毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵及酶学性质分析姓名：李善军学号：2015304120225院系：华中农业大学生科院摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。
经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。
关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。
因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。
蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。
利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。
毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。
将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究
廛题科夔毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究刘林刘明河(临沂师范学院生命科学学院，山东临沂276005)喃要】Pi chi apas t or i s能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯，是一种极具潜力的酵母表达系统。
以毕赤酵母基因工程茵为实验菌种，探索其在不同条件下的产植酸酶睛况，优化发酵条件，找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而降低生产成本。
睽键词]Pi chi apas t or i s；酵母表达系统；植酸酶；发酵条件植酸酶能将植酸降解成肌醇或磷酸肌醇和磷酸，是一种优良的食品和饲料添加剂，可消除单胃动物因不能分解植酸而引起的抗营养作用，提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率，具有良好的饲喂效果，同时，刚氐了磷对环境的污染。
植酸酶真正具有开发价值的仅限于微生物经发酵生产植酸酶。
国外对植酸酶的研究已有30多年的历史，但由于天然来源的植酸酶或者提取困难，或者分泌量太低，或者成本太高，难以满足生产的需要，由此构建基因工程菌，获得能高效表达植酸酶的菌株，成为解决这一问题的途径。
巴斯德毕赤酵母(Pi c hi a pa st or i s)是一种极具潜力的酵母表达系统，它能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯：同时，自20世纪70年代起建立的以巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟，以毕赤酵母基因工程菌为实验菌种，探索其在不同条件下的产酶隋况，就能找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而刚氐生产成本。
1酵母细胞培养时C源的选择由于一些重组蛋白对细胞有毒害作用，通常在大容量、高密度的酵母培养过程中，需要在细胞扩增阶段用极高密度的抑制物来阻遏其他表达系统，诱导前又需将之去除。
而对于P．pa st or i s在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物(通常为甘油)，既可以满足细胞生长，又能有效地抑制外源基因的表达；在表达阶段，让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导产酶。
毕赤酵母蚓激酶重组体的高密度发酵与活性
毕赤酵母蚓激酶重组体的高密度发酵与活性摘要一种用于重组蚓激酶（rPI239）的表达系统在巴斯德毕赤酵母的发展。
通过1L高密度发酵肉汤制得0.174g上清蛋白。
rPI239体外表现出纤溶活性。
在体内rPI239的活性是通过凝血酶原时间，高岭土部分凝血酶时间，凝血酶时间和纤溶活性测定。
这项工作显示通过巴斯德毕赤酵母和高密度发酵得到的rPI239重组蛋白在体内和体外都具有相似纤溶活性。
关键词蚓激酶；纤维蛋白溶解；毕赤酵母；发酵；活性传统中医学已经长期使用蚯蚓作为药物，因为它们的抗发热和利尿特性。
最近研究表明，在蚯蚓干燥粉末含有纤溶酶组分。
研究人员在日本，韩国和中国已经分离和研究蚯蚓中获得的蚓激酶。
目前的数据显示，在地龙F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2发现的6种同工酶。
1986年，Wu等人，从蚯蚓中分离出的一组蚓激酶组件并且证实他们有激活纤溶酶原的纤溶活性和降解纤维蛋白，而EFE-II证实是纤溶活性蚓激酶的基因。
该作者通过用I125标记患有肺血管阻塞症兔子血管中的内栓子并且显示口服药物EFE-II后有明显纤溶活性。
同工酶（PDBank1IJ7）通过晶体结构分析MIR（多同晶置换）表明它是一个特效弹性蛋白酶S1反应区，表现广泛的底物活性。
最近的研究已经表明蚓激酶是有潜力的溶栓药。
1999年，Sun等人，从地龙中单独分离出蚓激酶PI239，在纤维蛋白板上发现明显纤溶活性。
它的cDNA文库与F-Ⅲ-1/2和EFE-II有89.5％同源性。
该PI239蛋白与那些的的t-PA和u-PA具有相同的活性和底物位点。
在2001年，Manabu 和 Nobuyoshi通过蚓激酶FIII-2在巴斯德毕赤酵母首次表达。
随后的研究已经证明许多种类的重组蚓激酶可以在酵母和大肠杆菌中表达。
近年来，蚓激酶已经在山羊奶表达。
尽管一些报道表明，在制得有效的重组蛋白过程中，资料非常少，，表达条件（特别是高密度发酵条件）也很苛刻，但是在这项研究中，还是完成了一套完整实验过程关于蚓激酶的筛选，表达和在酵母菌中发酵。
毕赤酵母高密度发酵工艺的研究_林俊涵
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2009,29(5):120～125毕赤酵母高密度发酵工艺的研究林俊涵3(福建生物工程职业技术学院 福州 350002)摘要 高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。
采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH 和变温发酵,提高DO ,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。
选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLF B )、氧气限制补料(OLF B )、甲醇不限制补料(MNLF B )和温度限制补料(T LF B )。
采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(q M eOH )为0.02-0.03gg -1h -1,而菌体不生长时,q M eOH 采用较高值。
关键词 毕赤酵母 高密度发酵 发酵工艺中图分类号 Q815收稿日期:2008209216 修回日期:20082102173电子信箱:ljh047@ 巴斯德毕赤酵母(P ichia pastoris )是一种能高效表达外源蛋白的表达系统,具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点[1],应用十分广泛,已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。
高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平的一种重要策略,迄今,已有许多蛋白通过高密度发酵获得高表达量,如巴西三叶胶腈水解酶的表达量高达22g/L[2],植酸酶表达量达12.2g/L[3],S AM 表达量达11.63g/L[4],1,321,42β2D 2葡聚糖酶表达量达3g/L[5]等。
但是,不同外源蛋白的表达水平相差很大,引起这种差异的重要因素有二:一是重组菌本身特性,如基因本身特性、基因拷贝数、密码子使用频率等,二是发酵工艺。
目前,针对甲醇毕赤酵母高密度发酵,业界已建立起较为成熟的补料分批发酵和连续发酵两种方式,主要针对补料分批发酵工艺的影响和调控进行阐述。
酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展
酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展用分子生物学技术将编码外源蛋白或多肽的基因引入酵母菌，构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等，用于制备相应的生物制品，是研究开发新生物制品的重要趋势之一。
20世纪80年代，默克和史克公司用重组酿酒酵母菌（Saccharomyces cere －visiae ）表达的乙型肝炎表面抗原（HBsAg ）制备乙型肝炎疫苗，是最早用重组酵母制备生物制品的成功范例。
现已用重组酵母工程菌制备乙型肝炎疫苗、HPV 疫苗、人血清白蛋白（HSA ）和细胞因子；近年来，用重组酵母工程菌，特别是甲醇营养型酵母工程菌高效表达外源蛋白或多肽已成为相关研究的热点之一。
用甲醇营养型酵母，主要是汉逊酵母（Hanse-nula polymorpha ）和毕赤酵母（Pichia postoris ）已实现了HBsAg 、HPV -VLP 、戊型肝炎病毒（HEV ）ORF2、sHSA 、水蛭素及多种细胞因子等的高表达。
由于装备技术与成本的限制及生物制品生产中对制品批次质量控制要求的综合考虑等，用于酵母工程菌培养的生产发酵罐容积一般小于1000L （葛兰素维康制备乙型肝炎疫苗的发酵罐容积为1500L ）。
在保持外源蛋白或多肽表达水平不降低的前提下，在容积有限的发酵罐中实现酵母工程菌的高密度发酵，是维持制品生产规模和控制成本的重要技术途径。
影响酵母细胞高密度发酵的主要因素有工程菌本身的生物学特性和发酵工艺特点、培养基种类与配方、发酵罐的结构和性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等。
重要工艺参数或变量包括溶氧、pH 值、温度、培养基营养成分补料、压力、搅拌转速、通气流量、CO 2、有害代谢产物积累和发酵液流变学性质等。
培养基中甲醇含量、其消耗与补充流量的控制，是影响甲醇营养型酵母工程菌培养后期去阻遏和表达外源蛋白或多肽的表达效率的关键因素。
在确保工程菌表达产率不变和表达产物性质稳定的前提下，将众多因素及其相互影响整合优化为一项发酵工艺，实现酵母工程菌细胞的高密度发酵，是一项复杂的、综合性很强的研发工作；在实现酵母工程菌高密度发酵的同时，提高表达产物的产率和活性则更具挑战性，国内外学者及企业为实现上述目标进行了大量研究。
重组毕赤酵母表达水蛭素发酵工艺の研究
而先在体外用人工方法构建好多拷贝载体，然后转化到宿主菌中获得多拷贝转化子（见图１，５）。
图１．２ＡＯＸｌ位点的基因替换Ｆｉｇ．１．２ＧｅｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔａｔＡＯＸｌ图１．３ＡＯＸｌ位点的基因插入Ｆｉｇ．１．３ＧｅｎｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｔＡＯＸｌ在Ｈｉｓ４菌株如ＧＳｌｌ５中，载体及基因组中ＡＯＸｌ启动子及３’ＡｏＸｌ区的双十字交换事件。
可产生基因替代（∞插入）。
结果ＡＯＸｌ编码区全部被取代，产生Ｈｉｓ＋Ｍｕｔｓ表型。
以ＡＯＸｌ位点由于基因替代而产生的Ｍｕｔｓ表型作为指示，可很容易地筛选Ｈｉｓ＋转化子的Ｍｕｔ表型。
基因取代的结果是缺失了ＡＯＸｌ位点（Ｍｕｆ），增加了含一Ｄ盯、目的基因、ＨＩＳ４的表达盒。
ＧＳｌｌ５的ＡＯＸＩ或ＫＭ７１的ＡＯＸＩ：：ＡＧＲ４位点与载体上三个ＡＯＸｌ区：ＡＯＸＩ启动子，ＡＯＸｌ转录终止子（＂ＩＴ）或ＡｏＸｌ下游远侧序列（３’ＡｏＸｌ）中的任～个之问发生单十字交换事件都会形成基因插入。
结果在ＡＯＸｌ或ＡＯＸＩ：：ＡＧＲ４基因的上游或下游插入一个或多个载体。
转化子在ＧＳｌｌ５中为ＨＩＳ＋Ｍｕｔ＋表型，在ＫＭ７１中为ＨＩＳ＋Ｍｕｔｓ表型。
在重组质粒５’或３’ＡＯＸｌ区用限制酶进行线性化，依转化宿主菌的不同，可方便地产生Ｍｕｔ＋或Ｍ酊重组子。
图１．４ｈｉｓ４位点的基因插入Ｆｉｇ．１．４Ｇｅｎｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｔｈｉｓ４在ＧＳｌ１５（Ｍｕｔ＋）或ＫＭ７１（Ｍｕｆｆ）中，染色体上Ｈｉｓ４位点与载体上ＨＩＳ４基因之间发生单十字交换事件后会在ｈｉｓ４位点形成插入。
结果在Ｈｉｓ４位点插入一个或多个载体。
由于基因组—Ｅ彳ＯＸｌ或彳似，？■Ｇ尺４位点未发生重组，这些Ｈｉｓ＋转化子的表型均与亲本菌株相同。
通过ＨＩＳ４基因处限制性内切酶线性化，依转化宿主菌不同，可方便地产生Ｍｕｔ＋或Ｍｕｔ８重组子。
图中显示质粒插入双拷贝ＨＩＳ４／ｈｉｓ４基因。
一个为突变子，另一个为野生型。
图１．５多拷贝基因表达盒的构建Ｆｉｇ．１．５ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＭｕｌｔｉｐｌｅＣｏｐｙＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣａｓｓｅｔｔｅ细胞中单位点多基因插入确实可自发形成，虽然比例低，占所有Ｈｉｓ＋转化子的１－１０％，但却是可测的。
毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺研究
第四军医大学硕士学位论文毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺研究姓名：唐浩申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：陈志南;米力@缩略语表缩略语英文全称中文全称A absorbance 吸光值Ab antibody 抗体AK auto Ab anti-keratin auto antibody 抗角蛋白自身抗体 AOX alcohol oxidase 醇氧化酶bp base pair 碱基对CHO Chinese Hamster Ovary 中国仓鼠卵巢CV column volume 柱体积DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸DO dissolved oxygen 溶解氧Elisa enzyme linked immunosorbentassay酶标记免疫吸附试验Fab antigen-binding fragment 抗原结合片段 FDA food and drug administration 食品与药品管理局 FF fast flow 快速流GA glucoamylase 葡萄糖淀粉酶 HBsAg hepatitis B surface antigen 乙型肝炎表面抗原 HC heavy chain 重链HIC hydrophobic interactionchromatography疏水作用层析HPLC high performance liquidchromatography高效液相色谱HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 IEC ion exchange chromatography 离子交换层析 Kd kilodalton 千道尔顿L liter 升LC light chain 轻链MAb monoclonal antibody 单克隆抗体独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
毕赤酵母高密度发酵产脂肪酶条件的研究
ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ａ ｄ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｏ ． ５ ％ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ（ ｗ ／ ｖ ） ａ ｎ ｄ １ ％ｐ ｅ ｐ ｔ ｏ ｎ ｅ （ ｗ ／ ｖ ） ｉ ｎ ３ ｐ ｏ ｔ ｒ ｉ ｏ ｎ ｓ（ ｏ ｎ ｃ ｅ ｅ ｖ ｅ ｒ ｙ ４ ８ ｈ ｏ ｕ ｒ ｓ ） ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｓ ｉ ｇ ｎ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｎ ｔ ｌ ｙ ｉ ｍ ｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ｐ ａ ｓ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｍａ ｘ ｉ ｍ ｕ ｍ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍ ｅ ａ ｃ —
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２ ． Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ｚ ｈ ￣ｉ ａ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ３ １ ０ ０ １ ４ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
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毕赤酵母高密度发酵产β-甘露聚糖酶的工艺优化
毕赤酵母高密度发酵产β-甘露聚糖酶的工艺优化张晓龙;肖静;王瑞明【摘要】以表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌为研究对象,采用摇瓶发酵确定碳源、接种量、温度、pH基础条件,通过30 L发酵罐高密度发酵,探究菌体浓度、甲醇浓度、甲醇补料方式、溶氧量等条件对目的蛋白产量的影响,并通过正交试验优化发酵工艺条件.结果表明,最佳产酶条件为接种量10％,初始葡萄糖质量浓度30g/L,诱导温度28℃,pH 5.0,溶氧量10％～20％.在此发酵条件下,最终细胞干重135 g/L,目的蛋白表达量5.04 g/L,最高酶活力29 600 U/mL,较优化前提高24倍,已满足工业化要求.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(054)023【总页数】6页(P5978-5983)【关键词】β-甘露聚糖酶;巴斯德毕赤酵母;高密度培养;发酵优化【作者】张晓龙;肖静;王瑞明【作者单位】齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q815β－甘露聚糖酶（β－1，4－D－mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78）是β－1，4 甘露聚糖甘露糖苷水解酶的简称，属于半纤维素酶类，广泛应用于食品、饲料、医药、纺织印染等方面［1］，在饲用酶制剂应用方面尤其重要［2］，添加β－甘露聚糖酶可以降解饲料中含有的β－甘露聚糖，有助于消除甘露聚糖对机体胰岛素分泌和胰岛素样生长因子（IGF）生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收速率，促进碳水化合物代谢过程，提高日粮能量利用率，是一种良好的饲料添加剂，也是抗生素的理想代替品［3］。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统既具有原核表达系统易于培养、繁殖快速、表达量高的优点，又具有真核表达系统外源蛋白翻译后再加工修饰等特点，目前已有超过500种外源蛋白在毕赤酵母中获得成功表达。
毕赤酵母高密度发酵产脂肪酶条件的研究
毕赤酵母高密度发酵产脂肪酶条件的研究徐明;付会兵;刘鹏;钱建阳;求赵明;王浩均;柳志强;郑裕国【摘要】以毕赤酵母基因工程菌为材料,通过单因素试验在15L发酵罐中对发酵的pH、通气量、接种量、搅拌转速及诱导剂的量进行优化;进而对影响明显的因素在700 L发酵罐中进行三因素三水平正交试验,最终确定最佳的发酵条件为:pH为5.0,温度为30℃,转速为250 r/min,接种量为5％,溶氧为20％～30％,诱导剂甲醇的量为129 L,培养时间为160～170 h,在开始诱导后分3次(48 h/次)向发酵液中添加0.5％的酵母膏(w/v)和1％的蛋白胨(w/v)可以显著提高发酵液酶活,酶活可以达到18 U/mL.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2015(044)001【总页数】5页(P33-37)【关键词】脂肪酶;毕赤酵母;正交试验;中试【作者】徐明;付会兵;刘鹏;钱建阳;求赵明;王浩均;柳志强;郑裕国【作者单位】浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014;浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1脂肪酶（EC 3.1.1.3），又称三酰基甘油酰基水解酶，是一类能够催化高级脂肪酸和丙三醇形成脂肪酸甘油酯键或者催化天然底物油脂（三脂酰甘油酯）水解产生脂肪酸和甘油的酶[1]。
目前，脂肪酶被广泛应用于食品、饲料、化工等工业领域[2-3]。
脂肪酶是人们研究最早的酶之一，其广泛存在于原核生物和真核生物中，由于哺乳动物和植物脂肪酶的量较少而且分离纯化难度也较大，而微生物脂肪酶在这方面表现出了很好的优越性[4]，所以微生物脂肪酶自发现后就得到了较深入的研究。
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述发布时间：2021-11-01T06:56:24.297Z 来源：《科学与技术》2021年第21期作者：徐倩[导读] 巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一徐倩（义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司，河南三门峡，472300）摘要：巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶I(Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；发酵工艺成熟，易放大，且培养成本低，产品易分离。
本文根据生产实践经验，就巴斯德毕赤酵母菌株的研究进展、高密度发酵菌株的优选及分离纯化技术进行了总结和综述。
关键词：毕赤酵母、菌株、优选、分离纯化1.前言1.1背景和意义近年来发酵工程迅速崛起，从“乐百氏奶”等乳酸菌饮料，到比黄金还贵的干扰素等药品，都是微生物对人类的无私奉献。
微生物在发酵过程里充当着生产者的角色，这与它的特性密不可分的。
它们对周围环境的温度、压强、酸碱度、干湿条件都有极强的适应力。
发酵的规模越大，批次所需的种子也就越多。
要使小小的微生物在短时间内完成如此巨大的发酵任务，那就必须使菌种扩大培养。
而扩大培养的前提就是必须要有相对数量、相对稳定、代谢旺盛的种子。
菌种纯化是指从菌种的细胞或孢子群体中淘汰衰退的个体，分离出优良的个体，从而保持菌种的纯度和优良的特性。
以巴斯德毕赤酵母为例：近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等。
它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生物催化剂。
酵母表达系统概述及相关研究进展
酵母表达系统的研究进展和前景( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院)摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。
近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。
本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。
关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物引言酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。
在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。
常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。
酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。
其中毕赤酵母（P. pastoris）是继S. cerevisiae之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。
酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。
与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。
重组毕赤酵母产β-甘露聚糖酶的高密度发酵研究
２０２０年７月第３５卷第４期 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＩＧＨＴＩＮＤＵＳＴＲＹ Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．４Ｊｕｌｙ２０２０ 收稿日期：２０２０－０５－２１基金项目：广州市科技计划项目（２０１７１００１０１５４）作者简介：杜少平（１９７４—），男，广东省丰顺县人，广州市微生物研究所高级工程师，主要研究方向为微生物技术与相关检测．通信作者：胡海艳（１９８５—），女，湖南省株洲市人，广州市微生物研究所工程师，主要研究方向为微生物代谢产品利用与微生物防控．引用格式：杜少平，胡海艳，甘祥武，等．重组毕赤酵母产β－甘露聚糖酶的高密度发酵研究［Ｊ］．轻工学报，２０２０，３５（４）：１－７．中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．１２１８７／２０２０．０４．００１文章编号：２０９６－１５５３（２０２０）０４－０００１－０７重组毕赤酵母产β－甘露聚糖酶的高密度发酵研究Ｓｔｕｄｙｏｎｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆβ ｍａｎｎａｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ关键词：β－甘露聚糖酶；毕赤酵母；高密度发酵；发酵调控Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：β ｍａｎｎａｎａｓｅ；Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ；ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ杜少平，胡海艳，甘祥武，黄秀敏，叶俊豪ＤＵＳｈａｏｐｉｎｇ，ＨＵＨａｉｙａｎ，ＧＡＮＸｉａｎｇｗｕ，ＨＵＡＮＧＸｉｕｍｉｎ，ＹＥＪｕｎｈａｏ广州市微生物研究所，广东广州５１０６６３ＧｕａｎｇｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６６３，Ｃｈｉｎａ摘要：通过摇瓶实验，对重组毕赤酵母Ｘ ３３／ｐＧＡＰＺαＡ Ｍａｎ２６Ａ ３９发酵培养基的碳源、氮源进行筛选，并在５０Ｌ发酵罐中采用间歇流加策略，对其发酵条件进行调控，以实现重组毕赤酵母高密度发酵产β－甘露聚糖酶．结果表明：葡萄糖为发酵培养基的最适碳源，其初始添加质量浓度为３０ｇ／Ｌ；初始质量分数为６％的玉米浆作为发酵培养基的氮源较为适宜；在间歇补料发酵调控中，通过间歇流加体积分数为２５％的氨水、质量分数为５０％的葡萄糖溶液和质量分数为２０％的玉米浆，可使发酵液ｐＨ值维持在５．０～５．５之间，且保证发酵培养基的碳源、氮源充足；发酵６０ｈ时采取放罐措施，此时酶活力可达２６８５．５Ｕ／ｍＬ，菌体质量浓度达３３１．１ｇ／Ｌ，ＯＤ６００达３０２．８，实现了β－甘露聚糖酶的高效表达．·１· ２０２０年７月第３５卷第４期Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｆｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＸ ３３／ｐＧＡＰＺαＡ Ｍａｎ２６Ａ ３９ｆｅｒ ｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｓｈａｋｅｆｌａｓｋｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ａｎｄｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎａ５０Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒｂｙｕｓｉｎｇｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔｆｅｅｄｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙ，ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｒｅａｌｉｚｅｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｓｔｉｔｕ ｔｉｖｅＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅβ ｍａｎｎａｎａｓｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｇｌｕｃｏｓｅｗａｓｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄｉｔｓｉｎｉｔｉａｌｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ３０ｇ／Ｌ；ｃｏｒｎｓｙｒｕｐｗａｓｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ，ａｎｄｉｔｓｉｎｉｔｉａｌｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｗａｓ６％；ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔｆｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｏｆｂａｃｔｅｒｉａｃｏｕｌｄｂｅｍａｉｎｔａｉｎｅｄｂｅｔｗｅｅｎ５．０～５．５ｂｙｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔｆｌｏｗａｄｄｉｎｇ２５％ａｍｍｏｎｉａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，５０％ｇｌｕｃｏｓｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄ２０％ｃｏｒｎｓｙｒｕｐ，ａｎｄｍａｋｅｓｕｒｅｔｈｅｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｆｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉ ｕｍｗｅｒｅｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ；ａｆｔｅｒ６０ｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｏｏｋｍｅａｓｕｒｅｓｔｏｐｕｔｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｒｔａｎｋ，ａｔｔｈｉｓｔｉｍｅ，ｔｈｅｍａｘｉ ｍｕｍｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ２６８５．５Ｕ／ｍＬ，ｔｈｅｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｒｅａｃｈｅｄ３３１．１ｇ／Ｌ，ａｎｄｔｈｅＯＤ６００ｒｅａｃｈｅｄ３０２．８，ｗｈｉｃｈａｃｈｉｅｖｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆβ ｍａｎｎａｎａｓｅ．０ 引言甘露聚糖作为半纤维素的第二大组分［１－２］，广泛存在于各种植物组织中［３］．甘露聚糖是籽实类植物细胞壁的主要组成成分，在豆粕、芝麻粕、油菜籽粕等常用饲料原料中含量丰富．甘露聚糖在单胃动物的消化道内会呈凝胶状，使消化道内容物具有较强的黏性，从而影响单胃动物对营养物质的消化吸收，最终影响单胃动物的生长和饲料的利用率［４］．β－甘露聚糖酶能够水解甘露聚糖类有机物，将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖等多糖降解为甘露寡糖等低聚糖，消除甘露聚糖对单胃动物消化道内各种营养物质的抗营养作用．同时，生成的甘露低聚糖不仅对促进单胃动物的生长起着重要作用，而且具有促进单胃动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖、改善肠道内菌群结构、排除体内毒素、增强机体免疫防御能力等多种功能，已被广泛应用于饲料、医药、食品、精细化工等领域［５－６］．由于单胃动物摄食和饲料加工的特殊需求，业界要求应用于饲料生产的工业用β－甘露聚糖酶具有耐热、耐酸和高酶活力的特性，因此，如何获得产耐热、耐酸且酶活力较高的β－甘露聚糖酶的菌株成为研究热点［７－８］．由于大多数β－甘露聚糖酶在原始菌株中表达较低，利用基因工程菌毕赤酵母进行表达以提高β－甘露聚糖酶的产量是目前普遍采用的方法．本研究团队前期以β－甘露聚糖酶的成熟肽序列为对象，根据毕赤酵母密码子偏爱性，人工设计合成了该酶的基因，以毕赤酵母Ｘ ３３为宿主菌，选用ＧＡＰ启动子，构建了能高效表达的重组工程菌株，再通过易错ＰＣＲ对β－甘露聚糖酶进行定向突变和筛选，获得产耐热、耐酸且酶活力较高的β－甘露聚糖酶的突变菌株，即含有β－甘露聚糖酶基因的重组毕赤酵母Ｘ ３３／ｐＧＡＰＺαＡ Ｍａｎ２６Ａ ３９．鉴于目前鲜见具有耐热、耐酸和高酶活力的β－甘露聚糖酶工业化量产的相关报道［９］，本文在前期实验的基础上，拟通过摇瓶实验进一步筛选重组毕赤酵母Ｘ ３３／ｐＧＡＰＺαＡ Ｍａｎ２６Ａ ３９的碳源、氮源，确定５０Ｌ发酵罐中的发酵调控策略，以获得β－甘露聚糖酶的高密度发酵工业化量产工艺，实现重组毕赤酵母高密度发酵表达β－甘露聚糖酶，为β－甘露聚糖酶的工业化生产提供参考．１ 材料与方法１．１ 材料与仪器１．１．１ 菌种与试剂 菌种：重组毕赤酵母Ｘ ３３／ｐＧＡＰＺαＡ Ｍａｎ２６Ａ ３９（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ２６Ａ ３９），由广州市微生物研究所实验室保存．主要试剂：β－甘露聚糖酶，美国Ｓｉｇｍａ公·２·杜少平，等：重组毕赤酵母产β－甘露聚糖酶的高密度发酵研究司产；酵母提取物、蛋白胨，湖北安琪酵母股份有限公司产；玉米浆，山东康源生物科技有限公司产；博莱霉素（Ｚｅｏｃｉｎ），美国Ｉｎｔｉｔｒｏｇｅｎ公司产；其他试剂，均为国产分析纯或生化试剂．１．１．２ 培养基 斜面培养基（ＹＰＤ培养基）：葡萄糖２０ｇ，蛋白胨２０ｇ，酵母提取物１０ｇ，琼脂粉２０ｇ，去离子水定容至１０００ｍＬ．ＹＰＤＳ培养基：在ＹＰＤ培养基中添加质量浓度为２００μｇ／ｍＬ的Ｚｅｏｃｉｎ．ＰＴＭ１溶液：ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ６．０ｇ，ＮａＩ０．０８ｇ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ３．０ｇ，Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ０．２ｇ，Ｈ３ＢＯ３０．０２ｇ，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ＺｎＣｌ２２０．０ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ６５．０ｇ，体积分数为９８％的Ｈ２ＳＯ４５．０ｍＬ，去离子水定容至１０００ｍＬ．ＢＳＭ培养基［８］：葡萄糖２０ｇ，质量分数为８５％的Ｈ３ＰＯ４２６．７ｍＬ，ＫＯＨ４．１３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４４ｇ，ＣａＣｌ２０．３８ｇ，Ｋ２ＳＯ４１８．２ｇ，ＭｇＳＯ４·２Ｈ２Ｏ１４．９ｇ，ＣａＳＯ４·２Ｈ２Ｏ０．９３ｇ，ＰＴＭ１溶液４ｍＬ，去离子水定容至１０００ｍＬ．种子培养基（改良的ＢＳＭ培养基）：葡萄糖２０ｇ，酵母提取物３ｇ，蛋白胨３ｇ，质量分数为８５％的Ｈ３ＰＯ４２７ｍＬ，ＣａＳＯ４４ｇ，Ｋ２ＳＯ４２０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１５ｇ，ＫＯＨ４ｇ，ＰＴＭ１溶液０．４５ｍＬ，调ｐＨ值为５．０，去离子水定容至１０００ｍＬ．碳源选择培养基：（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４５ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４ｇ，Ｋ２ＳＯ４４ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ０．２ｇ，另在其中添加质量浓度分别为２０ｇ／Ｌ，２５ｇ／Ｌ，３０ｇ／Ｌ，３５ｇ／Ｌ，４０ｇ／Ｌ的葡萄糖或甘油作为碳源，生物素１ｍｇ，消泡剂０．２５ｍＬ，ＰＴＭ１溶液４．３ｍＬ，消泡后调ｐＨ值为５．３～５．４，去离子水定容至１０００ｍＬ．氮源选择培养基：（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４５ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４ｇ，Ｋ２ＳＯ４４ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ０．２ｇ，另在其中添加质量分数分别为２％，４％，６％的棉籽粉、豆粉或玉米浆作为氮源，生物素１ｍｇ，消泡剂０．２５ｍＬ，ＰＴＭ１溶液４．３ｍＬ，消泡后调ｐＨ值为５．３～５．４，去离子水定容至１０００ｍＬ；ＢＳＭ培养基；ＹＰＤ培养基．发酵培养基：葡萄糖３０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４５ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４ｇ，Ｋ２ＳＯ４４ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ０．２ｇ，生物素１ｍｇ，消泡剂０．２５ｍＬ，ＰＴＭ１溶液０．４５ｍＬ，去离子水定容至１０００ｍＬ．营养盐溶液：（ＮＨ４）２ＳＯ４１００ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１００ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ７０ｇ，去离子水定容至１０００ｍＬ．发酵补料流加液配方：Ｖ（质量分数为５０％的葡萄糖溶液） Ｖ（营养盐溶液）＝１０ １．以上培养基于１２１℃条件下灭菌２０ｍｉｎ，其中，葡萄糖、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ单独灭菌，生物素经过滤膜除菌后添加，ＰＴＭ１溶液于添加消泡剂后加入．１．１．３ 仪器与设备 ＬＲＨ－２５０型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产；ＤＨＺ－ＤＡ型水平摇床，江苏太仓市实验设备厂产；ＰＨＳ－３Ｃ型ｐＨ计、７５２Ｎ型紫外分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司产；ＳＭＡＲＴ型显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司产；５４２７Ｒ型高速低温离心机，德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产．１．２ 实验方法１．２．１ 菌种活化与种子液的制备方法 将毕赤酵母Ｘ ３３／ｐＧＡＰＺαＡ Ｍａｎ２６Ａ ３９菌种转接入ＹＰＤＳ培养基平板中，于２８℃条件下培养３ｄ；挑取平板培养基上较大的单菌落，接入ＹＰＤ液体培养基装液量为５ｍＬ的５０ｍＬ摇瓶中，于３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养至ＯＤ６００为２．０左右，再转接至种子培养基中，于２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养至ＯＤ６００为４．０～６．０；最后进行镜检，若视野中的毕赤酵母菌饱满、均匀、单个或两个成串，则此时的种子培养液可以作为发酵种子液备用．·３· ２０２０年７月第３５卷第４期１．２．２ 培养基碳源的筛选方法 将种子液分别转接至添加了葡萄糖或甘油的碳源选择培养基中，接种量为２％，装液量为１００ｍＬ（５００ｍＬ摇瓶），于３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养７２ｈ，每隔１２ｈ取样，测试其酶活力．１．２．３ 培养基氮源的筛选方法 将种子液分别转接至添加了棉籽粉、豆粉或玉米浆的氮源选择培养基和ＢＳＭ培养基中，以ＹＰＤ培养基为对照．接种量为２％，装液量为１００ｍＬ（５００ｍＬ摇瓶），于３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养７２ｈ，每隔１２ｈ取样，测试其酶活力．１．２．４ 间歇补料发酵调控方法 发酵条件：将种子液转接至５０Ｌ发酵罐中，接种量为１０％，通气量为１．１～１．５ｖｖｍ，溶氧３０％～８０％，用体积分数为２５％的氨水维持发酵液ｐＨ值为５．０～５．５，发酵培养基的初始体积为２０Ｌ．间歇补料发酵调控：当菌株开始生长后，溶氧会降低，此时间段为１０～１４ｈ．待葡萄糖质量分数降至１％后，开始流加质量分数为５０％的葡萄糖溶液（含ＰＴＭ１溶液），并保持葡萄糖在１％～３％之间，且每次补料葡萄糖后可保持残糖质量浓度为２ｇ／Ｌ；待玉米浆质量分数降至４％后，开始流加质量分数为２０％的玉米浆（含ＰＴＭ１溶液），并保持玉米浆在４％～８％之间．保持溶氧在２０％以上，当溶氧低于２０％时，可通过加大转速、降低温度、降低菌株的比生长速率等，待溶氧恢复后继续进行发酵补料流加．１．２．５ 测试方法 菌体质量浓度测定：采用湿重法，取１０ｍＬ发酵液，于９０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ，弃去上清液，称菌体湿重．酶活力测定［７］：将４５℃，ｐＨ值为５．０的条件下，每ｍｉｎ水解底物产生１μｍｏＬ甘露聚糖所需的酶量定义为１个酶活力单位（Ｕ／ｍＬ）．取直径为１５ｍｍ的１５ｍＬ的洁净刻度试管，分别标记空白组、对照组、测试组，分别加入１．５ｍＬ质量分数为０．５％的甘露聚糖溶液（ｐＨ值为５．０）作为底物，于４５℃水浴预热５ｍｉｎ；仅在测试组中加入稀释适当倍数的０．５ｍＬβ－甘露聚糖酶液（已预热），在４５℃水浴下反应１０ｍｉｎ，反应期间需间歇轻轻摇晃均匀，１０ｍｉｎ后立即分别加入２ｍＬＤＮＳ溶液终止反应；仅在对照组中加入０．５ｍＬβ－甘露聚糖酶液，立即置于沸水中煮沸１５ｍｉｎ进行显色反应后，迅速用冰水或者流水冷却至室温，再用蒸馏水定容至１５ｍＬ，颠倒混匀；以空白组为基准调零，在分光光度计５４０ｎｍ波长处测定其吸光度值．还原糖测定［１０］：采用ＤＮＳ法，ＤＯ值、ｐＨ值等由探头直接读取．２ 结果与分析２．１ 培养基碳源的筛选结果分析与乙醇氧化酶ＡＯＸ１启动子仅能靠甲醇诱导表达不同，ｐＧＡＰ（三磷酸甘油醛脱氢酶启动子）重组表达选用ＧＡＰ启动子可以利用甘油、葡萄糖、甲醇为碳源．本实验在摇瓶中重点比较了不同碳源（甘油和葡萄糖）对β－甘露聚糖酶表达的影响，结果如图１所示．由图１可以看出，重组毕赤酵母在利用甘油与葡萄糖高密度发酵产β－甘露聚糖酶的差异不明显，但在达到酶活力高峰值时，葡萄糖的质量浓度为２５ｇ／Ｌ，甘图１ 不同碳源对β－甘露聚糖酶表达的影响Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎβ ｍａｎｎａｎａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ·４·杜少平，等：重组毕赤酵母产β－甘露聚糖酶的高密度发酵研究油质量浓度为３０ｇ／Ｌ．虽然葡萄糖对β－甘露聚糖酶表达的影响稍低于甘油，但性价比却优于甘油．综合考虑，选择葡萄糖作为培养基的碳源较为适宜．不同初始葡萄糖质量浓度对菌体生长的影响如图２所示．由图２可以看出，菌体在前３６ｈ基本都以指数形式快速增长，３６ｈ后增长较为平缓．不同初始葡萄糖质量浓度下菌体的生长动力学参数见表１．由表１可知，当添加质量浓度为２５～３０ｇ／Ｌ的葡萄糖时，最大细胞生产强度较高，能够以较快的速度产生菌体．而在重组毕赤酵母发酵生产中，补料流加前需要进行一段分批发酵，使菌体生长达到后续补料流加工图２ 不同初始葡萄糖质量浓度对菌体生长的影响Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｉｔｉａｌｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｂａｃｔｅｒｉａ表１ 不同初始葡萄糖质量浓度下菌体的生长动力学参数Ｔａｂｌｅ１ Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｉｔｉａｌｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ初糖质量浓度／（ｇ·Ｌ－１）残糖质量浓度／（ｇ·Ｌ－１）最大菌体质量浓度／（ｇ·Ｌ－１）达到最大生物量的时间／ｈ最大细胞生产强度／（ｇ·Ｌ－１·ｈ－１）细胞平均产率／（ｇ·ｇ－１）２０１．５９５２．０１３６１．４４２．８３２５１．７７５７．５６３６１．６０２．４８３０２．０５６０．２１３６１．６７２．１５３５２．３０５５．９７４８１．１７１．７１４０２．５１５９．３８６００．９９１．５８艺所需的菌体质量浓度．综合考虑，选择初始葡萄糖质量浓度为３０ｇ／Ｌ．２．２ 培养基氮源的筛选结果分析不同氮源对β－甘露聚糖酶表达的影响如图３所示．由图３可以看出，因ＹＰＤ培养基中有蛋白胨和酵母提取粉作为氮源，故其对重组毕赤酵母高密度发酵产β－甘露聚糖酶的影响最显著，酶活力可达４２０Ｕ／ｍＬ；ＢＳＭ培养基由于缺乏氮源，酶活力仅为６０Ｕ／ｍＬ；添加不同质量分数的棉籽粉、豆粉或玉米浆均能促进细胞产酶，但酶活力均低于ＹＰＤ培养基，其中，当添加质量分数为６％的玉米浆时，可以较好地促进β－甘露聚糖酶的表达，此时酶活力可达３５２Ｕ／ｍＬ，是ＹＰＤ培养基酶活力的８４％．考虑到玉米浆相对于蛋白胨和酵母提取粉作为氮源更为廉价，故在下一步的间歇补料发酵调控中，选择初始质量分数为６％的玉米浆作为培养基的氮源．２．３ 间歇补料发酵调控结果分析基于现有生产设备条件，间歇补料发酵仍是业界经常采用的补料策略．重组毕赤酵母间歇补料发酵曲线如图４所示．由图４可以看出，发酵过程中，酶活力由５．０Ｕ／ｍＬ一直增至２６８５．５Ｕ／ｍＬ，在发酵的前１２ｈ，酶活力基本保图３ 不同氮源对β－甘露聚糖酶表达的影响Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎβ ｍａｎｎａｎａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ·５· ２０２０年７月第３５卷第４期持稳定，１２ｈ后开始急速增加，５４ｈ后增长趋缓；菌体质量浓度由１１．２ｇ／Ｌ一直增至３３１．１ｇ／Ｌ，在发酵的前１４ｈ，菌体质量浓度基本保持稳定，１４ｈ后迅速增加，４０ｈ后基本保持稳定；ＯＤ６００由初始的２．１增加到３０２．８，在发酵的前１２ｈ，ＯＤ６００基本保持不变，随后一直保持增加的趋势．间歇补料发酵罐上的监测指标如图５所示．由图５可以看出，溶氧由开始发酵时的８６％一直减少到１３％，在发酵的前２２ｈ，溶氧均控制在３０％以上，而在发酵的２４～４８ｈ内基本能控制在２０％左右，此时发酵罐的通气量达到最大值２５００Ｌ／ｍｉｎ，转速达到３５０ｒ／ｍｉｎ．开始发酵时，葡萄糖质量分数约为３％，１０ｈ时降到１％，到１８ｈ时，葡萄糖消耗过快，开始流加质量分数为５０％的葡萄糖溶液，使其基本维持在１％～３％，同时，间歇补加２０％的玉米浆，以保证发酵培养基的碳源、氮源充足．通过流加体积分数为２５％的氨水，可使ｐＨ值维持在５．０～５．５，但发酵末期ｐＨ值有上升的趋势，最终升至５．７．由于发酵过程中溶氧降低，且发酵体积近３５Ｌ，体积较大，不利于继续高密度发酵和间歇流加营养物质，故在发酵６０ｈ时采取了放罐措施，此时酶活力达２６８５．５Ｕ／ｍＬ，菌体质量浓度达３３１．１ｇ／Ｌ，ＯＤ６００达３０２．８．３ 结论本文在前期筛选获得产耐热、耐酸且酶活力较高的β－甘露聚糖酶的突变菌株重组毕赤图４ 间歇补料发酵曲线Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅｃｕｒｖｅｏｆｉｎｔｅｒｍｉｓｓｉｏｎｆｅｄ ｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ图５ 间歇补料发酵罐上的监测指标Ｆｉｇ．５ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｏｆｉｎｔｅｒｍｉｓｓｉｏｎｆｅｄ ｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｒ·６·杜少平，等：重组毕赤酵母产β－甘露聚糖酶的高密度发酵研究酵母Ｘ ３３／ｐＧＡＰＺαＡ Ｍａｎ２６Ａ ３９基础上，通过摇瓶实验，重点比较了不同碳源、不同氮源对重组毕赤酵母发酵产β－甘露聚糖酶的影响，并在５０Ｌ发酵罐中采用间歇流加策略对发酵条件进行调控，结果表明，葡萄糖更适合作为发酵培养基的碳源，且其初始最适质量浓度为３０ｇ／Ｌ；初始质量分数为６％的玉米浆作为发酵培养基的氮源较为适宜；在间歇补料发酵调控中，通过间歇流加体积分数为２５％的氨水、质量分数为５０％的葡萄糖溶液和质量分数为２０％的玉米浆，可使发酵液ｐＨ值维持在５．０～５．５，且保证发酵培养基的碳源、氮源充足；在发酵６０ｈ时采取放罐措施，此时最大酶活力可达２６８５．５Ｕ／ｍＬ，菌体质量浓度达３３１．１ｇ／Ｌ，ＯＤ６００达３０２．８，实现了重组毕赤酵母高密度发酵产β－甘露聚糖酶．本研究可为β－甘露聚糖酶工业化生产提供参考，对满足单胃动物摄食和饲料加工的特殊需求，进而推动饲料、食品等领域相关产品的研发具有重要意义．参考文献：［１］ ＳＣＨＥＬＬＥＲＨＶ，ＵＬＶＳＫＯＶＰ．Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１０，６１：２６３．［２］ ＳＴ?ＬＢＲＡＮＤＨ，ＳＩＩＫＡＡＨＯＭ，ＴＥＮＫＡＮＥＮＭ，ｅｔａｌ．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏβｍａｎｎａｎａｓｅｓｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３，２９（３）：２２９．［３］ ＫＡＮＳＯＨＡＬ，ＮＡＧＩＥＢＺＡ．ＸｙｌａｎａｓｅａｎｄｍａｎｎａｎａｓｅｅｎｚｙｍｅｓｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓＮＲａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｉｎｂｉｏｂｌｅａｃｈｉｎｇｏｆｓｏｆｔｗｏｏｄｋｒａｆｔｐｕｌｐ［Ｊ］．ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｏｎｈｏｅｋ，２００４，８５（２）：１０３．［４］ ＮＵＮＥＳＣＳ，ＭＡＬＭＬ?ＦＫ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｕａｒｇｕｍａｎｄｃｅｌｌｕｌｏｓｅｏｎｇｌｕｃｏｓｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｈｏｒｍｏｎａｌｒｅｌｅａｓｅａｎｄｈｅｐａｔｉｃｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｔｈｅｐｉｇ［Ｊ］．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９９２，６８（３）：６９３．［５］ ＢＨＡＴＭＫ．Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｅｎｚｙｍｅｓｉｎｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ，２０００，１８（５）：３５５．［６］ 熊进，黄魁英，夏枫耿，等．耐高温β－甘露聚糖酶Ｍ２７－８菌株发酵条件的优化［Ｊ］．中国饲料，２０１７，１９：１３．［７］ 吴秀秀，吕晓慧，胡亚冬，等．耐高温耐酸稳定假密环菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａｔａｂｅｓｃｅｎｓ）ＭＡＮ４７β－甘露聚糖酶体外分子定向进化［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１２，３２（３）：８３．［８］ ＺＨＡＯＷ，ＺＨＥＮＧＪ，ＺＨＯＵＨＢ，ｅｔａｌ．Ａｔｈｅｒ ｍｏｔｏｌｅｒａｎｔａｎｄｃｏｌｄ ａｃｔｉｖｅｍａｎｎａｎｅｎｄｏ １，４ βｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＣＢＳ５１３．８８：Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０２：７５３８．［９］ ＺＨＥＮＧＪ，ＺＨＡＯＷ，ＧＵＯＮ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔｏｆａｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｍｅｄｉｕｍａｎｄａｎｏｖｅｌｆｅｄｂａｔｃｈｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔβ ｍａｎａｎａｓｅｂｙＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，１１８：２５７．［１０］赵凯，许鹏举，谷光烨．３，５－二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（８）：５３４．·７·。
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。
而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。
我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。
［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。
毕赤酵母高密度发酵研究进展
毕赤酵母高密度发酵研究进展
李洪淼;王红宁;许钦坤
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2005(16)2
【摘要】巴斯德毕赤酵母表达系统是近年发展起来的一种优秀的真核表达系统.本文从培养基、温度、pH值、溶氧、甲醇的流加等角度对国内外毕赤酵母高密度发酵的研究进展做了较详细的综述,并提出了目前毕赤酵母高密度发酵过程中存在的问题.
【总页数】3页(P210-212)
【作者】李洪淼;王红宁;许钦坤
【作者单位】四川农业大学,动物科技学院,四川,雅安,625014;四川农业大学,动物科技学院,四川,雅安,625014;四川农业大学,动物科技学院,四川,雅安,625014
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高密度发酵研究进展 [J], 闵兆升;郭会明;颜旭;洪厚胜
2.毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展 [J], 夏姗;武福军;赵洪亮;薛冲;刘志敏
3.重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵 [J], 魏春;任郑;吴涛;钱晓芬;孙杰;汪钊
4.重组毕赤酵母产β-甘露聚糖酶的高密度发酵研究 [J], 杜少平;胡海艳;甘祥武;黄
秀敏;叶俊豪
5.重组毕赤酵母产β-甘露聚糖酶的高密度发酵研究 [J], 杜少平;胡海艳;甘祥武;黄秀敏;叶俊豪
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毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究
毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究刘振云;沈露;解凤立;谭树华【期刊名称】《东南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(30)5【摘要】目的:对毕赤酵母高密度表达重组抑肽酶的发酵工艺进行探讨.方法:先通过摇瓶培养方法,确定表达抑肽酶的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方.在此基础上,采用分批补料培养方法,对毕赤酵母pSA/GS115进行高密度发酵.紫外吸收法测定重组抑肽酶竞争性抑制胰蛋白酶对底物BAEE的水解活性.结果:BSM培养基中毕赤酵母生长必需的最佳配方为甘油40 g·L-1、氨水单次补加量0.1%、甲醇流加量1%.经过毕赤酵母高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为37.08 mg·L-1,目的蛋白活性达到4 450 BAEEU·ml-1,比摇瓶培养表达提高了8倍.结论:本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,其发酵产物具有较高的生物活性,为下一步大规模化制备抑肽酶奠定了基础.%Objective: To evaluate the fermentation process of high-density expressed recombinant aprotinin by Pichia pastoris. Methods: The most optimal formulation of BSM medium for Pichia pastoris to grow using flask culture methods were determined. Based on the study of fermentation in shake flask, the optimal conditions were used for scaling up in 7 L fermentor. Engineering bacteria pSA/GS115 was fermented in fed-batch high density fermentation. The biological activity was determined by ultraviolet absorption assay, and the recombinant aprotinin competitively inhibited the hydrolytic activity of trypsin against substrate BAEE. Results: The best technological parametersof fermentation to BSM medium were glycerol 40 g·L-1, ammonia water 0. 1％ , methanol 1％.Afterbeing optimized, the yield of protein could reach up to 37. 08 mg·ml -1 . The biological activity determined was 4 450 BAEEU·ml-1, 8 folds higher compared to that of shaking flask. Conclusion: The engineering bacteria is successfully fermented in fed-batch high-density fermentation and fermentation produce has a high biological activity, which established a foundation for the large-scale production of aprotinin.【总页数】5页(P744-748)【作者】刘振云;沈露;解凤立;谭树华【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学,药物分析教研室,江苏,南京,21009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6;TQ925.9【相关文献】1.重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化 [J], 马娇颖;章成昌;仇黎鹏;姜玉涛;闫璐颖;陈菁;陈建华2.猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵 [J], 蓝胜芝;于瑞嵩;俞明月;董世娟;曹祥荣;李震3.重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达 [J], 王天成;徐国宾;夏铁安4.重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵 [J], 魏春;任郑;吴涛;钱晓芬;孙杰;汪钊5.产鸡α干扰素的毕赤酵母菌高密度发酵工艺研究 [J], 曹丁; 李学优; 肖宏艳; 昝继清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。