细胞工程原理

细胞工程原理
细胞工程原理
一、名词解释
1、生物工程：是以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。

2、细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。

3、细胞全能性：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。

4、细胞多能性：有些细胞能分化出多种组织的潜能，却失去了发育成完整个体的潜能。

5、植物组织培养：是指在无菌的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤、潜伏等，或者生长成新的完整植株的一种实验技术。

6、愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之为愈伤组织。

7、继代培养：是愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于培养基枯竭、水分散失、并已积累了一些代谢产物，此时将组织继续转入新的培养基上培养。

8、胚状体：在培养过程中由外植体或愈伤组织产生的与正常受精卵发育的方式或类似的胚胎结构现象。

9、脱分化：已分化的细胞在一定因素作用下重新恢复分裂机能并改变原来的发展方向而沿着一条新的途径发育的过程。

10、再分化：脱分化的细胞团或组织经重新分化而变为具有未分化细胞特性的过程。

11、人工种子：又称合成种子或体细胞种子，是指将植物离体培
养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中的类似种子的颗粒。

12、看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。

13、饲养层培养：是把处理过的（如X射线处理）无活性的或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长的方法。

14、固定化培养：将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一种技术。

15、两相培养技术：是在培养体系中加入有机溶剂或者具有吸附作用的多聚化合物。

细胞在水相中生长，合成次级代谢物质，分泌出来后转移至有机相中。

16、微细胞：又称为微核体，是指含有一条或n条染色体（即含有部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。

17、胚胎干细胞：是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞。

18、细胞融合：两个或多个相同或不同细胞通过物理、化学、生物的方法使膜融合形成单个细胞的过程。

二、填空题
1、生物工程的六大组成：发酵工程、酶工程、蛋白质工程、基因工程、生物化学工程、细胞工程。

2、基因工程（DNA重组技术）的一般步骤：（1）目的基因的获得，（2）将目的
基因与质粒重组，（3）将重组DNA引入到宿主细胞，（4）筛选能表达的目的基因。

3、植物组织培养再生植株的途径：
器官发生途径：（1）先发芽后生根，（2）先生根后发芽，（3）同时生根发芽
体细胞胚发生途径：（1）直接途径，（2）间接途径。

4、植物培养基的成分：
（1）水分
（2）无机盐（大量元素、微量元素、Fe盐）
（3）有机物（碳源、含氮物质（维生素类、氨基酸、天然复合物）、植物生长调节物质（生长素、细胞分裂素、赤霉素））生长素：IAA、2,4-D、NAA、IBA；细胞分裂素：BA、KT、玉米素
（4）培养材料的支持物（0.5%~1%）
（5）培养基的pH值
（6）其他成分（活性炭、抗生素物质、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂）
MS培养基包括：大量元素、微量元素、铁盐、有机物
5、培养室组成包括：洗涤室、药品储藏室、称量室、培养基配制室、培养基灭菌室、培养基存放室、过渡室（缓冲室）、接种室、培养室、细胞学实验室、暗室、物品存放室、大棚
6、人工种子的结构、优点及制作过程（后两者较重要）
人工种子的结构包括：人工种皮、人工胚乳、胚状体或芽。

人工种子的优点：（1）便于运输和储藏
（2）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子。

（3）可以固定杂种优势，可保存珍贵稀有植物品种。

（4）有利于快速繁殖，生产效率高。

人工种子制作过程：（1）高质量体细胞胚状体诱导
（2）体细胞胚发生的同步化控制
（3）人工胚乳制作
（4）人工种皮制作
（5）人工种子包埋
7、病毒的传播方式：介体传播、接触传播
病毒在植物体内的传播途径：通过维管系统和胞间连丝
8、植物细胞培养方法：悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养
9、细胞融合的方法包括：生物法、化学法及物理法。

生物法：仙台病毒（HVJ）法
原理：病毒诱导细胞融合主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。

化学法：高Ca离子、高pH结合PEG诱导融合，NaNO3诱导
物理法：显微操作、电场刺激（电融合）法
电融合原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。

10、杂种细胞筛选方法：选择性培养基筛选法、遗传互补筛选法、抗性互补筛选法、利用物理特性筛选法、利用生长特性筛选法
11、杂交瘤技术是将骨髓瘤细胞和淋巴细胞融合。

12、培养细胞的最适温度为37°C，pH：7.2~7.4之间，需血清。

调节pH的物质有NaHCO3、HEPES溶液。

细胞消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、抗生素溶液
13、细胞重组方式
（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种
（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体
（3）胞质体与核体重组形成重组细胞
14、干细胞分类
（1）根据分化能力强弱分：单能干细胞、多能干细胞、全能干细胞
（2）根据来源分：成体干细胞、胚胎干细胞
三、简答题
1、细胞工程的应用
（1）优良植物快速繁殖和细胞培养生产代谢产物
（2）优良、濒危动物的快速繁殖
（3）动物细胞培养生产活性产物和药物
（4）新品种培育
（5）多倍体、单倍体育种
（6）试管动物与婴儿
（7）供医学器官修复或移植组织
（8）珍惜动植物资源的保存与保护
（9）在能源、环境保护等领域的应用
2、培养动物优良品种的方法
（1）根据细胞融合、杂交等手段建立新品种
（2）人工诱变，即用辐射或电化学诱变剂等手段改变遗传性状，诱导新品种的产生
（3）采用多倍体诱导等染色体工程技术
（4）通过转基因技术转入外源基因在体内表达，制造新品种
（5）通过组织培养、胚胎移植、克隆等手段实现快速育种
3、有什么方法可以防止或缓解褐变？
当外植体处于机械损伤等逆境时，细胞膜的结构遭到破坏，酚酶催化多酚类化合物，使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水；醌类物质经过非酶促聚合，形成黑褐色物质（羟醌和黑色素等），引起褐变的发生。

解决途径：（1）选择适宜的外植体
（2）选择适宜的培养条件（低盐、低pH、低温、弱光照）
（3）细胞筛选和材料预处理（黑暗条件下，5°C，12~14h）
（4）使用抑制剂和吸附剂（抗坏血酸、PVP、少量活性炭等）
（5）连续转移
4、玻璃化的防治措施有哪些？
玻璃化是指组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状、外观形态异常的现象，又称过度水化现象。

采取的措施：（1）适当提高光照强度
（2）注意通气，尽可能降低培养容器内的空气相对湿度和改善氧气供应情况
（3）适当降低培养基中铵根离子浓度
（4）注意细胞分裂素和生长素的配合以及激素和钾离子之间的配合使用
（5）控制温度，适当进行低温处理，避免过高的培养温度
（6）利用固体培养基，增加琼脂浓度，降低培养基衬质势，造成细胞阻遏
（7）适当增加蔗糖浓度，降低渗透势
5、胚状体同步发育方法及原理
（1）抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂，去除抑制剂后细胞可同步发育。

（2）低温法：低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度使细胞分裂同步化。

（3）渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。

（4）通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯）生成。

可以通过在培养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂。

（5）分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育时期的胚状体。

6、茎尖培养脱毒的原理：病毒在感染植物上分布不一致，即在老叶片及成熟的组织和器官病毒含量较高，而幼嫩的及未成熟的组织和器官病毒含量较低，生长点（0.1~1mm区域）则几乎不含或很少。

茎尖（分生组织）无病毒可能存在的原因：
（1）在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但分生组织中不存在维管束系统。

（2）病毒在细胞间移动的另一个途径是胞间连丝，然而，它的速度很慢，难以追上活跃生长的茎间。

分生组织分化速度大于病毒传播速度。

（3）在茎尖中存在高水平的内源生长素，可抑制病毒的增殖。

7、什么叫细胞固定化培养，有什么优点？
固定化培养是将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一种技术。

优点:（1）细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累
（2）利于保持培养液流体性质
（3）细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小
（4）有利于进行连续培养和生物转化
8、生物反应器存在的问题？
植物细胞培养在放大培养时往往产量会比实验室摇瓶培养或小型反应器培养下降许多，次级代谢产物合成能力也会下降许多，可能是由于以下因素引起的：（1）通气和搅拌引起的流体压力易造成细胞损伤、有益气体的散失、大量泡沫的生成等，这些均会对细胞生长和产物积累产生影响。

（2）高密度引起培养液粘度增加，造成营养吸收、气体传递的抑制。

（3）反应器结构缺陷（如死角等）导致细胞黏附，引起细胞死亡、腐败以及营养和气体吸收限制等。

（4）对产物生物合成机制、途径等不了解，因此，很难维持最佳培养条件。

9、原生质体的用途
（1）提供相关生理生化研究
（2）利用原生质体可摄取如病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等外源物质的特点而用作基因调控和表达、遗传工程研究的材料。

（3）进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种；同时还可以用于研究染色体行为、基因定位等。

（4）用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传试验。

11、动物细胞体外培养有哪些类型？
（一）贴附型细胞
（1）成纤维型细胞细胞大致呈梭形，多数细胞间排列松散，有较大的细胞间隙，起源于胚肺细胞。

（2）上皮型细胞细胞扁平状，形态较为规则，排列紧密，呈“铺路石状”，起源于内胚层与外胚层的细胞。

（3）游走型细胞外形不规则且不断变化，生长位置不固定。

如具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞。

（4）多形型细胞形态不规则，一般分胞体和胞突两部分，如神经元和神经胶质细胞。

（二）非贴附型细胞（悬浮细胞）
细胞体外生长不必贴壁，密度较高，胞体始终为球形。

如血液白细胞、淋巴组织细胞等。

12、简述多莉羊克隆过程。

从一只免疫过的白面绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度培养液中培养至细胞停止分裂，得到供体细胞，将此细胞与从黑面绵羊的卵巢中取出的去核卵细胞利用显微注射法使其融合，融合细胞经过细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞，将胚胎细胞转移到另一只黑面绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后得到克隆羊多莉。

四、论述题
1、植物细胞工程的应用
（1）脱毒苗与快速繁殖：保持优良品种的遗传特性，高效快速地实现种苗的大量繁殖，从植物体上取材少，培养周期短，繁殖率高，便于自动化管理。

（2）植物特殊倍性创造：创造多倍体或单倍体诱导纯合正常植株，如无籽西瓜就是三倍体。

（3）体细胞杂交：把两亲本的优良性状组合在同一后代中，克服远缘杂交不亲和。

（4）次生产物生产：用于生物制药等，如人参皂甙、工业化生产紫杉醇等。

（5）基础研究：用于研究植物的生长特性和性状等。

（6）培育植物新品种：转基因植物的培育，如抗虫、抗病棉花。

2、以烟草为例说明植物组织培养的步骤。

（1）准备工作：准备好培养基试剂以及要取材的烟草。

（2）培养基制备：按照培养基配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中→在搪瓷杯中加入所需水量，加热溶解→加琼脂溶化→用1N NaOH 或1N HCl调至培养基规定的pH值→分装加塞→培养基灭菌→培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长→保存备用（3）外植体制备：烟草外植体取材（烟草根、茎、叶均可）→自来水冲洗→70%酒精表面消毒20~60S→无菌水冲洗→消毒剂处理3~5次→无菌水充分冲洗3~5次→备用
（4）接种：消毒后，对外植体进行修剪、剪切，并接入培养基中。

并标上日期。

（5）培养：培养条件一般控制在12小时光照，20±1℃。

（6）定期检查：定期检查烟草的培养情况，及时记录和处理污染的材料。

（7）移栽、炼苗：培养一段时间后的烟草需要经炼苗后才能正常种植。

天目考试题
一名词解释
细胞工程、生物工程、多能干细胞、继代培养、人工种子、看护培养、固定化培养、细胞两相培养、不对称融合、雄核发育。

二填空
1 生物工程的六大组成：发酵工程、酶工程、蛋白质工程、基因工程、生物化学工程、细胞工程。

2 基因工程（DNA重组技术）的一般步骤：（1）目的基因的获得，（2）将目的基因与质粒重组，（3）将重组DNA引入到宿主细胞，（4）筛选能表达的目的基因。

3 细胞融合的方法，生物法：HVJ法；化学法：高Ca离子、高pH结合PEG诱导融合，NaNO3诱导；物理法：电融合法4病毒在植物体内的传播途径：通过维管系统和胞间连丝
5 动物细胞培养的传统方法：悬滴培养、灌注小室培养、转管培养、转瓶培养和培养板培养。

三简答题
1、杂种细胞筛选方法：选择性培养基筛选法、遗传互补筛选法、抗性互补筛选法、利用物理特性筛选法、利用生长特性筛选法
2、有什么方法可以防止或缓解褐变？
当外植体处于机械损伤等逆境时，细胞膜的结构遭到破坏，酚酶催化多酚类化合物，使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水；醌类物质经过非酶促聚合，形成黑褐色物质（羟醌和黑色素等），引起褐变的发生。

解决途径：（1）选择适宜的外植体
（2）选择适宜的培养条件（低盐、低pH、低温、弱光照）
（3）细胞筛选和材料预处理（黑暗条件下，5°C，12~14h）
（4）使用抑制剂和吸附剂（抗坏血酸、PVP、少量活性炭等）
（5）连续转移
3、胚状体同步发育方法及原理
（1）抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂，去除抑制剂后细胞可同步发育。

（2）低温法：低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度使细胞分裂同步化。

（3）渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。

（4）通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯）生成。

可以通过在培养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂。

（5）分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育时期的胚状体。

4、为什么用茎尖做外植体能培养出脱毒苗？
茎尖培养脱毒的原理：病毒在感染植物上分布不一致，即在老叶片及成熟的组织和器官病毒含量较高，而幼嫩的及未成熟的组织和器官病毒含量较低，生长点（0.1~1mm区域）则几
乎不含或很少。

茎尖（分生组织）无病毒可能存在的原因：
（1）在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但分生组织中不存在维管束系统。

（2）病毒在细胞间移动的另一个途径是胞间连丝，然而，它的速度很慢，难以追上活跃生长的茎间。

分生组织分化速度大于病毒传播速度。

（3）在茎尖中存在高水平的内源生长素，可抑制病毒的增殖。

5、生物反应器存在的问题？
植物细胞培养在放大培养时往往产量会比实验室摇瓶培养或小型反应器培养下降许多，次级代谢产物合成能力也会下降许多，可能是由于以下因素引起的：
（1）通气和搅拌引起的流体压力易造成细胞损伤、有益气体的散失、大量泡沫的生成等，这些均会对细胞生长和产物积累产生影响。

（2）高密度引起培养液粘度增加，造成营养吸收、气体传递的抑
制。

（3）反应器结构缺陷（如死角等）导致细胞黏附，引起细胞死亡、腐败以及营养和气体吸收限制等。

（4）对产物生物合成机制、途径等不了解，因此，很难维持最佳培养条件。

6、动物细胞体外培养有哪些类型？
（一）贴附型细胞
（1）成纤维型细胞细胞大致呈梭形，多数细胞间排列松散，有较大的细胞间隙，起源于胚肺细胞。

（2）上皮型细胞细胞扁平状，形态较为规则，排列紧密，呈“铺路石状”，起源于内胚层与外胚层的细胞。

（3）游走型细胞外形不规则且不断变化，生长位置不固定。

如具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞。

（4）多形型细胞形态不规则，一般分胞体和胞突两部分，如神经元和神经胶质细胞。

（二）非贴附型细胞（悬浮细胞）
细胞体外生长不必贴壁，密度较高，胞体始终为球形。

如血液白细胞、淋巴组织细胞等。

四论述题
1、细胞工程在林木培育中的应用与意义
（1）脱毒苗与快速繁殖：保持优良品种的遗传特性，高效快速地实现种苗的大量繁殖，从植物体上取材少，培养周期短，繁殖率高，便于自动化管理。

（2）植物特殊倍性创造：创造多倍体或单倍体诱导纯合正常植株，如无籽西瓜就是三倍体。

（3）体细胞杂交：把两亲本的优良性状组合在同一后代中，克服远缘杂交不亲和。

（4）次生产物生产：用于生物制药等，如人参皂甙、工业化生产紫杉醇等。

（5）基础研究：用于研究植物的生长特性和性状等。

（6）培育植物新品种：转基因植物的培育，如抗虫、抗病棉花。

2、细胞工程在给人们带来利益的同时也带来了不利（题目记不得了，大概是这个意思。

从克隆方面讲）
3、什么叫组织培养？以烟草为例说明植物组织培养的步骤。

（1）准备工作：准备好培养基试剂以及要取材的烟草。

（2）培养基制备：按照培养基配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中→在搪瓷杯中加入所需水量，加热溶解→加琼脂溶化→用1N NaOH 或1N HCl调至培养基规定的pH值→分装加塞→培养基灭菌→培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长→保存备用（3）外植体制备：烟草外植体取材（烟草根、茎、叶均可）→自来水冲洗→70%酒精表面消毒20~60S→无菌水冲洗→消毒剂处理3~5次→无菌水充分冲洗3~5次→备用
（4）接种：消毒后，对外植体进行修剪、剪切，并接入培养基中。

并标上日期。

（5）培养：培养条件一般控制在12小时光照，20±1℃。

（6）定期检查：定期检查烟草的培养情况，及时记录和处理污染的材料。

（7）移栽、炼苗：培养一段时间后的烟草需要经炼苗后才能正常种植。