质粒DNA的提取与鉴定

琼脂糖凝胶电泳是实验室中最早得到广泛应用的凝胶电泳，是分离鉴定核酸的常规方法。因为它具有以下优点：1）琼脂糖凝胶中含有琼脂1.0%-1.5%，在这种凝胶中电泳，近似自由界面电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小；2）琼脂糖凝胶电泳支持物均匀，电泳区带整齐，分辨率高，重复性好；3）液相与固相界面无明显界限，电泳速度快；4）琼脂糖凝胶透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定；5）区带易染色，样品易回收。
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸11.5mL，H2O 28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ5mol/L。
3 mol/L醋酸钠(pH5.2)：800 mL水中溶解408.1gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
实验22半定量RT-PCR检测基因的表达差异（设计、创新）
授课题目：半定量RT-PCR检测基因的表达差异（设计、创新）（9学时）
授课对象：生科专业
授课教师：
教学目标及基本要求：
1、培养学生的创新意识和创新能力。
2、在任课教师的指导下，查阅资料，选题，开题，实施实验，最后以小论文的形式总结实验。
3、学习基因特异性引物的设计。
2、实验试剂与器材2分钟
液氮罐、陶瓷研钵、冷冻高速离心机、恒温水浴器、恒温培养箱、高压灭菌锅、紫外线透射仪、吸头、乳胶手套、紫外分光光度计、电泳仪、水平式电泳槽、微波炉、Eppendorf微量离心管、微量加样器（pipetman）、三角烧瓶、烧杯、量筒。
总RNA提取试剂盒（TRIzolTM试剂）、0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)、75%乙醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、10mg/ml EB溶液、5×TBE电泳缓冲液（0.45mol/LTris、0.01mol/LEDTANa2、0.45mol/L硼酸，pH8.0）、溴酚蓝指示剂（0.25%溴酚蓝、50%甘油）、DNA marker。
2、实验试剂与器材6分钟
溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH母液稀释），1％SDS（从10% SDS母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。
4、采用开放性实验教学。
教学内容提要及时间分配：
1、实验原理讲解：12分钟
总RNA的提取
真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即１）样品细胞或组织的有效破碎；２）有效地使核蛋白复合体变性；３）对内源RNA酶的有效抑制；４）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相，而RNA留在水相。
加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧，管口朝下，轻柔振荡5~10次，冰浴5~10分钟，12, 000 r/min离心10分钟。
取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡20秒。
室温下12,000 r/min离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为有机相。
3、《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克等著金冬雁、黎孟枫等译
科学出版社1999
思考题：
1、碱法提取质粒过程中，EDTA、溶菌酶、NaOH、SDS、乙酸钾、酚/氯仿等试剂的作用是什么?
2、质粒提取过程中，应注意哪些操作，为什么?
3、用碱裂解法提取的质粒DNA通常都污染有细菌RNA分子，你采用什么策略能够去除RNA污染？
4、如果你提取的质粒DNA污染有少量的染色体DNA，那么你在操作过程中哪几步最可能出现了问题？
5、你提取的质粒DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中表现出几条带？能否利用你所学习的知识解释这种现象？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
1、结合理论内容讲述实验内容，采用开放性实验教学，效果较好。
分光光度法不但能测定核酸浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外吸收比值（A260/ A280）估计核酸的纯度。纯净的DNA样品的A260/ A280为1.8，纯净的RNA制品的A260/ A280为2.0。DNA样品中存在将导致比值升高，而比值降低表明有蛋白质或苯酚等污染。RNA浓度计算公式：C(μg/mL)＝40μg/mL×1/光程×A260×稀释倍数
教学重点及难点：
1、碱变性法提取质粒DNA的原理。
教学方法：
采用启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体…等）：
板书，PPT。
使用的教材及参考资料：
1、《现代生物学实验》，熊大胜主编，中南大学出版社，2005
2、《分子生物学实验指导》，魏群主编，高等教育出版社，2006
取上清，加入400μL氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡20秒。
12,000r/min离心5分钟。
加入1/10体积3MNaAc，2倍体积无水乙醇，4℃沉淀10分钟或室温沉淀20分钟。
12,000rpm离心10分钟。
去上清，加入1mL 75%乙醇，洗涤沉淀以去盐。12,000rpm离心10分钟。
去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。
4、学习和掌握RT-PCR的原理和方法。
5、学习和掌握用半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法。
6、采用开放性实验教学。
教学内容提要及时间分配：
1、实验讲解：
查阅资料及选题10分钟
拟定实验提纲2分钟
准备实验2分钟
实施实验10分钟
以组织或细胞总RNA中的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，以Oligo(dT)或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段。
取1.5 mL培养液加入1.5 mL离心管中，室温12, 000 r/min离心1分钟。
加入500μL STE，涡旋打匀，室温12, 000 r/min离心1分钟。
弃上清，将管倒置于纸巾，使液体流尽。
加入100 μL溶液Ⅰ重悬菌体，涡旋振荡，冰浴5分钟。
加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速轻柔颠倒5次，至溶液澄清(千万不要振荡)，冰浴5分钟。
实验20质粒DNA的提取与鉴定
授课题目：质粒DNA的提取与鉴定（6学时）
授课对象：生科专业
授课教师：
教学目标及基本要求：
1、学习和掌握快速提取质粒DNA的原理和方法。
2、学习和掌握质粒DNA的鉴定。
3、采用开放性实验教学。
教学内容提要及时间分配：
1、实验原理讲解：8分钟
碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物,通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去，用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀，再用RNase除去RNA，即可获得较纯净的质粒DNA。
3、实验步骤讲解：5分钟
组织总RNA的提取
把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5 min。吸入1.5mL离心管中，加入氯仿(0.2mL/mL Trizol)，冰上放置5 min。10 000×g离心10 min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10 min。10 000×g离心15 min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水(15-20 μL)溶解。
琼脂糖凝胶电泳技术检测总RNA浓度和质量
琼脂糖英文名agarose，是由经过挑选、质地较纯的琼脂（agar）作原料制成的。琼脂化学结构上是由琼脂糖和琼脂胶（agaropectin）组成的复合物。琼脂胶是一种含有磷酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质将给电泳及凝胶过滤以不良影响。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖和琼脂一样也能形成凝胶。形成凝胶主要是由于氢键的缘故。由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感的生物化学物质的变性和吸附。
核酸分子在高于其等电点的电泳缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动。分子大小不同的核酸分子具有各异的电泳迁移率，而在电泳后处于凝胶的不同位置。影响其电泳迁移率的因素包括电荷效应和分子筛效应。前者由分子所带的净电荷多少而定，这与电泳时电流强度、电泳缓冲液的pH值和离子强度有关；而后者主要与核酸分子大小和其构象以及所用琼脂糖凝胶的浓度有关。
4、总结2分钟
教学重点及难点：
1、如何获得高质量的总RNA。
教学方法：
启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体…等）：
板书，PPT。
使用的教材及参考资料：
1、《现代生物学实验》，熊大胜主编，中南大学出版社，2005
2、《分子生物学实验指导》，魏群主编，高等教育出版社，2006