红车轴草总黄酮体外清除自由基作用的研究

红车轴草 ( T rifolium pra tense L. )为豆科多年生 草本植物 ,是我国长江流域以南地区优良的豆科牧 草 ,目前国内很多地区已引种栽培 。红车轴草主要 含有黄酮类 、蛋白质 、氨基酸 、糖类和维生素等多种 成分 ,其中 16种黄酮类物质已被检测出 ,总含量占 干重的 2%。黄酮类物质包括异黄酮 、黄酮醇 、黄酮 类 ,其中以异黄酮为多 。红车轴草含有鹰嘴豆芽素 A (B iochanin A ) 、芒柄花素 ( Formonetin) 、染料木 素 ( Genistein)和大豆素 (Daidzein)等 4种异黄酮 ,它 们在植物中主要以苷形式存在 [ 1 ] 。异黄酮因具有 弱的雌激素样作用 ,且能促进动物生长 ,抑制癌细胞 生长 ,改善动脉血 管柔 软性 而格 外受 人关 注 [ 2, 3 ] 。 近年来 ,随着对自由基研究的深入 ,人体中的活性氧
摘 要 :通过 Fenton反应产生 ·OH ,邻苯三酚自氧化产生 O2· - 模型 ,研究了红车轴草总黄酮体外清除自由基的 作用 。结果显示红车轴草总黄酮在 6. 25～200 mg /mL范围内具有清除 Fenton反应产生 ·OH的作用 ,在 6. 25～
100 mg /mL浓度范围内对邻苯三酚自氧化产生的 O2· - 具有清除作用 ,二者均呈明显的量效关系 ,对 ·OH 和 O2· - 半数清除浓度分别为 44. 06 和 54. 57 mg/mL。 关键词 :红车轴草总黄酮 ;羟自由基 ;超氧阴离子自由基 ;抗氧化
准确称取红车轴草粉 50 g,加入适量石油醚浸 泡 24 h。然后超声 /微波萃取三次 ,每次 30 m in。每 次更换石油醚 ,脱至石油醚无色 。 2. 1. 2 超声 2微波萃取
用 80%乙醇浸泡脱脂脱色的红车轴草粉 12 h, 超声 /微波协同萃取 2 h,条件 : 温度 65 ℃,微波自 动 。提取三次 ,合并滤液 ,离心去杂 ,过滤 。最后配 成 200 mg /mL 醇提液 (生药量计算 )待用 。 2. 2 羟自由基 ( ·OH )清除的测定方法 [ 7, 8 ]
该产物在 510 nm 处有强吸收 ,若加入羟自由基 清除剂 ,便会与水杨酸竞争 ,从而使有色产物的生成 量减少 ,采用固定反应时间法 ,在 510 nm 处测量含 被测物反应的吸光度 ,并与空白对照比较 ,便能确定 提取液对其的清除作用 ,清除率计算公式为 :
清除率 ( % )
A对照 =
-
(A样品
收稿日期 : 2008201221 接受日期 : 2008202227 基金项目 :甘肃省科技支撑计划 2社会发展计划 ( 0804NKCA110 )
“甘肃省地产中药材及其提取物在畜禽生产中的研究 ” 项目 ;河北省科技厅科学技术研究与发展指导计划项目 ( 07225529) 3 通讯作者 E2mail: weiym @ gsau. edu. cn
结果 ,并进行方差分析及回归分析 。
3 结果
3. 1 红车轴草总黄酮液对 ·OH 的清除作用 实验结果见表 1 和图 1。从表 1 可以看出 ,除
6125 mg/mL 浓度外 ,其余各浓度均有很好的清除 ·OH效果 ( P < 0. 01) ;各组间比较 ,除 6. 25与 12. 5
46
天然产物研究与开发 Vol121
H2 O2 与 Fe2 + 混合后产生的 ·OH 的 Fenton 反 应中 , ·OH 具有很高的反应活性 ,存活时间短 ,但 在反应体系中加入水杨酸 ,能有效地捕捉 ·OH 并 产生紫红色产物 ,反应原理如下 :
H2 O2 + Fe2 + ϖ ·OH +OH - + Fe3 + ϖ OH + + H2 O
和自由基被认为是引发衰老 、癌变和细胞损伤的重 要原因 。筛选新的能够清除自由基的抗氧化天然药 物成为研究热点 ,因此 ,对异黄酮抗氧化作用的研究 逐渐引起广大学者的重视 ,认为黄酮类物质是因为 具有酚羟基 [ 4 ] ,能够与自由基结合而发挥抗氧化作 用 。红车轴草总黄酮也具有抗氧化作用 [ 5 ] ,但清除 自由基的能力如何 ,需要进一步探讨 。为此 ,本研究 采用 Fenton反应产生羟自由基模型测定红车轴草 总黄酮清除羟自由基作用 ,采用邻苯三酚自氧化产 生超氧阴离子自由基模型 ,观察对超氧阴离子的抑 制能力 ,以期探讨红车轴草总黄酮体外清除自由基 的作用 ,为红车轴草总黄酮药物开发和在畜牧业生 产中的应用提供依据 。
= 18. 699 + 0. 395X ,回归方程有极显著的统计学意 由基具有一定的清除作用 ,且呈较好的量效关系。
表 1 红车轴草总黄酮对羟自由基 ( ·OH )的清除作用 ( x ±s, n = 3) Table 1 Scavenging effect of red clover total flavonoids on ·OH ( x ±s, n = 3)
Abstract: Hydroxyl free radical ( ·OH ) and superoxide anion free radical (O2· - ) scavenging effects of the total fla2 vonoids from red clover were studied. The results showed that the red clover total flavonoids (6. 252200 mg /mL ) in vitro had scavenging activity on hydroxyl radical and superoxide radical by the autoxidation of pyrogallol p roduction at the concentration of 6. 252100 mg/mL w ith dose dependent mode. IC50 of scavenge hydroxyl radical and superoxide radical are 44. 06 and 54. 57 mg/mL , respectively. Key words: red clover total flavonoids; ·OH; O2· - ; antioxidation
无水 乙 醇 、石 油 醚 、FeSO4 · 7H2 O、水 扬 酸 、 H2 O2 、邻苯三酚 、磷酸氢二钠 、磷酸二氢钠 、盐酸等 均为国产分析纯 ;三 (羟甲基 )氨基甲烷 ( Tris)为进 口上海分装 ;供试红车轴草购自甘肃省畜牧总站 。
2 实验方法
2. 1 红车轴草总黄酮的提取 [6 ] 2. 1. 1 脱脂脱色
天然产物研究与开发 N a t P rod R es D ev 2009, 21: 44247
文章编号 : 100126880 (2009) 0120044204
红车轴草总黄酮体外清 除自由基作用的研究
刘宝剑 1, 2 ,郭延生 1 ,刁鹏飞 1 ,魏彦明 13 ,余联平 3
1甘肃农业大学动物医学院 ,兰州 730070; 2河北北方学院教务处 ,张家口 075000; 3甘肃省草原推广站 ,兰州 730050
- A样底 )
×100
A对照
式中 , A样品为加入红车轴草总黄酮后的羟自由
基体系的吸光度值 ; A对照 为不加异黄酮时羟自由基
体系的吸光度值 , A样底 为羟自由基反应体系中不加
H2 O2 而加异黄酮的吸光度值 。 具体方法 :实验分组为对照组和加入不同浓度
药液的加药组及样底组 ,药液浓度的设定均是在预
第一步反应迅速 ,而第二步则是一个相对慢的衰减
过程 ,其线性时间为 5 m in。具体测定方法是 ,实验
分组为对照组 、样品组 ,药液浓度设定通过预实验后
确定 。在 10 mL 比色管中加入 50 mmol/L Tris2HC l
缓冲液 (pH = 8. 20,含有 1 mmol/L DTPA ) 4. 5 mL ,
mg /mL 间差异显著外 ( P < 0. 05) ,其它各组间均差 义 ( P < 0. 01) , r = 0. 918, r2 = 0. 843,计算其半数清 异极显著 ( P < 0. 01 ) 。同样从图 1 看出 ,红车轴草 除浓度为 44. 06 mg /mL。统计学结果表明药物浓度 总黄酮对羟自由基的清除作用随着浓度的提高 ,清 与清除率间具有较好的线性相关 ,且呈正相关 ,说明红 除作用增大 。经直线回归分析得直线回归方程 : Y 车轴草总黄酮在 6. 25～200 mg/mL浓度范围内对羟自
实验的基础上确定 。在 10 mL 试管中依次加入 6 mmol/L 的硫酸亚铁 1 mL , 6 mmol/L 水杨酸 2乙醇 1 mL 后 ,把不同浓度的红车轴草总黄酮液 (以下称样 液 ) 1 mL 分别加入试管中 ,然后加入 0. 1%的过氧 化氢 1 mL ,总体积 5 mL ,以双蒸水补足体积 。其中 对照管不加样液 ,样底管不加 H2O2 ,摇匀后在 37 ℃ 水中温育 30 m in,测 510 nm 处的吸光度值 。平行测 定 3次 ,取平均值 。 2. 3 对超氧阴离子 (O2· - )清除率的测定 [9 ]
1D epa rtm en t of V eterina ry M ed icine of Gansu A g ricu ltu ra l U n iversity, L anzhou 730070, Ch ina; 2A cadem ic A ffa irs O ffice of Hebei N orth U n iversity, Zhang jiakou 075000, Ch ina; 3 Grassland Popu la rize S ta tion of Gansu, L anzhou 730050, Ch ina
中图分类号 : R285. 5; Q946. 91