质粒DNA的提取
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
质粒dna的提取步骤
质粒dna的提取步骤质粒DNA的提取步骤质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌中自主复制。
质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯化质粒。
在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。
材料和试剂：1.细菌培养物2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）4.醇5.异丙醇6.以太7.加拿大CFII列的紫外灯8.恒温振荡器步骤：1.收集培养物将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。
通过离心将细胞沉淀到离心管底部。
2.细胞溶解添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破细胞壁。
将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。
3.移除细胞碎片离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至另外的离心管。
4.蛋白酶K处理向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。
5.沉淀DNA的制备离心管离心2分钟，然后将上清倒出。
沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。
离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。
6.沉淀物最佳溶解将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥发。
将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。
7.检测提取的DNA通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。
通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。
质粒DNA的提取
4. 向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不 应超过5min，以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，应减 少菌体量。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大 影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降 低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率，可将得到的 溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，1200rpm离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。
7.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW (请先检查是否已加入无水乙醇)12,000 rpm 离 心30-60s，倒掉收集管中的ห้องสมุดไป่ตู้液，将吸附柱CP3放入收集管中。 8. 重复操作步骤7。 9. 将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm离心2 min，目的是将吸附柱中残余的 漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留 乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离 心管中。
5.向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色 絮状沉淀。12,000 rpm 离心10 min。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取方案一常规小量提取(碱裂解法)【实验目的】(1)掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理及操作过程。
(2)掌握微量加样器的使用方法。
【实验原理】在NaOH存在的碱性环境(pH值12.0～12.6)中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA由于分子量小且缠绕紧密，仍为自然状态。
将pH值调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复可溶状态的。
通过离心，去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质等物质，上清液中的质粒DNA可用酚/氯仿抽提。
【实验试剂】(1)溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH值8.0)10mmol/LEDTA(pH值8.0)溶液I可成比配制，每瓶约100ml,在6.9×10°Pa(10lbf/in²)高压下蒸汽灭菌15min,贮存于4℃下。
(2)溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS(3)溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml(4)酚(pH值7.8～8.0)。
(5)氯仿。
(6)TE缓冲液。
(7)6×DNA上样缓冲液。
(8)0.8%琼脂糖。
(9)无水乙醇。
【实验器材】(1)低温高速离心机。
(2)旋涡振荡器。
(3)Eppendorf管(EP管)。
(4)微量移液器。
(5)移液器头。
(6)电泳仪与电泳槽。
(7)紫外透射仪。
【实验样本】细菌(含某种质粒)。
【实验步骤】(1)将5ml菌液分次装入同一1.5mlEP管中，3000r/min离心5min,以收集菌体。
(2)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡5min。
(3)加200μl新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不可强烈振荡，放置于冰上3min左右。
实验四 质粒DNA的提取
实验四质粒DNA的提取、电泳检测和酶切一、实验目的学会用碱裂解法小量制备质粒DNA。
二、实验原理质粒DNA是存在于细菌中的环状小分子DNA，不同于长链大分子的基因组DNA，游离于细胞质中。
由于细胞中的RNA可以被降解，大分子DNA可与细胞碎片一起沉淀而与质粒DNA分离。
质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。
本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。
其原理为：在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时，生成不溶的PDS, 这些复合物从溶液中沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNA酶（RNAase）消除。
再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。
三、实验材料含有质粒pUC19的大肠杆菌菌株DH5a。
四、实验器具、药品试剂A、实验材料：•DH5a受体菌•pUC19B、实验仪器•高压灭菌锅•超净工作台•恒温摇床取•台式离心机(冷冻或非冷冻式)•旋涡振荡器•电泳仪•凝胶成像系统•培养用试管•量筒•冰盒•微量取液器（2ul，20ul，150ul，1000ul）•吸管头若干（2ul，20ul，150ul，1000ul）•EP管若干•一次性手套若干C、溶液药品：•LB培养基•氨苄青霉素(Amp,100 mg/ml)•20%SDS• 4 M NaOH•3M NaAc (pH5.2)•异丙醇•TE缓冲液(pH8.0)•RNAase A(10 mg/ml)•70%乙醇•无水乙醇•75％乙醇，•NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)，•Eco R I及Dra I（Dra II？）限制性核酸内切酶（TaKaRa），•Eco RI酶解缓冲液(10×H buffer)•10%琼脂糖•电泳缓冲液•EB染色液•溶液I－GET缓冲液：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25 mMTris-HCl pH8.0。
提取质粒dna的方法
提取质粒dna的方法提取质粒DNA的方法是一种从生物样品中提取DNA的方法，用于分析基因组学、遗传学或其他基因相关的研究。
它是所有DNA技术的基础。
提取质粒DNA的方法主要包括三个步骤：破解细胞壁、提取DNA片段和提取DNA片段。
第一步，破解细胞壁。
为了提取细胞内的DNA，必须先破坏细胞壁。
这一步可以通过使用植物激素、酶和其他破坏细胞壁的物质来完成。
第二步，提取DNA片段。
在破坏细胞壁之后，生物样品中的DNA就可以从细胞内被提取出来。
这一步通常是将样品加入一定的溶液，如洗涤溶液，然后用放大器去提取DNA片段。
第三步，提取DNA片段。
在提取DNA片段之后，必须对其进行纯化处理，以便提取的DNA片段不会受到其他物质的干扰。
一般情况下，这一步是通过使用离心机将DNA 片段从溶液中分离出来，然后用水冲洗去除其他物质，最后得到纯净的DNA片段。
提取质粒DNA的方法也可以用来提取植物细胞内的DNA。
与提取动物细胞中的DNA不同，植物细胞内的DNA要更加困难，因为植物细胞周围可能有多层细胞壁，而这些细胞壁很难被破坏。
因此，植物细胞内的DNA提取一般都是采用化学方法，即使用碱性有机溶液，以破坏细胞壁，然后再用放大器提取DNA片段。
此外，还有一些无细胞DNA提取的方法，如PCR法、小RNA测序、质粒提取等。
PCR法是用来检测和检验DNA的一种技术，可以扩增微量DNA，从而获取充足的DNA材料进行检测。
小RNA测序是一种新型的基因测序技术，可以检测植物和动物体内特定的RNA，检测特定靶基因的表达。
最后，质粒提取是一种从生物样品中提取DNA质粒的技术，可以用于分子生物学研究，如基因克隆、DNA测序等。
总之，提取质粒DNA的方法是一种常用的DNA提取技术，也是所有DNA技术的基础。
它可以用于从动物和植物样品中提取DNA片段，以及从无细胞DNA中提取DNA质粒，以用于各种基因组学、遗传学和分子生物学研究。
质粒dna的提取
质粒DNA的提取1. 引言质粒DNA提取是在分子生物学研究中常用的实验操作之一。
质粒是一类圆环状的DNA分子，存在于原核生物中。
质粒DNA提取的目的是为了获取纯度高的DNA样品，以便进行后续的实验操作，如聚合酶链式反应（PCR）、限制性酶切、测序等。
2. 实验材料在进行质粒DNA提取实验前，需要准备以下实验材料：•细菌培养液：含有所需质粒的培养液。
•碱裂解液：用于裂解细胞并释放质粒DNA的实验液。
•高盐含量的溶液：用于提取DNA。
•蛋白酶K：用于消化蛋白质。
•硅胶粉末：用于吸附DNA。
•乙醇：用于沉淀DNA。
•TE缓冲液：用于溶解和储存提取的质粒DNA。
3. 实验步骤3.1 细菌培养与收获首先，需进行细菌培养和收获，以获取含有所需质粒的培养液。
培养液中的细菌应为含有目标质粒的菌株，如大肠杆菌。
3.2 细胞破碎与质粒DNA释放将收获的细菌培养液进行离心，去除培养液并沉淀细胞。
然后将细胞重悬于碱裂解液中，用震荡器在适当的温度和时间条件下裂解细胞，释放质粒DNA。
3.3 蛋白质消化为了去除细胞中的蛋白质，加入适量的蛋白酶K，进行蛋白消化。
消化的时间和温度应根据实验要求进行调整。
蛋白消化完成后，通过离心将蛋白质沉淀分离。
3.4 DNA提取将消化液中的DNA溶液转移到其它离心管中，并加入高盐含量的溶液。
通过离心将DNA与其他杂质分离。
此步骤中，DNA会被溶液中的硅胶粉末吸附，以去除杂质。
3.5 DNA沉淀将去除杂质的DNA溶液转移到新的离心管中，加入冰冷的乙醇。
通过离心，将沉淀的DNA分离出来。
注意，在沉淀过程中，应避免DNA的过度离心，以免损坏DNA分子。
3.6 DNA溶解和储存将DNA沉淀后，溶解在适量的TE缓冲液中。
TE缓冲液具有适当的pH值和离子浓度，能够稳定DNA分子，并提供良好的保存条件。
4. 实验注意事项在质粒DNA提取实验中，需要注意以下几点：•操作过程应严格遵守无菌操作，避免外源性DNA的污染。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
生物学实验 质粒DNA的提取
实验8 质粒DNA的提取（碱裂解法）一、实验目的了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。
二、实验原理碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。
碱性（pH 12.0~12.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。
当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。
三、仪器设备微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。
振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。
四、实验试剂（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。
4 ℃贮存。
（2）溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。
（3）溶液Ⅲ（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。
（4）RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。
五、实验方法（1）分装3 mL LB液体培养基和3 μL氨苄青霉素（50 mg/mL）于15 mL玻璃试管中。
（2）用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入玻璃管内，置37 ℃恒温摇床中以200转/min培养，至OD600=2.0。
质粒DNA的提取
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会 导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉 淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的.
二、操作步骤
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0））中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电 泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也 好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
质粒dna 的提取和基因组dna的提取
质粒dna 的提取和基因组dna的提取以质粒DNA的提取和基因组DNA的提取为标题，本文将分别介绍质粒DNA和基因组DNA的提取方法。
一、质粒DNA的提取质粒DNA是存在于细菌细胞内的一个环状DNA分子，它具有独立复制和转录的能力。
质粒DNA的提取是进行基因工程研究和分子生物学实验的重要步骤之一。
质粒DNA的提取方法一般包括以下步骤：1.细菌培养与收获：首先选取含有目标质粒的细菌菌株进行培养，培养至适宜的生长阶段，然后通过离心将细菌菌体收获。
2.细菌菌体破碎：将收获的细菌菌体进行破碎，破碎方法常用的有物理破碎和化学破碎。
物理破碎可以通过超声波处理或高压破碎等方法进行；化学破碎则常使用蛋白酶K等酶进行。
3.质粒DNA的分离：通过离心将破碎后的细菌细胞碎片与其他细胞组分进行分离。
常用的方法包括差速离心和密度梯度离心等。
4.质粒DNA的纯化：将分离得到的质粒DNA进行纯化，去除杂质和其他核酸。
纯化方法常用的有酚-氯仿法、硅胶柱层析法和离子交换层析法等。
5.质粒DNA的测定：对提取得到的质粒DNA进行浓度和纯度的测定，常用的方法有比色法和紫外分光光度法等。
二、基因组DNA的提取基因组DNA是一个生物体内所有基因的总和，它包含了生物体的全部遗传信息。
基因组DNA的提取是进行基因组学研究和遗传分析的重要步骤之一。
基因组DNA的提取方法一般包括以下步骤：1.样品处理：首先选择合适的样品，如动物组织、植物组织或微生物等，然后对样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白酶处理等。
2.细胞破碎：将样品中的细胞破碎，使细胞内的DNA释放出来。
破碎方法常用的有物理破碎和化学破碎。
物理破碎可以通过高温、高压或超声波处理等方法进行；化学破碎则常使用蛋白酶K等酶进行。
3.基因组DNA的分离：通过离心将破碎后的细胞碎片与其他细胞组分进行分离。
常用的方法包括差速离心和密度梯度离心等。
4.基因组DNA的纯化：将分离得到的基因组DNA进行纯化，去除杂质和其他核酸。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、目的学习碱裂解法提取质粒的原理二、原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。
它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。
现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。
实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。
其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料含质粒的大肠杆菌GFP、P38（二）试剂1、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。
高压灭菌20分钟。
2、LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。
3、溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。
4、溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1% SDS。
（必须新鲜配制）5、溶液Ⅲ：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾60 ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5ml）。
6、TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。
质粒DNA的提取（碱裂解法）
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
质粒dna提取的方法
质粒dna提取的方法
提取质粒DNA的常用方法主要有：
1. 碱裂解法：将含有质粒DNA的细菌株进行裂解，使细菌质粒DNA与蛋白质分离。
一般使用碱性裂解缓冲液（如0.2 M NaOH）和含有细菌裂解酶（如SDS）的胰酶溶液进行裂解，然后使用中性盐溶液（如3 M醋酸钠）进行酸性沉淀，最后通过离心分离沉淀的质粒DNA。
2. 除菌剂法：使用含有除菌剂（如SDS）的裂解缓冲液直接裂解细菌细胞，使质粒DNA与细菌蛋白质分离。
然后使用物理方法（如离心）分离DNA和蛋白质，最后使用醋酸盐沉淀法分离质粒DNA。
3. 膜裂解法：将含有质粒DNA的细菌株均匀涂在含有质粒DNA结合断裂物的特殊膜上，经裂解后，膜上会形成质粒DNA的斑点。
然后使用洗脱缓冲液将质粒DNA从膜上洗脱，得到纯化的质粒DNA。
4. 商业化质粒DNA提取试剂盒：市面上有各种质粒DNA提取试剂盒可供选择，这些试剂盒能够提供简便、快速、高产量且高质量的质粒DNA纯化方法。
根据试剂盒的不同，步骤和原理会有所区别。
不同的方法适用于不同的实验目的和样品类型，请根据具体情况选择合适的提取方法。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
质粒DNA的提取和鉴定
该技术通常具有快速、高效的特 性，能在短时间内处理大量样本。
高通量质粒DNA提取技术可以提 供标准化的操作流程，确保提取 的一致性和准确性。
质粒DNA的测序技术
下一代测序
质粒DNA的测序技术已发展到下一代测序 阶段，能够快速、准确地测定质粒DNA的 全序列。
深度覆盖
通过深度覆盖测序，可以获得质粒DNA更全面的序 列信息，有助于发现稀有变异和基因组结构变异。
注意事项
凝胶电泳检测质粒DNA时，需要注意电泳条件的选择，如电压、电流和时间等，以确保 分离效果最佳。同时，需要使用已知大小的DNA片段作为标准进行对比分析。
紫外分光光度法检测质粒DNA
01
原理
紫外分光光度法是通过测量物质在特定波长下的吸光度来分析物质浓度
的方法。质粒DNA在260nm波长下有最大吸收峰，通过测量吸光度可
基因组编辑
质粒DNA可以作为CRISPR-Cas9等基因组编辑技术的辅助工具，用于向细胞提 供指导编辑的RNA和Cas蛋白。通过将质粒导入细胞，可以实现对特定基因的敲 除、敲入或突变。
在生物技术和生物工程中的应用
生物制药
质粒DNA常被用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素 等。通过在大规模细胞培养物中转染质粒，可以高效地生产 这些药物。
质粒DNA提取的注意事项
保证细菌的活性和纯度
在提取前应确保细菌处于对数生长期，并去除杂质和死细胞。
避免交叉污染
整个操作过程需在无菌条件下进行，并确保使用的工具和试剂无菌。
保证质粒的完整性
提取过程中应避免质粒断裂或降解，以确保后续实验的准确性。
02
质粒DNA的纯化
离心法纯化质粒DNA
原理
通过高速离心将质粒DNA与细 胞碎片、蛋白质等杂质分离，
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质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
13．37℃水浴30min。
14．样品放一20℃冰箱保存备用。
三、试剂1．TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)配制方法：Tris 1.211gEDTA.Na 0.037g用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。
2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)配制方法：NaOH O.4 gSDS 0.5 g加80mlTE缓冲液溶解。
加TE缓冲液定容至lOOml.3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)配制方法：醋酸钠 24.6g用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。
纯净的酚使用时不需要重蒸。
市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。
将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。
纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖，激烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0。
从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mol／L Tris-HCI(pH8．o)覆盖在酚相上，置4℃冰箱贮存备用。
酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套。
如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。
酚在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂o．1％8一羟基喹啉及o．2％β—巯基乙醇。
5．无水乙醇置-20℃冰箱中保存备用6．70％乙醇置-20℃冰箱中保存备用7．核糖核酸酶(10mg／ml)配制方法：称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂)。
于灭菌的微离心管内，加1 ml 100mmol／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)，即为10mg／ml RNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min，然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。
四、材料1．菌种：大肠杆菌(pUC57)2．培养基LB液体培养基精解蛋白胨 3g酵母浸出粉 1.5g氯化钠 3 g葡萄糖 0.6g按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。
用10mol／LnaOH 调pH至7．2～7．4。
分装于15ml试管中，每支5ml。
然后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg／cm2灭菌20min.l抗菌素：氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg／m1。
五、仪器：恒温振荡器。
低温冰箱-20℃真空泵。
台式高速离心机六、说明1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯梯度超离心法等。
本次实验是一种小量快速提取法。
小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质。
RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐等。
2．在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它的缓冲液。
虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验。
如在转化实验中，要用到Ca+，如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；作中的EDTA是二价离子Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。
3、TENS中NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中稳定，怛当pH大于12或小于3 时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。
TENS中有NaOH使其pH大于12，因而使染色体DNA与质粒DNA变性。
TENS中的SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用Rnase去除RNA时)受干扰。
4、3．0mol／L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
染色体DNA不能复性(染色体DNA不存在超螺旋共价闭合环结构) 而高盐的3mol/L NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、以及SDS—蛋白质复合物凝聚沉淀。
pH5．2也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。
同时，钠盐能与SDS一蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
5．饱和酚：酚是一种表面变性剂，属非极性分子。
水是极性分子。
当蛋白质溶液与酚混合合时，蛋白质分子之间的水分子被酚挤走，使蛋白质失去水合状态而变性。
经过离心。
变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，酚比重更大，保留在最下层。
酚作为变性剂．也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失，(2)酚很容易氧化，变成粉红色，氧化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris —HCl缓冲液饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。
饱和酚中加上8一羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂．可抑制DNase。
由于有颜色．溶解在酚中后，使酚带上颜色，便于酚相与水相的分肉，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，隔绝空气，阻止酚氧化。
6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇．乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀，一般实验中，用2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。
使乙醇的最终含量占67％左右。
由此可预见，也可用95％乙醇沉淀DNA，但是用95％乙醇使总体积增大．而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解。
因而DNA损失也增大，影响收率。
乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度，中和DNA表面电荷。
如果溶液中盐浓度太低，要加NaAC或NaCl至最终浓度O.1一O.25mol／l在pH 8左右的DNA 溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。
当加入的盐溶液浓度太低时。
只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。
但当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀。
乙醇沉淀DNA．一般采用低温条件，这是由于在低温条件下．分子运动大大减少，DNA 易于聚合而沉淀。
为了使质粒DNA能充分沉淀，一般保存时间总是过长的，同时也要视样品的体积而异，在微量离心管中的样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少，冷却就较迅速。
大量提取DNA时，目前习惯上常采用如下几种方法：保存在家用冰箱结冰盒内过夜保存在-2℃亡冰箱内过夜保存在-70℃冰箱内 30mm～2h放置干冰中（约-20℃） 30min放置干冰加酒精中(约-70℃) 16mm放置在液氮缸中液氮的气相内，不可以浸在液氮中(温度在-198℃左右)5～15min。
除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉淀。
用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小，但异丙醇挥发性不如乙醇，最终除区其残留部分的难度更大。
此外，异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA一起沉淀，在-70℃时，更易发生，所以一般以乙醇沉淀为宜，除非要求液体体积很小。
7．影响质粒DNA提纯质量和产率因素的说明。