pVL1392-XyIE昆虫表达载体说明
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
pCoBlast昆虫表达载体说明
pCoBlast编号 载体名称北京华越洋生物KCVECT105 pCoBlastpCoBlast载体基本信息载体名称: pCoBlast质粒类型: 昆虫表达载体；筛选载体克隆方法: --启动子: copia载体大小: 3907 bp5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: 无载体抗性: 氨苄青霉素真核筛选标记: Blasticidin克隆菌株: TOP10；DH5-T1R宿主细胞（系）: 果蝇细胞系S2备注: pCoBlast载体与昆虫表达载体共转染，建立稳表达细胞系。
瞬表达/稳表达: --组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pCoBlast载体质粒图谱和多克隆位点信息pCoBlast载体简介pCoBlast is a 3907 bp selection vector that can be cotransfected with the expression vector of choice to to create stable cell lines in Drosophila. It contains the Streptomyces griseochromogenes bsd gene under control of the Drosophila copia promoter to confer resistance to blasticidin in S2 cells.引用及参考文献A novel allelic variant of the human TSG-6 gene encoding an amino acid difference in the CUB module. Chromosomal localization, frequency analysis, modeling, and expression.Nentwich Hilke A; Mustafa Zehra; Rugg Marilyn S; Marsden Brian D; Cordell Martin R; Mahoney David J; Jenkins Suzanne C; Dowling Barbara; Fries Erik; Milner Caroline M; Loughlin John; Day Anthony J;J Biol Chem (2002) 277:15354-15416Product usage: The full-length coding sequence of human TSG-6 (A431 allele encoding Gln at amino acid 144), including the signal sequence and stop codon,was excised from the pAcCL29-1 vector by digestion with KpnI/XbaI and cloned into the corresponding sites in the Drosophila Expression SystempCoBlast载体序列TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCT GTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGG CTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGAT GCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATC GGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTA ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG ACTCTAGAGGATCCGGTGCGTGGTGGTTTCATGCTTCTGGGAACGGCAAATGGGTTTAGGATTGGGAACC CCTCATCATCTGTTGGAATATACTATTCAACCTACAAAAATAACGTTAAACAACACTACTTTATATTTGA TATGAATGGCCACACCTTTTATGCCATAAAACATATTGTAAGAGAATACCACTCTTTTTATTCCTTCTTT CCTTCTTGTACGTTTTTTGCTGTGAGTAGGTCGTGGTGCTGGTGTTGCAGTTGAAATAACTTAAAATATA AATCATAAAACTCAAACATAAACTTGACTATTTATTTATTTATTAAGAAAGGAAATATAAATTATAAATT ACAACAGGTTCCCTTTATGCGAAGGGATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAG AGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGC GACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGCGCAGAACTCGTGGTGC TGGGCACTGCTGCTGCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGGGG CATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGCCGACAGGTTCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCCATAGTG AAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGG GCTAACCCTTATACGCAAGGGAGTAGATGCCGACCGAACAAGAGCTGATTTCGAGAACGCCTCAGCCAGC AACTCGCGCGAGCCTAGCAAGGCAAATGCGAGAGAACGGCCTTACGCTTGGTGGCACAGTTCTCGTCCAC AGTTCGCTAAGCTCGCTCGGCTGGGTCGCGGGAGGGCCGGTCGCAGTGATTCAGGCCCTTCTGGATTGTG TTGGTCCCCAGGGCACGATTGTCATGCCCACGCACTCGGGTGATCTGACTGATCCCGCAGATTGGAGATC GCCGCCCGTGCCTGCCGATTGGGTGCAGATCAGCCTCGAGGCCAGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGC TTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCT AGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTA ATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAA GCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCC CGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGT TTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAG CGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTC CGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATA CCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTAT CCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTAC ACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCT CTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAA GTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACG ATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAG ATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTC CATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTT GTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCC AACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGAT CGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACT GTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTA TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAA AGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGT TCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAG CAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACT CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGT ATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAApCoBlast其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His BpMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67ApAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。
昆虫杆状病毒表达载体系统的应用与展望
昆虫杆状病毒表达载体系统的应用与展望作者：宋姗姗来源：《中国科技纵横》2017年第22期摘要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有生物安全性高、能容纳较大外源基因片段并实现多基因共表达、有完备的翻译后加工修饰系统等特点，因而得到广泛的应用。
近年来，随着重组杆状病毒构建技术、昆虫细胞培养技术的不断发展和改进，加大了昆虫杆状病毒表达载体系统在疫苗制备、治疗性抗体、药物研发和基因治疗中的应用力度。
本文综述了杆状病毒表达载体的研究现状和应用范围，讨论了目前杆状病毒表达载体重组蛋白易降解的问题。
随着科技的进步，对杆状病毒载体的研究与优化会更加深入，昆虫杆状病毒表达载体系统的应用研究尤为重要。
关键词：杆状病毒；疫苗；治疗性抗体；基因治疗中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）22-0209-01昆虫杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是当今基因工程四大表达系统之一，具有生物安全性高、能容纳较大外源基因片段、可实现多基因共表达、具有完备的翻译后加工修饰系统、无内毒素污染等优点[1-3]。
同时，由于宿主细胞系的建立和优化、细胞培养基成分的不断改进，使得细胞生存率达到95%，基本可实现大规模培养[1]。
因此，昆虫杆状病毒表达系统越来越广泛的应用于疫苗制备、药物研发、农林牧渔等领域。
1 昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展Kitts等在1990年提出了线性技术，并设计了重组-救活方法，提高了杆状病毒基因组同源重组能力，将其设计的BacPAK6的重组效率提到80%以上，有较强的应用价值[4]。
但由于DNA酶切消化效率影响，重组病毒的获得仍需通过噬斑纯化过程。
Bac-to-Bac技术的出现避免了噬斑纯化步骤，缩短了重组杆状病毒的周期，同时，此方法在大肠杆菌中进行，非常便捷，不需要空斑纯化，较为节省时间。
但由于鳞翅目昆虫细胞系缺乏功能性糖基转移酶和唾液酸生物合成与利用途径，其产生的糖基化修饰缺乏末端唾液酸化，影响糖蛋白的整体性质，因此研究人员设计出转基因昆虫细胞系，使昆虫细胞对重组蛋白的糖基化修饰更加接近哺乳动物细胞，更利于昆虫杆状病毒表达载体系统的研究。
pAc5.1a昆虫表达载体说明
pAc5.1a编号 载体名称北京华越洋生物KCVECT126 pAc5.1apAc5.1a载体基本信息载体名称: pAc5.1a质粒类型: 昆虫细胞表达载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: --5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: --载体抗性: --筛选标记: --备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: --pAc5.1a其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67ApAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。
pFastBacI-Gus昆虫表达载体说明
pFastBacI-Gus编号 载体名称北京华越洋生物KCVECT127 pFastBacI-‐GuspFastBacI-‐Gus载体基本信息载体名称: pFastBacI-Gus质粒类型: 昆虫细胞表达载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 6661bp5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: --载体抗性: Ampicillin筛选标记: Gentamicin备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: 杆状病毒pFastBacI-‐Gus载体质粒图谱和多克隆位点信息pFastBacI-‐Gus载体简介pFastBac1-‐Gus is a 6661 bp control vector containing the Arabidopsis thaliana gene for β-‐glucuronidase (Gus) (Kertbundit et al., 1991), and was generated by restriction cloning of t he G us g ene i nto p FastBac1. T he m olecular w eight o fβ-‐glucuronidase i s 68.5 k Da.pFastBacI-‐Gus其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67ApAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。
载体的种类6
一 质粒（plasmid）载体
（一）质粒（plasmid）概述
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股 DNA（部分质粒为RNA）。 ,存在于细胞质中，质粒编码 非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、 毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可 丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建 的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切 位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。
质粒电泳图
2 大肠杆菌质粒的类型
F因子F进因供编子体码编菌在码向在细受细菌体菌菌表表传面面递产产色生生体性性D菌N菌A毛或毛。质。F粒因F。子因F的子因特的子性决特为定性可编以为码促可 以促的进性供菌体毛菌可在向供受体体与菌受传体菌递间色形体成D交N通A通或连质接粒结。构，F因从子而 决 定编可码使的两性个菌杂交毛细可菌在间供形体成胞与浆受内体连菌接间桥。形成交通连接结构，
（3）λ噬菌体的衍生物 λ噬菌体:λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子， 它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在 细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内 λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子 代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体 培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的 噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十菌体 裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体 DNA来开展进一步的工作。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点:pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40or igin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP 的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。
《昆虫杆状病毒载体》课件
成本。
02
CATALOGUE
昆虫杆状病毒载体的构建与改造
杆状病毒基因组的组成与结构
杆状病毒基因组由一个环状双 链DNA分子组成，大小通常在
80-180kb之间。
基因组染所需的蛋白。
杆状病毒基因组结构复杂，具 有多个转录单位和调节序列。
杆状病毒基因的克隆与表达
局限性
杆状病毒载体也存在一些局限性，例如可能会引起宿主免疫反应、潜在的基因突变和重组风险等。此外，杆状病 毒载体的制备和纯化过程较为复杂，成本较高，限制了其在临床上的广泛应用。
杆状病毒载体在基因治疗中的临床试验与案例分析
临床试验
目前，杆状病毒载体已经在多种疾病的治疗中进行了临床试验，包括遗传性疾病、肿瘤 和病毒感染等。其中，一些试验已经取得了较好的治疗效果，但仍需要进一步的研究和
特性
具有宿主范围窄、对宿主细胞毒 性低、易于操作等优点，是研究 昆虫生理和疾病控制的重要工具 。
昆虫杆状病毒载体的应用领域
01
02
03
基因表达
利用昆虫杆状病毒载体将 外源基因导入昆虫细胞， 实现目的基因的高效表达 。
基因治疗
通过昆虫杆状病毒载体将 正常基因导入病变昆虫， 纠正基因缺陷，达到治疗 目的。
验证。
案例分析
以遗传性疾病为例，杆状病毒载体被用于治疗囊性纤维化、血友病和镰状细胞贫血等疾 病。通过将正常基因导入患者细胞，可以改善患者的症状和生活质量。此外，在肿瘤治
疗方面，杆状病毒载体也被用于抑制肿瘤生长和扩散，以及提高肿瘤免疫治疗效果。
04
CATALOGUE
昆虫杆状病毒载体在疫苗研发中的应用
安全性评价标准
评价杆状病毒载体的安全性，需 要制定相应的标准，如病毒的毒 力等级、免疫反应程度等，以确 保使用安全。
昆虫杆状病毒细胞表达系统 课件
5) Capacity to express unspliced genes
Insect cells have the capability to perform intron/exon splicing. However, certain virus-, tissue- or species-specific splicing patterns will not be obtained if they require the presence of particular splicing factors which are not available in the infected insect cell environment. In general, for high protein expression levels, a cDNA insert rather than a genomic DNA fragment is recommended.
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)ppt课件
；.
17
疫苗 免疫 动物 后免 疫效 力评 价
体液免疫检测
ELISA抗体 中和抗体
细胞免疫检测
细胞因子mRNA水平检测—qPCR 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA 淋巴增殖实验—MTT法
；.
18
ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液的PH大 于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。
（2）置37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µg RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
Primer-Forward（IFN-γ/IL-4/β-actin） 1 µl（10 µM）
Primer-Reverse（IFN-γ/IL-4/β-actin） 1 µl（10 µM）
Preservation： 90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
；.
8
重组pFastBac质粒的构建
选择合适的载体
；.
9
重组Bacmid的产生
；.
10
重组Bacmid的鉴定
Bacmid DNA ≥135kb
PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer
2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix
12.5 µl
cDNA
1 µlBiblioteka ROX H2O0.05 µl
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pVL1392-XyIE
编号 载体名称
北京华越洋生物KCVECT140 pVL1392-‐XyIE
pVL1392-XyIE载体基本信息
载体名称: pVL1392-XyIE control vector
质粒类型: 昆虫细胞表达载体
高拷贝/低拷贝: --
启动子: --
克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶
载体大小: --
5' 测序引物及序列: --
3' 测序引物及序列: --
载体标签: --
载体抗性: 氨苄青霉素(Ampicillin)
筛选标记: --
备注: --
稳定性: --
组成型: --
病毒/非病毒: --
pVL1392-XyIE载体简介
The pVL1392-‐XylE control vector is a purified baculovirus transfer DNA for control transfection experiments. This plasmid contains the Pseudomonas putrida gene xylE. Co-‐transfection of pVL1392-‐XylE with baculovirus DNA such as Saphire™ DNA will generate recombinant baculoviruses that express the functional 40 kDa XylE protein. Infected i nsect c ells p roducing X ylE w ill t urn b right y ellow w ithin 1 m inute i n p resence o f XylE S taining S olution.
其他昆虫表达载体：
pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1
pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-His
pIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67A
pAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。