗涤机：用于离心和洗涤操作。
5. 反应容器：如试管、洗涤瓶等。
【二、制备过程】1. 原抗体净化：a. 溶解固定化的原抗体：将原抗体加入适量的缓冲液中，并在室温下轻轻摇动至固体完全溶解。
b. 过滤溶液：使用0.22微米的滤膜对溶液进行过滤，以去除悬浮的杂质。
c. 净化原抗体：将过滤后的溶液加入离心管，并在4000转/分钟的条件下离心10分钟，将上清液收集。
2. 收集动物血清：a. 注射原抗体：将原抗体注射到动物体内，激发机体产生二抗。
b. 收集血清：待动物产生足够数量的二抗后，通过离心将血液中的红细胞和血小板分离，收集上清液。
3. 与目标抗体的结合和纯化：a. 制备胍基氯化银溶液：按照指定比例将胍基氯化银溶于缓冲液中，制备成工作液。
b. 胍基氯化银与血清反应：将收集到的动物血清与胍基氯化银工作液混合，在室温下孵育一定时间，以促使胍基氯化银与动物血清中的IgG反应结合。
c. 针对目标抗体的纯化：通过离心和洗涤的过程，分离出与目标抗体结合的二抗，并进行纯化处理。
4. 保存和储存：a. 筛选纯化后的二抗：使用酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术对纯化后的二抗进行筛选和检测。
b. 储存条件：将筛选合格的二抗存储在-20℃的低温条件下，以保持其稳定性和活性。
【三、注意事项】1. 原抗体的选择：根据实验需要，选择与目标抗体互补的原抗体。
抗-抗体的制备
抗-抗体的制备抗-抗体（Anti-idiotype Antibody）是一种与抗原特异性抗体结构相似的抗体，其特异性是指其抗原结合位点可以与目标抗体结合。
抗-抗体的制备是一项重要的生物学研究技术，可以用于研究免疫应答、抗体结构与功能以及疾病诊断与治疗等领域。
抗-抗体的制备通常需要经历以下几个步骤：1. 抗原选择：首先需要选择目标抗体作为抗原，这个目标抗体可以是任何具有特定结构和功能的抗体。
通常选择已知结构和特异性的抗体作为目标抗体，以便后续制备抗-抗体。
2. 克隆目标抗体：为了获得足够的目标抗体，需要将目标抗体进行克隆扩增。
这可以通过细胞融合技术或单克隆抗体制备技术来实现。
通过这一步骤，可以获得大量纯化的目标抗体。
3. 提取抗体：将克隆的目标抗体从细胞培养物或体液中提取出来。
这可以通过离心、过滤、沉淀等技术来实现。
提取的抗体需要经过纯化步骤，以获得高纯度的目标抗体。
4. 选择抗-抗体：在制备抗-抗体的过程中，需要选择适当的抗-抗体，这可以通过筛选和鉴定的方法来完成。
通常可以使用目标抗体与大量候选抗-抗体进行结合实验，选出与目标抗体结合最紧密的候选抗-抗体。
5. 抗-抗体制备：选定候选抗-抗体后，可以使用多种方法来制备抗-抗体。
其中一种常用的方法是通过免疫化学技术，将候选抗-抗体注射到动物体内，激发动物产生相应的抗-抗体。
这些抗-抗体可以通过血清或其他体液中提取出来，并经过纯化和鉴定，得到纯度较高的抗-抗体。
6. 抗-抗体应用：制备好的抗-抗体可以用于各种实验和应用中。
例如，可以用抗-抗体来研究目标抗体的结构和功能，以及免疫应答的调控机制。
此外，抗-抗体还可以用于疾病的诊断和治疗，例如针对某些肿瘤抗体的抗-抗体可以用于治疗肿瘤。
总结起来，抗-抗体的制备是一项复杂而重要的技术，它可以用于研究和应用的多个领域。
通过选择目标抗体、克隆和提取抗体、筛选和制备抗-抗体，我们可以获得具有特定结构和功能的抗-抗体，为进一步的研究和应用提供了有力的工具。
二抗制备工艺
二抗制备工艺1. 引言二抗（Secondary Antibody）是一种用于检测和分析特定抗原的抗体。
它们通过与目标抗体结合，形成一个稳定的复合物，从而实现对抗原的检测。
二抗制备工艺是生物医学领域中非常重要的一项技术，其制备过程需要严格控制，以确保二抗的质量和效能。
本文将详细介绍二抗制备工艺的各个环节，包括抗原的选择、免疫动物的免疫、抗体的纯化和标记等。
同时，还将讨论一些常见的问题和注意事项，以帮助读者更好地理解和应用二抗制备工艺。
2. 抗原的选择在二抗制备过程中，抗原的选择是非常重要的。
通常情况下，抗原应具备以下特点：•高纯度：抗原应经过充分纯化，以避免其他蛋白质的干扰。
•特异性：抗原应与目标抗体具有高度的特异性结合。
•免疫原性：抗原应能够激发免疫动物产生高效的抗体。
常见的抗原来源包括蛋白质、多肽和糖类等。
根据具体的研究目的和实验需求，选择合适的抗原非常重要。
3. 免疫动物的免疫免疫动物的免疫是二抗制备的关键步骤之一。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
免疫动物的选择应考虑以下因素：•免疫反应强度：不同种类的免疫动物对抗原的免疫反应强度有所差异，应根据实验需求选择合适的免疫动物。
•抗体产量：免疫动物应能够产生足够的抗体，以满足实验需求。
•动物福利：应遵循动物实验伦理原则，确保免疫动物的福利。
免疫动物的免疫过程一般包括以下步骤：1.抗原制备：将选择的抗原经过充分纯化和处理，以提高免疫效果。
2.免疫接种：将抗原与适当的佐剂混合，注射到免疫动物体内。
3.免疫增强：在一定时间间隔内，重复注射抗原，以增强免疫效果。
4.血清采集：在免疫周期结束后，采集免疫动物的血清，以获取抗体。
4. 抗体的纯化抗体的纯化是二抗制备过程中的重要环节。
通过纯化，可以去除血清中的其他成分，提高抗体的纯度和效能。
常用的抗体纯化方法包括亲和层析、凝胶过滤和离心浓缩等。
在抗体纯化过程中，需要注意以下事项：•选择合适的纯化方法：根据抗体的特性和实验需求，选择适合的纯化方法。
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treatmentofcertaincancers. [ Keywords] AGR2;mAb;cancerdiagnosis;therapeutic
antibody
[ 摘 要 ] 目的 :制备鼠抗 AGR2单克隆抗体 (mAb)并对其 特 性进行鉴定及其初步应 用研究 。 方 法 :以 AGR2-MBP融合蛋 白免疫 BALB/c小 鼠 , 采 用 杂 交瘤 技 术 制 备 鼠 抗 AGR2 的 mAb, 并用 Protein-G亲和层析法纯 化 mAb。 用间接 ELISA法 测定 mAb的效价 , 以 Westernblot鉴定 mAb的特 异性 。 用免 疫荧 光 、 免 疫 沉 淀 和 MTT法 对 mAb进 行 初 步 应 用 研 究 。 结果 :获得 1株 可持续 、 稳定分 泌抗 AGR2的 mAb的 杂交瘤 细胞 。 杂交瘤细 胞分 泌的 mAb的 Ig亚 类 (型 )为 IgG1(κ), 腹水 mAb的效 价达 1 ×10-6。 Westernblot检测 显示 , 在 Mr 为 20 000处有 1条清晰的带 。 免疫荧光显示 , 该 mAb可与乳 腺癌细胞中的 AGR2蛋白结合 。 免疫沉淀证实该 mAb可与天 然状态的 AGR2有效结合 。 MTT实验显示该 mAb对乳腺癌细 胞 MCF7的生长 有抑制 作用 。 结 论 :制备出 的鼠 抗 AGR2的 mAb效价高 、 特异性良 好 , 可抑制 细胞 的生长 , 有 一定 的应 用价值 , 为 进一步研 究 AGR2的功 能及其 在乳腺 癌 、 前 列腺 癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工 具 。 [ 关键词 ] AGR2;单克隆抗体 ;肿瘤诊断 ;治疗性抗体 [ 中图分类 号 ] Q813.2 [ 文献标识码 ] B
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ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志 (ChinJCellMolImmunol)2010, 26(1)
的 mAb, 并进 行 了特 性 鉴 定及 初 步 应用 研 究 , 为 AGR2的纯化 , AGR2检测试剂盒的研制 , 后续制备 mAb亲和层析柱 , 以及乳腺癌 , 前列腺癌等诊断 和 治疗的研究提供了重要的制剂 。
AGR2是原发性和继发性肿瘤的标识蛋白 , 并且 是循环系统检出肿瘤细胞的标 识蛋白 。 AGR2 基因 定位于 7p21.3[ 1] 。 AGR2在乳腺癌细胞系中与雌激 素受体共表达 , 与雌激素敏感性乳腺 癌的分化表型 及预后负相关 , 可作为激素敏感的乳 腺癌的诊断和 治疗的靶标 [ 2, 3] 。 AGR2在前列腺癌中为雄激素诱导 分泌蛋白 (时间和剂量依赖性 ), 并在前列腺癌中高 表达 , 可作为前列腺癌诊断和治疗的靶标 。 AGR2的 表达量与患者的生存率成反比 , 可作 为前列腺癌患 者的预后 指标 [ 4, 5] 。 AGR2 在非小 细胞肺 癌中高 表 达 , 可用于非小细胞肺癌的诊断 , 并且与预后有 关 [ 6] 。为此 , 我们应用杂交瘤技术 , 制备了抗 AGR2
[ Abstract] AIM:To preparemouse monoclonalanti-
bodies(mAb)againstAGR2 (humanhomologofxenopus anteriorgradient2), tocharacterizetheseantibodies' properties, andtodeveloppotentialapplications.METHODS: BALB/cmice wereimmunizedwith AGR2-MBP (maltose bindingprotein)fusionprotein.ThemAbwaspreparedby hybridomatechniqueandpurifiedbyproteinG affinitychromatography.ThetiterandspecificityofthemAbwasdeterminedbyELISA andWesternblotrespectively.The mAb wasthenfurthercharacterizedbyimmunoprecipitation, immunofluorescentstaining and tumorcellinhibition assay. RESULTS:Onecloneofhybridoma, 18A4, secretingspecificmAbagainstAGR2, wasobtained.TheIgsubclassof themAbwasIgG1 (κ).ThetiterofthemAbwas1 ×10-6 . Westernblotanalysisshowedspecificbindingof18A4 with bothrecombinantandnativeAGR2 incellextract.Immunofluorescentstainingusing 18A4 mAbdemonstratedspecific stainingofAGR2 inthecytoplasmaofBreastcancercellline MCF7.ImmunoprecipitationassayconfirmedthatthismAb couldspecificallybindandeffectivelyprecipitatethe native AGR2.mAb 18A4 could also inhibitthe growthofbreast cancercellMCF7. CONCLUSION: The mAb anti-AGR2 withhightiterandspecificityhasbeenobtained.ThismAb, 18A4, canbeusedinmostmolecularbiologystudiesincludingWesternblot, immunostaining, immunoprecipitation.It alsoinhibitedthegrowthofcancercellsandthereforeisa potentialtherapeuticstartingpoint.Itisausefultoolforthe functionalstudyofAGR2 andforthediagnosisandpotential
DO I :10.13423/j .cnki .cjcmi .005339
ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志 (ChinJCellMolImmunol)2010, 26(1)
49
·论著 ·
文章编号 :1007 -8738(2010)01 -0049 -04
抗 AGR2单克隆抗体的制备 、 鉴定及初步应用
WUZheng-hua1, ZHU Qi1, GAO Guang-wei1 , ZHOU Chen-cheng2 , LIDa-wei1＊
1SchoolofPharmacy, 2SchoolofMedicine, ShanghaiJiaotongUniversity, Shanghai200240, China
收稿日期 :2009 -05 -19; 接受日期 :2009 -06 -18 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30771211) 作者简介 :武正华 (1981 -), 女 , 山西文水人 , 研究实习员 , 硕士
Tel:021-34204744;E-mail:wuzhenghua@ ＊Correspondingauthor, E-mail:daweili@
武正华 1 , 朱 奇 1 , 杲光伟 1 , 周辰晟 2 , 李大伟240;2医学院 , 上海 200025)
Preparation, characterizationand potentialapplication ofmonoclonalantibody18A4 againstAGR2
1 材料和方法
1.1 材料 6周龄雌性 BALB/c小 鼠 , 由 上海交 通大学 药学 院动物中心 提供 。 AGR2-MBP融 合蛋白 由 DFCI(Dana-Farber CancerInstitute, USA)提供 。 小鼠骨 髓瘤细 胞系 Sp2/0、 乳腺 癌细胞系 MCF7及 MB-231为本室保存 。 福氏佐剂及 3, 3, 5, 5-四甲基联 苯胺 (TMB)、 MTT(四 甲基 偶氮 唑盐 )、 DMSO均 购自 Sigma公司 。 即用型 SABC免疫组化 染色试 剂盒购 自武 汉博士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 。 HRP-山 羊 抗 小 鼠 IgG购 自 JacksonImmunoResearch公 司 。 RPMI1640 培 养 基 购 自 Gibco 公司 。 PEG4000购自北京夏斯生物公司 。 Ig亚类 鉴定试 剂盒 购自 HyCultbiotechnologybv公 司 。 ProteinG Plus购 自 santa cruz公司 。 硝酸纤维素膜购自 BIO-RAD公司 。 加强化 学发光 试剂盒 (ECLPlus)购自 AmershamBiosciences公司 。 其他试剂 均为国产分析纯 。 酶标仪 (MK3型 )为 Thermo公司产品 。 1.2 方法 1.2.1 抗 AGR2的 mAb的制备 采用石 晓娟等 [ 7] 报道 的方 法 (略有改进 )进 行免 疫 。 取 100 μgAGR2-MBP融合 蛋白 加 的去离子水至 500 μL与等量的完全 福氏佐剂充分乳化后 , 于 BALB/c小鼠 (2只 )的背部注 射两点 , 每 点约 50 μL, 剩 余的 腹腔注射 。 3周后加强 免疫 , 剂量同前 , 用不完全福氏佐剂充 分乳化后 , 注射于 小鼠腹腔 。 以后隔 2 周加强 免疫 1 次 。 从 第 3次加强免疫起 , 每次免疫后 7 d, 经尾静脉采血测 定抗血 清的效价 。 共加强免疫 4次后 , 选择抗血 清效价较高的小鼠 , 在进行细胞融合前 3 d, 用不加佐剂的 AGR2-MBP融合蛋白腹 腔注射冲击免疫 1次 。 细胞融合 、 亚克隆及腹水的制备均按实 验室常规方法进行 。 mAb腹水 的纯化采用 Protein-G免疫亲和 层析法 [ 8] , 用 AmershamAKTA-primemAb纯化系统进行。 1.2.2 质粒构建及转染 根据 NCBI中 提供的 AGR2碱基序 列 , 结合 primer5.0软件 (加拿大 Premier公司 )设计引物 , 其 上游引物设计 XbaⅠ 酶 切位 点 , 下游 引物 设计 XhoⅠ 酶切 位 点 , 片段全长 528个碱基 (57 ～ 585 氨基酸 ), 以 MCF7 乳腺 癌细胞系 cDNA为 模板 进行 PCR反 应 。 回 收扩 增 的 目的 片 段 , 然后 与 经 XbaⅠ 和 XhoⅠ 双 酶切 后 pcDNA3 载体 进行 连 接 , 转染 MB-231, 293T细胞 , 未 连接的 pcDNA3载体做 阴性 对照 。 转染步骤如下 :将生长状态良 好的 MB-231, 293T细胞 铺至 6孔板 , 贴壁后 PBS洗涤 2次 , 加入转染 液 (每孔 :50 μL DMEM基础培养基 、 2 μgDNA、 15 μgPEI, 混匀 , RT, 8 min, 然后加 入 450 μLDMEM 抗养 基 其 中 含 10 mL/LFBS无 双 抗 )。 培养 2 h, PBS洗涤 3 次 , 换 DMEM完全 培养 基 , 培养 过夜 。 第 2天 , 换新的完全培养基 。 24 ～ 48 h后 , 提取蛋 白 , 验证 mAb的特异性 。 1.2.3 细胞蛋白提取 MCF7、 MDA-MB-231、 293T细胞长至 90%, 置于 冰 上 , PBS(磷 酸 盐 缓 冲 液 )洗 涤 2 次 , 然 后 加 10 mLPBS, 将细胞刮 下 , 180 g, 4℃, 离 心 5 min, 弃 上 清 。