包涵体的形成以及处理方法
包涵体的纯化
根据不同用途，采用相应溶剂溶解包涵体。
①如用于免疫注射，用1.5倍沉淀体积旳PH8.0， 8M尿素溶解，并于4℃保存。
②如用于纯化，用2倍沉淀体积旳PH8.0旳PBS， 2%SKL（十二烷基肌氨酸钠）孵育过夜，溶解 包涵体沉淀，10000rpm，7min离心，搜集上清， 4℃保存。
5、复性
包涵体旳复性是一种复杂旳过程，我们企 业生产旳融合蛋白用作抗原免疫兔子，所以不需 要作复性处理。
白水解酶活性，在包涵体旳溶解和复性过程中 可造成重组蛋白质旳降解。
试验室用旳是低浓度旳变性剂—2M尿素在 50mM Tris pH8.0，1mM EDTA中洗涤和用温 和去垢剂1% TritonX-100洗涤清除膜碎片和膜 蛋白。
4 、溶解
变性蛋白只有空间构象旳破坏，一般以为蛋白质 变性本质是次级键、二硫键旳破坏，并不涉及一级 构造旳变化。包涵体旳溶解主要任务是拆开错配旳 二硫键和次级键 。
5、以包涵体形式体现旳重组蛋白丧失了原有旳生物 活性，必须经过有效旳变性复性操作，才干回收得到 具有正确空间构象（因而具有生物活性）旳目旳蛋白， 体外复性蛋白质旳成功率相当低，一般不超
1 、破菌
基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用： 机械破碎、超声破碎。单纯超声破碎，在小规 模下且菌量较少旳情况下效果很好，因为能量 传递和局部产热等原因，极难用于大致积细胞 悬液旳破碎，这么部分未破碎细胞与包涵体混 在一起，给后期纯化带来困难。所以，在较大 规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌旳细胞膜，再 结合超声破碎措施，可明显提升包涵体旳纯度 和回收率。
累，轻易形成包涵体沉淀。
5 、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH
旳环境下，其本身固有旳溶解度对于包涵体旳形成比较
关键，即是说，有旳体现产率很高，如Aspartase和
包涵体
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/ 毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体的处理
包涵体的处理蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达，常常导致形成相差显微镜下可见的并可通过离心从粗制细胞裂解液中分离的细胞质颗粒。
高水平表达外源蛋白的细菌经离心浓缩后，可通过机械法、超声处理法或溶菌酶加去污剂的方法进行裂解。
包涵体经离心沉淀后可用Triton X-100和EDTA或用尿素加以洗涤。
为获取可溶性的活性蛋白，必须将洗涤过的包涵体溶解，然后进行重折叠。
每种蛋白质所需采用的方案可不同，必须通过实验来决定。
可用各种不同的条件[如盐酸胍(5-8mol/L)、尿素(6-8 mol/L)、SDS、偏碱的PH值或乙啨-丙醇]溶解包涵体。
顺利溶解后，可试用不同的方法使蛋白质进行重折叠，其中包括稀释或透析。
活性蛋白或所含二硫键与原始蛋白相同的蛋白质的产量取决于多肽的浓度、纯度及大小，也取决于溶剂的pH值和离子强度，还取决于重折叠的速度等因素。
还有其他一些因素，如二硫键的数目和蛋白质本身的性质，也有影响。
1．细胞的裂解：(切记：以下步骤2)至步骤4)应在冷室中进行。
)1) 于4℃将1L细菌以500g离心15分钟。
2) 弃去上清液并称量大肠杆菌沉淀的重量，每克大肠杆菌(湿重)可加3ml裂解缓冲液以重悬沉淀。
裂解缓冲液：50m mol/L Tris·Cl(pH8.0)1m mol/L EDTA100m mol/L NaCl3) 每克大肠杆菌加8μl 50m mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和80μl溶茵酶(10mg/m1)，在20分钟内不时地进行搅拌。
(如果溶液的PH值低于8.0，则溶菌酶不能有效作用。
)4) 一边继续搅拌一边在每克大肠杆菌中加入4mg去氧胆酸。
5) 放置于37℃并用玻璃棒搅拌。
当裂解物变粘稠时，在每克大肠杆菌中加入20μl DNA酶I(1mg/m1)。
6 放置于室温直到裂解液不再粘稠(大约30分钟)。
2．包涵体的洗涤与纯化(1)方法I：(切记：步骤2)和步骤5)应在冷室中进行。
)1) 细胞裂解液于4℃以12000g离心15分钟。
包涵体的形成
包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞,如酵母细胞、哺乳动物细胞等。
包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形.一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
基因工程定义:在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）.病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物,不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体)，有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有(如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri)小体。
特性：一般含有50％以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等,大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
形成:主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
包涵体的形成以及处理方法【范本模板】
包涵体的形成以及处理方法1 包涵体形成的原因（1）表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体L2］。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
（2）重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成］。
（3）重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生.(4）重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体.(5）包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成.因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。
（6)在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
(7)有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体? 。
包涵体的处理包涵体的形成具有有利的一面,也有不利的一面。
有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。
同时，因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率，通常其表达量可占菌体总蛋白的10％～30％，甚至高达50%。
不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂，而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变，这些试剂价格昂贵，且复性的操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀,有些还形成异构体【s］5。
因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。
包涵体的处理一般有如下几个步聚。
破碎细菌细胞提取包涵体时，首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性，常常采取一些保护措施：合适的缓冲体系，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液；加入保护剂，如还原剂DTT（2一巯基苏糖醇）、2一巯基乙醇；加防止水解酶作用的试剂，如酶的抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。
包涵体形成的机理及防止办法
包涵体形成的机理及防止办法包涵体形成的机理：包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关。
强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。
除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。
尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。
膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低。
蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集。
防止包涵体常用的方法：使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达，与伴侣分子和折叠酶共表达，表达定位于不同的空间，选择突变的菌株或其他的原核表达系统。
增加蛋白质折叠的添加剂：添加剂可能的作用机制甘油对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度L-精氨酸两亲分子/渗压剂甘氨酰甜菜碱/山梨糖醇对蛋白质具有优先的水合作用阿拉伯聚糖增加黏度木糖醇增加黏度乙醇调节极性DMSO调节极性保护非极性表面两性离子表面活性剂（Zwitterionic detergents）Triton X-100保护非极性表面硫代甜菜碱类物质（NDSBs）保护非极性表面蔗糖/海藻糖对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度N-氧化三甲胺（TMAO）对蛋白质具有优先的水合作用/渗压剂三氟乙醇（TFE）促进二级结构的形成低浓度盐酸胍使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性低浓度尿素使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性配体稳定天然结构状态聚乙二醇保护熔球体（molten globule）/增加黏度需要强调的是在培养细菌时，在培养基中加入5％的乙醇可以起到一定的防止包涵体产生的作用。
包涵体形成及改善
由于包涵体的复性操作复杂而且复性效率不高，所以包涵体的形成是蛋白表达的一个难题。
相关研究分析提出有六个因素与包涵体的形成有关：蛋白质平均电势、等电点、形成构象残基百分比、半胱氨酸残基数目、脯氨酸数目、亲水性和总氨基酸数目。
弼，并建立了数学模型用来预测包涵体的形成概率。
降低包涵体的形成可以采用以下一些方法：在低温下培养细胞；采用不同的大肠杆菌宿主；更换蛋白质中某些氨基酸；共表达分子伴侣；添加山梨醇等造成渗透压；添加非代谢糖类；改变培养基 pH；利用不表达硫氧还蛋白还原酶的菌株。
IPTG 诱导T7 表达系统仍存在一定的不足。
现代生物学已进入到后基因组和蛋白质组学的时代，人们往往需求高通量地表达纯化蛋白。
传统的IPTG诱导蛋白表达不但在操作上稍显繁琐，对于多个蛋白也很难保证步调统一。
由于lac mRNA 本底水平的组成型合成（background levelconstitutivesynthesis）即便是在有T7lac 启动子存在时，目的蛋白的少量表达依旧难免，影响多个平行培养的细菌生长速率另外，传统的IPTG 诱导对于表达毒性蛋白的效率很低，往往表达量难以满足研究人员的需要。
也有研究表明非目的性表达出的目的蛋白可能会导致目的蛋白不稳定、甚至丧失表达的能力。
导致非目的性表达的原因除前面提到的lac mRNA 有本底水平的组成型合成外，另一个重要的原因即为培养基的组成问题。
培养大肠杆菌一般使用LB 培养基，其重要的组成为胰蛋白胨（tryptone），它是导致乳糖污染的首要因素。
胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白（casein）后的产物，酪蛋白一般由牛奶或大豆中提取，其中不免掺杂微量的乳糖成分；这些足以使细菌产生非目的性表达。
这也就是在摇菌晚期即便不加诱导剂目的蛋白也会表达的原因。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
基因工程包涵体的纯化方法
基因工程包涵体的纯化方法基因工程可真是个神奇的领域，像是现代科技的魔法师，把DNA这个小家伙们玩弄得团团转。
在这片神秘的土地上，包涵体就像是隐藏的宝藏，得先把它们找出来，再通过纯化的方法把这些小宝贝洗净，才能让它们为我们所用。
今天，我们就来聊聊基因工程包涵体的纯化方法，让这趟旅程轻松愉快。
1. 什么是包涵体？首先，包涵体可不是某种古怪的生物，它们其实是细胞在生产某些蛋白质时，形成的一种颗粒。
就像是做饭时，锅里油烟聚集的那些小油滴，虽然它们看起来不太好，但里面可藏着好东西。
你要知道，包涵体里面有大量的目标蛋白质，但通常它们会和其他杂质混在一起，像是大海捞针，得费点功夫才能捞出来。
1.1 包涵体的形成当细胞用上基因工程的技术，强行让某种蛋白质“上班”时，有时候它们就会不太乖，聚集成包涵体。
这就像你在做作业时，有的题目就特别难，结果一堆答案写错了，最后只好把它们堆到一边。
虽然包涵体一开始可能看起来像个废物，但其实它们是生产特定蛋白质的一种“副产品”。
1.2 包涵体的用途那包涵体有什么用呢？别小看了它们，它们可是制药、疫苗开发的重要角色。
有的包涵体能转化为活跃的蛋白质，成为我们需要的药物，甚至可以用于研究新治疗方法，简直就是科研界的“黑马”。
所以，找到它们、纯化它们，那可是相当重要的任务。
2. 包涵体的纯化步骤接下来，我们就要聊聊如何把这些包涵体给纯化出来，步骤其实不复杂，但得有点耐心。
2.1 细胞裂解首先，得把细胞给撬开，就像剥开一个鸡蛋，才能见到里面的蛋黄。
这里我们通常会用一些裂解缓冲液，像是加盐的水，帮助细胞膜变得松软。
然后，咱们可以用超声波处理、化学试剂或者冷冻融化的方式把细胞打散，让包涵体慢慢浮出来。
2.2 离心分离一旦细胞裂解，包涵体就会在液体中游荡。
这时候，就要用离心机来大显身手了。
离心机就像是一位厨师，用强大的“旋转功力”把细胞残骸和包涵体分开。
你可以想象，把一大锅汤放进离心机，旋转后，沉淀物就会在底下，清汤会在上面。
包涵体纯化全过程
一、包涵体的纯化和复性总结(二)关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,内容比较庞杂。
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1。
高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度.此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等.2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动,即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50—100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10—15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整,超声完全了菌液应该变清亮,如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用.4。
反复冻融法：将细胞在—20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸(DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取.这是标准配方:裂解液：50mM Tris—HCl(pH8.5~9.0)， 2mM EDTA, 100mM NaCl， 0.5% Triton X-100， 1mg/ml 溶菌酶。
包涵体
包涵体（inclusion body）基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子包涵体，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。
昆虫病毒可根据包涵体的形状、位置而分为细胞质型多角体病毒、核型多角及颗粒体病毒等。
组成与特性一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、包涵体RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白沙眼衣原体包涵体间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
基因工程表达蛋白包涵体的形成和纯化_张庶民
源 含 量 多 少 和 不 同 的 表达 基 因 对 包 涵 体 的 形 成 均有 影 响
而 且 发 现 包涵 体 的 形 成 与 菌 体 内 的
。
,
本 文针 对基 因工程 中大 肠杆
,
。
热 休 克 蛋 白有 很 大关 系 ( ”
, ,
了解 包 涵体 形 成 的
菌 表 达 产 物 形 成 包 涵 体 的原 因 及 包 涵 体 的 性 质和 纯化 做 一 简要综 述
基 因 产物
,
目前 基 因 重 组 技 术 已 在 生 命 科 学 的
,
。
,
各 个 领 域 得 到 广 泛 应 用 逐 渐形 成 了 一 个 新 型
胞内
H
。
S tr
,
a n
d be r g
L
等对 影 响 包 涵 体 的 条 件 进
,
的 生 物技 术 产 业
,
行 了 研 究 发 现 提 高 培 养 温 度 和 降低 培 养 基 的
成 份 明显 分 开 细胞 破 碎 之 后 仍 以 颗 粒 形 式 存
在
。
,
包 涵 体外 无 包 膜 密 度 约 在
,
,
1 2一1
.
.
49
/m l
才能 形 成 包 涵 体
。
同 时也 发 现 有 些 表 达 量 较 低
。
之间 约
,
0
.
6
一1
.
7
微米 大小
,
,
50
鲍 的离 心速
90
的基 因 产物也 是 以 不 可溶 形式 存在的 因 此 推 测 包 涵 体的 形 成 可能 与细 胞 在 遗 传 变 化 或 生 理 压 力 下 重 组 蛋 白 不 能 正 确 折 叠 而 造 成 变性 蛋 白 的 聚 集有 关
关于包涵体的研究
谢谢
重组人 EC-SOD 包涵体的稀释复性 及重折叠后蛋白的纯化
在细胞外的体液中,如淋巴液、滑膜液及 血浆中也存在一类SOD ,称为胞外 SOD （EC-SOD）。EC-SOD在动物组织中含量 很低 ,分离纯化有一定困难 ,因此进行基因 克隆表达具有重要意义。表达产物均为包 涵体 ,因此需体外复用融合系统表达靶蛋白 选择合适的运载 载体表达融合蛋白, 不仅可以减少蛋白质的 错误折叠和包涵体的形成, 而且便于进行蛋 白的纯化。表达的融合蛋白可通过化学和 酶学的方法在靶蛋白和运载蛋白连接处切 割肽键而获得靶蛋白。 低温诱导, 在较低温度下疏水表面的相互作 用减弱, 因此低温诱导往往可以减少包涵体 的形成。
将 1 L 摇瓶培养基中收获的EC-SOD基因工程菌悬 浮于 50 ml含溶菌酶(0.1 mg/ ml)的 TE -buffer 中 , 冰浴条件下超声破碎菌体 ,离心后用含适量 Triton X-100 溶液重复洗涤 3 次 ,用 TE -buffer 洗涤残留 的 Triton X-100 后 ,冷冻保存。 取约50 mg包涵体 ,加含 0.2 mol/ L DTT的变性液1 ml (8 mol/ L 尿素 ,20 mmol/ L Tris-HCl ,pH 7.5) ,室 温振摇1 h ,使其充分溶解。4 ℃12 000 r/ min离心 10 min ,收集上清液上清液经 G-25脱除DTT 配制基本复性缓冲液: 20 mmol/ L Tris-HCl ,含 GSH 和 GSSG分别为1 mmol/ L ,尿素1 mol/L。取 上述脱除 DTT的变性 EC-SOD 适量缓慢滴入剧烈 搅拌且冰浴冷却的基本复性液中 , 4 ℃冰箱中静止 24 h。
病理学中包涵体的概念
病理学中包涵体的概念在病理学中，包涵体（inclusion body）通常是指在细胞内形成的特殊结构，它们可以是细胞器、细胞内颗粒、病毒或其他微生物等。
这些包涵体通常是由于细胞内代谢异常、感染或基因突变等原因形成的。
包涵体的形成通常与细胞内蛋白质的异常聚集有关，这些蛋白质聚集形成不溶性颗粒，最终形成包涵体。
这些包涵体可以是圆形、椭圆形或不规则形状，大小也各不相同。
在某些情况下，包涵体可能是细胞对病毒感染的反应产物，而不一定与疾病有关。
然而，在某些疾病中，包涵体的形成可能与疾病的发生和发展有关。
例如，在一些神经退行性疾病中，包涵体的形成可能与神经元的死亡和功能障碍有关。
此外，一些病毒性疾病也可能在细胞内形成包涵体，这些包涵体可能是病毒复制的场所或细胞内防御机制的一部分。
在病理学中，包涵体（Inclusion Bodies）是指在细胞内形成的特定结构，它们由异常积累的蛋白质、核酸或其他物质组成，通常与某些疾病过程或病毒感染有关。
包涵体具有形态特征明显、染色反应特殊等特点，常在显微镜下可见。
包涵体主要有以下几类：1. 嗜酸性包涵体（Eosinophilic Inclusion Bodies）：在HE染色下呈现红色，主要见于病毒感染，如麻疹病毒引起的麻疹细胞内可见的施皮茨纳(Spirochaeta)样包涵体，或是狂犬病病毒在神经细胞内产生的内基氏小体(Negri Bodies)。
2. 嗜碱性包涵体（Basophilic Inclusion Bodies）：在HE染色下呈现蓝色或紫色，如脊髓灰质炎病毒感染时，在细胞核内可观察到的柯萨奇(Cowdry)型A型包涵体。
3. 泛素阳性包涵体（Ubiquitin-positive Inclusions）：在一些神经退行性疾病（如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症）中发现，是蛋白质错误折叠和聚集的结果。
4. 病毒包涵体（Viral Inclusions）：是由病毒蛋白在宿主细胞内异常堆积形成的结构，常常是病毒感染的一个重要标志。
包涵体的形成
包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。
包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。
特性：一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
包涵体的形成以及处理方法
包涵体的形成以及处理方法包涵是一种人际关系的方式，指的是接受和容忍他人的缺点和错误，并以宽容和理解的态度对待他们。
包涵体的形成受到个人成长、教育背景和文化环境的影响。
处理方法包括培养同理心、控制情绪、积极沟通、设定清晰的界限等。
首先，个人的成长经历和教育背景对形成包涵体起到重要的作用。
在家庭和学校的教育环境中，如果得到充分的关爱、尊重和理解，个人更容易具备包容他人的心态。
与此相反，如果经历了严厉的批评和惩罚，可能会增加攻击性和不包容的倾向。
因此，良好的家庭关系和积极的教育体验有助于培养包容他人的能力。
其次，文化环境对包涵体的形成也具有重要影响。
不同文化对包容他人的态度有所差异。
一些文化强调个人自由和自主性，倾向于对他人的错误持批评的态度。
而另一些文化则注重集体利益和和谐关系，更倾向于包容他人。
因此，个体所处的文化环境将影响到他们对他人错误的回应方式。
在处理包容他人的挑战时，有几种方法是值得我们运用的。
首先，培养同理心是关键。
通过设身处地地想象自己处于对方的位置，我们能够更好地理解他人的行为和动机。
这样，我们就能用宽容和理解的态度对待他们的错误和缺点。
与此同时，我们也要学会控制情绪，避免过度反应或过度批评他人。
情绪的控制有助于我们更理性地对待问题，并提供合适的回应。
积极沟通也是处理包容他人的重要方法之一、通过与他人积极沟通，我们可以更好地理解彼此的需求和意愿，从而减少误解和冲突。
我们可以表达自己的需求和意见，同时尊重他人的立场和意见。
通过开放和包容的对话，我们能够建立和谐和理解的关系。
此外，设定清晰的界限也对处理包容他人的问题至关重要。
我们需要明确告知他人我们的底线和原则。
如果他人的行为严重违背我们的底线，我们可以采取适当的措施，如避免与其交往或限制与其的接触。
设定清晰的界限可以维护自身的权益和尊严，并防止他人过度侵犯。
综上所述，包涵体的形成受到个人成长、教育背景和文化环境的影响。
处理包容他人的挑战可以通过培养同理心、控制情绪、积极沟通和设定清晰的界限来达成。
包涵体形成的机理及防止办法
包涵体形成的机理及防止办法包涵体形成的机理：包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关。
强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。
除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。
尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。
膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低。
蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集。
防止包涵体常用的方法：使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达，与伴侣分子和折叠酶共表达，表达定位于不同的空间，选择突变的菌株或其他的原核表达系统。
增加蛋白质折叠的添加剂：添加剂可能的作用机制甘油对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度L-精氨酸两亲分子/渗压剂甘氨酰甜菜碱/山梨糖醇对蛋白质具有优先的水合作用阿拉伯聚糖增加黏度木糖醇增加黏度乙醇调节极性DMSO调节极性保护非极性表面两性离子表面活性剂（Zwitterionic detergents）Triton X-100保护非极性表面硫代甜菜碱类物质（NDSBs）保护非极性表面蔗糖/海藻糖对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度N-氧化三甲胺（TMAO）对蛋白质具有优先的水合作用/渗压剂三氟乙醇（TFE）促进二级结构的形成低浓度盐酸胍使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性低浓度尿素使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性配体稳定天然结构状态聚乙二醇保护熔球体（molten globule）/增加黏度需要强调的是在培养细菌时，在培养基中加入5％的乙醇可以起到一定的防止包涵体产生的作用。
包涵体的纯化和复性总结70359
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。
包涵体的形成以及处理方法
包涵体的形成以及处理方法包涵体（tolerance）是指一个人或一个群体对于其他人或其他群体的差异、错误、观点或行为能够保持宽容和接纳的态度。
在国际社会和多元文化社会中，包涵体是维护社会和谐的重要因素。
它可以促进不同群体之间的相互理解、尊重和协作，减少冲突和分离，提高社会的稳定性和发展。
因此，形成包涵体对于构建一个和谐、包容和进步的社会至关重要。
关于包涵体的形成可以从以下几个方面来分析：教育：教育是包涵体形成的重要途径之一、学校应该注重培养学生的包容心和理解力，通过开展多元化的课程和活动，使学生接触不同文化、不同背景的人群，了解他们的价值观和生活方式，培养学生的宽容和接纳之心。
家庭：家庭是孩子成长的第一教育场所，家庭环境对于塑造孩子的包涵体起着至关重要的作用。
父母应该尊重孩子的个性差异，鼓励他们表达自己的观点，并提供一个宽容、接纳的家庭氛围。
家庭成员之间的相互宽容和理解也能够为孩子树立一个包涵体的榜样。
社会文化：社会文化环境对于形成包涵体也有重要影响。
一个开放、宽容的社会文化环境能够让个体感受到来自社会的尊重和接纳，进而激发个体的包容心。
反之，一个偏执、排他的社会文化环境则容易形成歧视和偏见，增加社会冲突和紧张。
尊重和倾听：包涵体的形成还需要互相尊重和倾听。
每个人都应该尊重他人的独特性，接受和认可不同观点和行为方式的存在，并愿意倾听他人的意见和经历。
通过互相尊重和倾听，可以增强不同群体之间的理解和信任。
除了了解包涵体的形成，我们还需要了解如何处理包涵体。
以下是一些处理包涵体的方法：教育和宣传：教育和宣传对于处理包涵体至关重要。
我们可以通过开展教育课程、主题讲座、展览等形式，向公众普及包涵体的重要性和意义，增强人们的包涵意识和能力。
建立法律和制度保障：政府应该建立和完善法律和制度保障，禁止任何形式的歧视和偏见，并加大对歧视和偏见行为的惩罚力度。
同时，政府还应该制定和实施多元文化政策，促进不同文化的交流和融合，为少数民族和弱势群体提供平等的权利和机会。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
包涵体的形成以及处理方法
1 包涵体形成的原因
(1)表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体L2]。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成]。
(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。
(4)重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
(5)包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成。
因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。
(6)在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
(7)有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体? 。
包涵体的处理
包涵体的形成具有有利的一面，也有不利的一面。
有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。
同时，因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率，通常其表达量可占菌体总蛋白的10％～30％，甚至高达50％。
不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂，而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变，这些试剂价格昂贵，且复性的操作过程不好控制；另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀，有些还形成异构体【s] 5。
因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。
包涵体
的处理一般有如下几个步聚。
破碎细菌细胞
提取包涵体时，首先要裂解细菌，为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性，常常采取一些保护措施：合适的缓冲体系，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液；加
入保护剂，如还原剂DTT(2一巯基苏糖醇)、2一巯基乙醇；加防止水解酶作用的试剂，如酶的抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。
破菌的方法很多，主要包括以下几种：(1)渗透破碎法：
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
(2)冷热交替法：把待碎样品投人90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。
可用于提取蛋白质和核酸。
(3)反复冻融法：把待碎样品冷却到一2O℃，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。
这种方法虽简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质却不宜采用。
(4)超声波法：使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
根据不同待碎样品采用不同频率，不同时间；另外，超声波处理时溶液温度升高会使不耐热的物质失活，因此使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温。
避免溶液内存在气泡，这样会使蛋白质变性【6】。
(5)溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。
在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100 g至1 mg溶菌酶，37℃保温10 min，或者室温作用30 min，细胞就破坏了。
洗涤包涵体
洗涤包涵体前先8 000 r／rain，412离心15 rain，可使大多数包涵体沉淀，
与可溶性蛋白分离。
为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，利用洗涤液洗涤包涵体沉淀，常用去污剂Triton x一100或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂(如2 mol／L尿素或盐酸胍等)洗涤以除去脂类，但过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解【。
溶解包涵体
包涵体一般只溶于强的变性剂如尿素、盐酸胍，它是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质【8]。
另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。
还需加入还原剂，如琉基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)，常用浓度2～10 mM。
另外，尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素6～8 M ，盐酸胍5～7 M。
一般来讲，盐酸胍溶解力强于尿素，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，但缺点是容易使SDS—PAGE电泳条带变形【9]。
尿素的溶解度为7O％～90％，其分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去尿素不会造成大量蛋白质沉淀，以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
复性包涵体蛋白
由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白
从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成~1 。
一般在尿素浓度4 M 左右时复性开始，到2 M左右时结束。
对于盐酸胍而言，从4 M 开始，到1．5 M 时复性过程结束。
包涵体蛋白的复性是一个非常复杂的过程，除与控制蛋白质复性的过程相关外，还在很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，在较宽松的条件下复性效率可以达到95％以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法，很多蛋白的复性效率只有百分之几，一般说来，蛋白质的复性效率在2O％左右【l 2]。
复性中常采用的方法有以下几种：(1)稀释复性法，直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制【13)。
(2)透析复性法，好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模【1 。
(3)超滤复性，在生产中较多使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆地变性。
(4)柱上复性，是最近研究较多并成功地在生产中应用的一种复性方法，常用于复性的层析方法有疏水层析(HIC)法、亲和层析(AFC)法等。