酶的高通量筛选与定向筛选

Quick E 示意图
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
荧光共振能量转移底物的高通量筛选
荧光共振能量传递底物，不仅有非常好 的静态定位能力，也能提供分子内或分子 间两个荧光基团在距离和方向上的动态变 化。 将这种方法扩展，可用于研究生物多聚 体的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切 反应，以及DNA发夹结构的去折叠等。这 种技术最近被用来检测核糖核酸酶反应活 性。
得到了广泛的应用，是当前酶的高通量筛 选的主要研究和发展方向。 随着生物催化在精细化工和医药行业的广 泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手 性酶的筛选成了当前的研究热点，同时产 品价值的提高也将使得很多借助复杂仪器 设备的高成本的检测方法成为可能并将逐 渐得到更多的应用。
酶分子的定向进化
通过以上方法从自然界筛选到的酶通常还
红外检测技术是一种新颖的
有发展前途的高通量筛选技术， 它不需要生色基团或荧光基团 的加入，避免了比色和荧光检 测方法的局限性，但是这种技 术目前还无法进行定量，只能 检测催化活性较高的酶，对酶 活的进一步研究还需借助传统 方法，方法本身还需要进一步 的发展和完善。
借助复杂的仪器设备的高通量筛选
高效液相色谱, 质谱和毛细管电泳也被用来


生物催化研究过程
酶的筛选

酶的筛选可分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。 选择培养基筛选法 通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生 长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。
– 单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势 而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑 制，从而得到所需的目的菌株。 – 互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌 株。
显色或荧光底物的高通量筛选
大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺
离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮 衍生物作为底物的检测方法。 基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容 易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛 的应用。 但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应 速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于 一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反 应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。
酶的高通量筛选与定向筛选
生物催化简介
生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行物质转 化，大规模生产化学品、医药、能源、材料的科学。

优点：一个生物催化剂可以催化一系列底物甚至很多非天然底物；酶 具有高度的选择性尤其在立体和区域选择方面具有化学催化剂无法比 拟的优越性；生物催化反应通常反应条件温和具有环境友好性。 缺点：生物催化剂在目的介质中的不稳定性导致的活性降低甚至完全 丢失；虽然生物催化剂可以催化我们所知的各种反应，但对于特定的 底物和产物可选择的酶通常是很少的，而且目前只有极少数的酶可以 商业获得；从酶的发现到生产应用通常是一个艰苦的漫长的过程。 实际应用取决于它与传统工业过程的竞争，只有在竞争获得明显的经 济优势才能得到生产应用
无法适应工业应用的需求，主要限制因素 包括 酶对非天然底物的惰性， 在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受 力， 在非水环境下的低活力， 对辅酶的依赖等。
酶分子的定向进化
定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个
别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进 行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工 程技术又称为分子进化的理性设计。 采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。 这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
pH指示剂显色高通量筛选
许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反
应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测 水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于 腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选 Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对 映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评 价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假 单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立 体选择性明显提高的突变体

基wk.baidu.com反应热力学变化红外检测的高通量筛选

所有的物质都可以发射红外线，光电平面聚焦阵列红外检测器可以灵敏地检测反应过 程中的热量变化（检测波长范围3-5μm ，温度变化10-100mK）。放热反应在红外 成像中表现为‚热‛点，相反吸热反应表现‚冷‛点，通过对‚热‛点或‚冷‛点的 分辨，可以检测反应的进行与否。
检测反应速度，但是作为一种高通量筛选 技术，这些方法测试成本较高，而且每天 每台仪器最高只能检测几百个样品，方法 的使用受到一定的限制。 采用放射性同位素标记底物进行脂酶的筛 选取得了较好的实验结果，这种方法灵敏 而且准确，但由于放射性其使用会受到限 制无法推广使用。
酶的筛选（小结）
比色和荧光检测为代表的高通量筛选方法
基于检测培养基筛选法的，生色基团 或荧光基团的底物参加的催化反应是最容 易实现高通量筛选的。
通过监测反应过程中的颜色和荧光的变化可 以有效地监测反应的进行。 使用比色计或荧光计检测显色或荧光底物， pH指示剂显色反应和荧光共振能量转移还可以 实现高通量实时检测。

基于比色法和荧光检测的高通量筛选

检测培养基筛选法 通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以 辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此 区别不同类型或生理特性不同的微生物。这种筛选可以在检测平板中 进行，也可以在微孔滴定板中进行，借助一些检测仪器很容易实现高 通量筛选。
酶的高通量筛选
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突
变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要： (1) 产生包含大量带有微 量有利突变的突变体的文 库; (2) 突变体应能在适当的 微生物(如大肠杆菌或酵母 菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛 选方法,能反映出由一个氨 基酸的臵换而引起的预期 性状的较小提高。