腈水解酶的[1]..
耐逆的腈水解酶等化工酶在芽孢表面固定化并优化其连接肽提高固定化效果
摘要腈水解酶作为一种重要的工业酶能够直接将有毒腈化物转化为相应的无毒酸和氨，应用广泛。
腈水解酶介导的生物催化制备某些羧酸化合物已经代替了传统的化学合成法，其反应条件温和，环境友好，选择性高等优点，引起研究者密切关注，因此筛选获得更多具有优良性质的腈水解酶具有很大的意义。
近年，枯草杆菌孢子展示技术作为一种新型的蛋白固定化方式引起广泛关注，由于枯草杆菌芽孢具有高稳定性和抗逆性，使得芽孢便成为了一个优秀的固定化载体在其表面展示外源蛋白。
目前有关利用芽孢展示技术进行耐逆化工酶酶的固定化报道较少，本文首次克隆表达鉴定了来自Thermotoga maritima MSB8的腈水解酶并展示在芽孢表面，然后对连接孢子表面衣壳蛋白与腈水解酶的连接肽进行了初步优化。
本研究中，首次从Thermotoga maritima MSB8基因组扩增到腈水解酶基因，并连接到原核表达载体PET-28a上，构建表达质粒PET-28a-nit，然后转化入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定，分子量在30kDa 左右，与预测一致。
对Thermotoga maritima MSB8腈水解酶的酶学性质进行了研究，发现以3-氰基吡啶作为反应底物时，该腈水解酶的最适反应温度和pH分别为45℃和7.5。
热耐受性试验显示在75℃环境下处理0.5h能够保留将近50% 的酶活，酸碱耐受性试验显示该腈水解酶对碱性反应条件的比较敏感。
Mn2+，Zn2+和Cu2+能显著抑制酶活，Mg2+和Fe2+.能够稍微促进酶活，其它的一些金属离子和金属离子螯合剂EDTA对酶活没有显著影响。
还原剂二硫苏糖醇DTT能够一定程度促进酶活，其它一些还原剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂和有机溶剂都对该腈水解酶活性产生了不同程度的抑制作用。
该腈水解酶的动力学常数Vm和Km值分别为3.12 μmol/min/mg和7.63mM，催化常数为kcat/Km为0.44 /mM/s，底物谱研究表明该腈水解酶对脂肪族双腈具有明显的特异性。
腈水解酶催化腈水解的研究进展_刘颖
腈水解酶催化腈水解的研究进展刘颖，苏昕*1（沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，沈阳 110016）摘要:腈水解酶催化具有毒性、致畸性、致癌性的腈水解合成羧酸因其反应条件温和、成本低、环境污染少及高选择性（立体、化学、区域）而备受学者和企业家的青睐，产物羧酸广泛用于精细化工、医药中间体、维生素前体等，具有高增值价值，因此腈水解酶具有良好的工业应用前景和巨大的经济价值。
目前对腈水解酶的来源、作用机制、筛选途径、酶结构、催化特性以及腈水解酶基因克隆、纯化、固定化、修饰等研究均有报道。
参考20余篇文献，本文综述腈水解酶催化腈类化合物水解的研究进展。
关键词：腈水解酶，腈化合物，生物催化Advances in nitrilase hydrolyzing nitrilesLIU Ying, SU Xin*(School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China) Abstract: The nitrilases attract substantial attention from scholars and entrepreneurs because of their mild reaction conditions, low-cost, small environmental pollution and high selectivity (stereo-, chemical-, regional-) when hydrolyzing toxic, mutagenic and carcinogenic nitriles. The production of carboxylic acid with high added value is widely used in fine chemicals, pharmaceutical intermediates and vitamin premises. Therefore, the nitrilase has good application prospect and the great economic value. Articles about the sources of enzyme, mechanism, screening approach, structure, catalytic properties, nitrilase gene cloning, purification of nitrilase, immobilization, modification etc have been reported. Based on more than 20 domestic and foreign literatures, recent progress on nitrilases hydrolyzing nitriles was reviewed.Keywords: Nitrilase, Nitriles, Biocatalysis腈是一类含−CN基团的有机物，是合成酰胺、羧酸、酯等的起始原料。
腈水解酶重组菌发酵产酶条件的优化及应用
初始发酵培养基：蛋白 胨 １０ｇ·Ｌ－１，酵 母 浸 出 汁 ５ｇ·Ｌ－１，ＮａＣｌ １０ｇ·Ｌ－１，ｐＨ 值７．５，１２１ ℃ 灭 菌 ２０ ｍｉｎ。 １．３ 方 法
初始培养方法：从 甘 油 管 或 斜 面 挑 取 重 组 工 程 菌 至装 液 量 为 ５０ ｍＬ （２５０ ｍＬ 三 角 瓶 ）的 种 子 培 养 基 中，３７ ℃培养１２ｈ后，取１ｍＬ 种子液于装液量为１００ ｍＬ（５００ ｍＬ 三 角 瓶）的 发 酵 培 养 基 中，３７ ℃ 培 养 ４ｈ 后加诱导剂乳糖 ２．０ｇ·Ｌ－１，转 入 ２８ ℃ 诱 导 培 养 １６ ｈ后离心收集菌体。
高速 离 心 机，美 国 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＦＡ２００４ 型 电 子 分 析 天 平 ，上 海 精 密 仪 器 仪 表 有 限 公 司 ；ＳＰＤ－２０Ａ
基 金 项 目 ：国 家 ８６３ 计 划 资 助 项 目 （２００９ＡＡ０２Ｚ２０３） 收 稿 日 期 ：２０１１－１２－２２ 作者简介：吴乔（１９８６－），男，湖南岳阳人，硕士研究生，研究方 向：生 物 催 化 与 转 化；通 讯 作 者：郑 裕 国，教 授，博 士 生 导 师，Ｅ－ｍａｉｌ：
玉 米 浆 粉 浓 度 对 菌 株 生 长 和 产 酶 的 影 响 见 图 １。
图 １ 玉 米 浆 粉 浓 度 对 菌 株 生 长 和 产 酶 的 影 响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｒｎ ｐａｓｔｅ ｐｏｗｄｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
对 映 体 过 量 值 （ｅ．ｅ．值 ）来 评 价 。
腈水解酶在羧酸合成中的研究进展
p henylace ton itrile 3 2Cyanop yrid ine a ryla lkyln itrile s benzonitrile
Pen icillium m u lticolor CCF 2244 benzonitrile
Pseudom onas fluorescens DSM 7155 arylalkylnitriles
好过程 ,而且更重要的是可以实现一般化学转化所 不具有的优良的化学 、区域和立体选择性 。
1 腈水解酶简介早在 来自0世纪 30年代 ,就有人提出用某些植物 组织能将腈化物转化成酸的假说来解释一些化学
收稿日期 : 2008205226 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (20506037, 20672037) ;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室开放课题资助项目 (2008004) 作者简介 :何玉财 (1979—) ,男 ,辽宁开原人 ,博士 ,研究方向 :生物催化与生物加工 ;许建和 (联系人 ) ,教授 ,博士生导师 , E2mail: jianhexu@ ec2
Abstract:O rganic carboxylic acids are impo rtant interm ediates in organic synthesis1B y using nitrilase as biocatalyst, hydrolysis of nitriles to yield carboxylic acids can be perform ed under m ild conditions w ith low pollution and w ithout waste disposal p roblem1A dditionally, it can also p rovide high chemoselectivi2 ty, regioselectivity and enantioselectivity, and they canπt be achieved by conventional organic synthesis1Sources, p roperties, and the m echanism of the nitrilase were reviewed1The research p rogress of nitrilases in o rganic synthesis was introduced, and the potential app lication of nitrilases in industry were summ arized. Key words: biocatalysis; carboxylic acid; nitrilases; organic synthesis
腈水解酶的特性与应用进展研究
腈水解酶的特性与应用进展研究关键词腈水解酶；催化特性；固定化；应用进展KeywordsNitrilase；Catalyticcharacteristics；Immobilization；Applicationprogress1腈水解酶概述1.1简介腈水解酶（EC3.5.5.1）又称腈酶，属于腈代谢酶系中的一种，是重要的工业用酶，也是重要的生物催化剂。
它能够水解碳氮肽键来生产更加有价值的相对应的羧酸[1-2]。
腈的化学水解通常需要高温强碱性或酸性的条件，易产生不必要的副产物和大量的无机废物。
而利用腈水解酶催化水解生成羧酸，是通过一步反应进行的，体现出优越的高选择性、高效率以及环境经济性，为降解腈类物质提供了一个“绿色”的选择。
到目前为止，腈水解酶被广泛用于精细化学品、医药中间体的生产以及腈污染物的生物修复。
在自然界中，几乎所有的真菌、植物以及动物等有机体的体内都会产生脂肪腈或芳香腈如氰脂、蓖麻碱和苯乙腈等。
这些腈类化合物不仅能够提供生物必须储备氮源，而且能够起到保护作用，免受其他生物的侵害[3]。
1935年，有学者提出某些植物组织自身能将腈类化合物转化成羧酸。
这些酸类物质对植物生长有利，从而论证某些有机羧酸、酰胺等腈类衍生物有助于植物的生长。
20世纪60年代，Thimann等得到一种类似化学法能够水解腈或酰胺的酶。
它是从大麦叶子中提取、纯化的。
该酶能将3吲哚乙腈水解成为吲哚3乙酸，故将其命名为吲哚乙腈水解酶[4]。
随着研究的不断深入，他们发现这种吲哚乙腈水解酶不仅能水解3吲哚乙腈，而且对其他20余种脂肪族和芳香族的腈类化合物都具有催化活性，例如该酶水解底物3氰基吡啶的活力比水解3吲哚乙腈高接近10倍。
因此，Thiman等给这种酶赋予一个新的名称——腈水解酶。
历史上第一次发现能产腈水解酶的微生物菌种的是Hook和Robinson。
他们在假单胞菌（Pseudomonas）中利用蓖麻碱天然腈筛选所得到的。
腈水解酶企业标准
腈水解酶企业标准腈水解酶是一种能够催化腈化合物水解反应的酶类物质，可广泛应用于化学、制药、农药、食品等领域。
为了确保腈水解酶的质量和安全性，制定一套科学合理的企业标准是必不可少的。
本文将从腈水解酶的定义、质量要求、生产过程、检测方法等方面，提供一些相关参考内容。
一、腈水解酶的定义与分类腈水解酶是一类能够将腈化合物催化水解生成相应醛或酸的酶类物质。
根据不同的催化机制和底物特性，腈水解酶可分为酰胺水解酶、亚甲基酰氨水解酶、亚硫酰胺水解酶等。
企业标准中应对腈水解酶的分类、定义及特性进行详细说明。
二、腈水解酶的质量要求1. 纯度要求：腈水解酶的纯度要求应符合国家相关标准或行业规定，常见的检测指标包括酶活力、酶蛋白含量等；2. 活力稳定性：腈水解酶在常温下应具有较好的活力稳定性，其活力损失应符合企业标准规定的范围；3. 耐温性：腈水解酶在一定温度范围内应具备较好的催化活性；4. 抗负荷性：腈水解酶在一定浓度范围内能够承受一定的负荷；5. 抗腐蚀性：腈水解酶应对酸碱及其他化学物质的腐蚀具有一定的抵抗能力。
三、腈水解酶的生产过程1. 底物选择：根据所需产品的要求，选用适合的腈化合物作为底物；2. 发酵菌种选择：选择具有高效腈水解酶产量和催化活性的发酵菌种；3. 发酵条件优化：通过调节发酵温度、pH值、营养物质等条件，优化腈水解酶的产量和活性；4. 酶液提取和纯化：采用适当的方法，将腈水解酶从发酵液中提取出来，并进行一定程度的纯化工艺处理。
四、腈水解酶的检测方法1. 酶活力检测：利用合适的底物和适量的酶液，测定在一定条件下酶催化底物水解的速率，计算酶活力；2. 蛋白含量检测：采用常见的蛋白质检测方法，如BCA法、Lowry法等，测定腈水解酶中的蛋白含量；3. 温度稳定性检测：在一定温度下，监测腈水解酶活力的变化，评估其温度稳定性；4. pH稳定性检测：在不同pH值条件下，监测腈水解酶活力的变化，评估其pH稳定性。
敏捷食酸菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达
敏捷食酸菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达管启旺;马江锋;贺爱永;姜岷;宫长斌【摘要】以含有敏捷食酸菌的腈水解酶基因的克隆质粒为模板，通过PCR扩增获得长度为1080 bp的腈水解酶（Nitrilase）基因片段。
使用表达质粒pET-28-a 构建表达载体，获得重组质粒pET-Nit。
对所表达的基因进行测序对比发现与GenBank所公布的基因序列比较，相似性99%，读码框出现2 bp的突变，但并未引起相应氨基酸突变，故不影响酶的表达与特性。
将重组质粒转化到表达宿主Escherichia coli Rosetta（DE3）感受态中，使用诱导剂IPTG对菌株进行诱导表达，获取菌液进行SDS-PAGE分析，得知目的蛋白分子量约为41.28 kD，与预期所想的一致。
酶活力分析表明，上清的比活力为3 U/mg。
进一步对诱导条件进行优化，包括诱导温度，IPTG浓度，诱导时间等一系列条件。
在最优条件下，扩大培养体积，比活力可达15 U/mg，活力提高了5倍左右。
%Plasmid containingAcidovorax facilis gene, was used as a template, and length of 1 080 bp nitrilase(Nitrilase)gene fragment was obtained by PCR. Expressed genes were sequenced and compared to gene sequences found in GenBank. There are 2 bp mutation was found, which can not affect the expression and characterization of the enzyme. The recombinant plasmid was transformed into theEscherichia coliRosetta(DE3)competent cell, which was induced IPTG for strain- expression. SDS-PAGE analysis was used and showed that the protein molecular weight was about 41.28 kD. Enzyme activity analysis showed that the specific activity of the supernatant was 3 U/mg. Induction conditions were optimized, including induction temperature, IPTG concentration, induction time and a series of conditions.Under optimal conditions and with the expansion of the culture volume,the specific activity can up to 15 U/mg, and activity increased by about five times.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P181-185)【关键词】腈水解酶;敏捷食酸菌;大肠杆菌;克隆【作者】管启旺;马江锋;贺爱永;姜岷;宫长斌【作者单位】南京工业大学生物与制药工程学院材料与化学工程国家重点实验室，南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院材料与化学工程国家重点实验室，南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院材料与化学工程国家重点实验室，南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院材料与化学工程国家重点实验室，南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院材料与化学工程国家重点实验室，南京 211816【正文语种】中文腈水解酶（EC 3.5.5.1，Nitrilase）是一类催化腈类物质水解的特异性酶，属于腈水解酶超家族［1］。
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5．数据处理和综合分析（尽量应用计算机）。
6．撰写毕业论文。
本任务书一式三份，学院、教师、学生各执一份。
系（教研室）指导教师
系（教研室）主任主管院长
2～3
提交实验记录
4～6
提交实验记录
7～9
提交实验记录
10～13
提交实验记录
14～16
提交实验记录
16～17
整理实验数据、撰写和修改论文
提交修改好的论文
18
答辩
提交所有资料
1．调查研究、查阅文献和搜集资料。
2．阅读和翻译与课题内容有关的外文资料（外文翻译不能少于2万印刷字符，约合5000汉字）。
3．撰写开题报告，确定实施方案和分析检测方法。
江苏工业学院毕业
化学化工学院生物工程专业生工061班郑明同学：
现给你下达毕业设计（论文）任务如下，要求你在预定时间内，完成此项任务。
腈水合酶催化合成酰胺的研究
研究目标
研究内容：
拟解决的关键问题：
研究方法：
技术路线：
五、进1
资料查阅和整理、开题报告、英文翻译
提交综述、开题报告和英文翻译