分离工程层析法

重要概念 1、分配系数 就分配色谱法，在T、P一定，低浓度时，Kd=c/m c:固定相的溶质浓度；m:流动相的溶质浓度。
2、阻滞因素（Rf值）
(1)定义 用于分配色谱法中，分配色层分离系统中溶 质的移动速度和一理想标准物质（Kd=0的物质） 的移动速度之比。
溶质的移动时间内溶剂前)的移动距离 0 ( S
柱色层分离法的装置
色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相 似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收 集器等几个部分构成(图2)。
洗脱方法
按操作方式
恒定洗脱
(isocratic elution) 节梯洗脱 (stage elution) 梯度洗脱 (gradient elution)
1941
1952
Martin, Synge
Martin, James
提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作 为流动相（即气相色谱）。
从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。
1956
1957 1958
Van Deemter
Golay
提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。
基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 发明毛细管柱气相色谱。
Rf
在薄层色谱法和纸色谱法中
l Rf L
在柱色谱中： As：固定相的平均截面积。 Am：流动相的平均截面积
V V 溶质最大浓度区的移动 距离S 能分配的有效截面积 Am K d As V 流动相的移动距离 S0 ) ( Am Am S Rf S0 Am K d As
⑶洗脱法 混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定 相一端，然后用溶剂洗脱，洗脱剂可以是原来溶 解混合物的溶剂，也可以选用另外的溶剂。但对 固定相没有亲和力，各组分分层清楚，层与层之 间隔着一层溶剂。
色层分离法的基本概念 1、基本原理

在柱的入口端加入料液后， 连续输入流动相，料液中 溶质在流动相与固定相之 间扩散传质，产生分配平 衡。
结论： ①在柱色谱中，Rf决定Am,As,Kd，柱一定，Am，As一定， Rf由Kd决定 ②Rf与Kd成反比。 ③分离组分时， R f R f 或 K d K d ??
1 2 1 2
④0<Rf<1
Am Rf Am K d As
3、洗脱容积Ve
在柱色层分离中，使溶质的最大浓度区从柱中 流出时所通过的流动相体积。（因为溶质在柱中的浓 度系按钟罩形分布的）
据实验技术
据固定相的形状不 同
据流动相的物态不 同 按操作方式不同
层析的分类
⑴根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类
离子交换色层分离法
疏水作用色层分离法
吸附层析法
分配层析法 凝胶过滤法 亲和层析法
金属螯合色层分离法 共价作用色层分离法
色层分离方法作用机制多样性： 如有的方法是利用范德华力，有的是利用 分子大小不同，有的方法利用电泳速度不同。
吸附色谱与其它色谱法的异同点
类型 机理 优点 缺点 适用范围
吸附色谱
化学、物理吸附
操作简便
易受离子干 各 种 生 物 大 分 扰 子的分离、脱 色、和去热源
凝胶过滤
分子筛的排阻效应
分辨力高，不 各种凝胶介 分 子 量 有 明 显 会引起变性 质昂贵，处 差 别 的 可 溶 性 理量有限制 生物大分子

气相色谱 液相色谱 超临界色谱
（5）流动相流动方式分类

轴向流色谱

径向流色谱
（6）分离操作方式分类

洗脱色谱
迎头色谱 顶替展开
⑴迎头法（前流法） 将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力 最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分都不 能达到分离。
⑵顶替法（置换法） 利用一种化学亲和力比各被结合都强的物 质来洗脱。各组分分层清楚，层与层相连，不能 将组分完全分开。
色带
色层分离法的分类 名词解释 色层分离是样品混合液中各组分在固定相和液动 相之间的一类差别分离。 色谱法（层离，层析，色层） ：一组相关分离方 法总称。 两个相：

固定相：表面积很大固体或是支持在载体上的液体。 流动相：液体、气体。
1.4 层析分类
分类原则 据溶质分子与固定 相相互作用的机理 不同 类型 吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱 低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱 迎头法 顶替法 洗脱法 特征 吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同 操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同 固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 固定相在玻璃平板上铺成薄层 流动相为气体 流动相为液态 流动相为液态 将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流 出，但其它各组分都不能达到分离。 利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱 溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。
亲和色谱
聚焦色谱
⑵ 根据实验技术的分类
低压层析技术
——操作压力小于0.5MPa
中压层析技术
——操作压力在0.5MPa-5MPa之间
高压层析技术
——操作压力在5Mpa-40MPa之间
电泳法
——靠溶质分子在电场中的移动速度
不同而分离
⑶ 根据固定相的形状不同的分类：
柱层析法
纸层析法
薄层层析法
（4）按流动相分类
离子交换色谱法: 物质→固定相，离交作用。 疏水作用色谱法：物质→固定相，疏水作用。 金属螯合色谱法: 物质→固定相上金属离子， 络合能力。 共价作用色谱法：巯基化合物→固定相上巯 键，特殊结合力。

⑵分配色谱法：按各物质在两液相间的分配系数不同而分离 。 ⑶凝胶色谱法：按各物质的分子大小或形状不同而分离 。 ⑷亲和色谱法：各生化物质和某些相应的物质专一结合的生物 学特性不同而分离。 如： 底物或底物类似物 酶 抑制剂 辅因子（辅酶，… 抗原 抗体 病毒 细胞
Volume (ml)
0 160 200 240
⑶ 梯度洗脱法：洗脱剂的组成连续改变，使洗脱条
件更有利于被结合物质的解离。
0.7 0.6 0.6 0.5
Protein（ mg/ml)
Protein NaCl 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 40 80 120
Volume (ml)
0.4 0.3 0.2 0.1 0 160 200 240
1965
1975 1981
Giddings
Small Jorgenson
发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。
发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑 制型电导检测的新型离子色谱法。 创立了毛细管电泳法。
色谱法是俄国植物学家茨维特1906年首创的分离植物叶色素。
固定相——CaCO3颗粒 流动相——石油醚
色层分离法
1.2 层析的发展史
年代 发明者 发明的色谱方法或重要应用
1906
1931 1938
Tswett
Kuhn, Lederer Taylor Uray
用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念
用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始 为人们所重视。 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。
设柱长为L
t
L 溶质移动速度
溶质流出柱中所需时间
流动相Ve 流动相体积流速 t 流动相流速 Am Am L Rf Am K d As Am l 溶质移动速度
Am Rf Am K d As
Am L
L( Am K d As ) Ve Vm Vs K d
作用机制共同点： 利用各组分物理化学性质的差别，使组分 不同程度地分布在两个相（固定相，流动相）从 而达到分离。
⑴吸附色谱法：各物质对固定相吸附力不同。 吸附是指固定表面对气体分子或液体分子的吸着 现象，其作用力可以是物理吸附力，也可以是化学吸 附力。（范德华力、静电引力、共价结合力、氢键）
包括：
0 0 40 80 120 Elution (ml) 160 200 240
0
NaCl (mol/L)
⑵逐次洗脱法：洗脱剂的组成至少改变一次，用于大 规模的分离操作中。
0.8 Protein
Protein (mg/ml)
NaCl
0.4
0.6
0.3
NaCl (mol/L)
0.4
0.2
0.2
0.1
0 0 40 80 120
分配色谱
溶质在固定相和流 分辨力高，重 影响因子多， 于 各 种 生 物 用 动相中分配系数的 复性较好，能 上样量太小 大 分 子 的 分 析 差异 分离微量物质 鉴定 亲和色谱生物大分 分辨力很高 子与配体之间有特 殊亲和力 等电点和离子交换 分辨力高 作用 一种配体只 各 种 生 物 大 分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大 进口试制昂 蛋白质和酶 贵
在色谱过程中，分配 系数大的溶质在固定相上存 在的概率大，随流动相移动 速度小。由此，溶质之间由 于移动速度的不同而得到分 离。