大肠埃希菌检查用培养基适用性检查验证方案
快速鉴定大肠埃希菌方法的临床适用性的评估
法检 测结果有 良好 的一 致性 。结 论
床开展 。
关 键词 ： 大肠 埃希 菌 ； 色培 养基 ； 速鉴定 ； 显 快 评估
中图分 类号 ： ７ ． １Ｒ４ ６ ５ 文 献标 志码 ： Ｒ３ ８ ２ ； ４ ． Ａ
ｄ ｉ １ ． ９ ９ ｊｉ ｎ １ ７－ ４ ４ ２ １ ． ４ ０ ２ ｏ ：０ ３ ６ ／．ｓ ． ６ １７ １ ． ０ １ ０ ． ３ ｓ
见Ｄ ］ 。大肠 埃希 菌亦 可引起 腹膜 炎 、 胆道 感染 、 肺 养 １ ￣２ 观察 结果 。 ８ ４ｈ，
成为 医 院感 染 的重要 病原 菌 ， 因而对 大肠 埃希 菌 的
色培养基 上 的颜色 肉眼判读 ， 红色 菌落 为大肠 埃希
快速 鉴定甚 为重 要 。 近几 年来 已证 明科 玛嘉大 肠埃 菌 。 希 菌显 色 培养 基 是对 大 肠 埃 希菌 的一 种快 速 而有 １ ５ Ｊ ． ＡＭＥ Ｓ试 验 鉴 定 茵种 将 Ｊ ＡＭＥ Ｓ试 剂 滴 效 的鉴定 方法 ， 现介 绍一种 新 的快速 鉴定 大肠 埃希 加 于 无 菌滤 纸 上 ， 纸干 燥后 ， 无 菌 接种 环挑 取 滤 用 菌 的方法 ， 与科 玛嘉大肠 埃 希菌 显色 平板鉴 定 方 哥伦 比亚血 平 板 上灰 白、 平 ， 并 扁 有特 殊 臭 味 的可 疑 法进 行 比较 ， 报道 如下 。 １ 材料 和方 法 １ １ 菌株 来 源 １ ０株 经 法 国梅 里 埃公 司 ＡＴ ． ０ Ｂ 半 自动 细菌鉴 定仪 鉴定 为大 肠埃 希菌 ， 分离 于本 院
大 肠埃 希菌 是肠杆 菌科 中最 常见 的细 菌 ， 其分 离 率 往 往 居 临 床 首 位ｎ ， 以泌 尿 系 统 感 染 最 常 ］又 炎、 手术 创 口感染 等 ， 重 者可 引起 败血症 ， 年 已 严 近
培养基适用性检查
培养基适用性检查▪计数实验的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该内容的应用范围➢采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法➢标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限➢引入了对照培养基的概念➢判定的依据：回收率大于70％，且形态一致▪控制菌检查的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目➢采用标准菌种比较的判定方法➢根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法➢在检查中引入了涂布接种的概念1.概述培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。
计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。
培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。
微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。
2010《版中国药典》微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。
2、培养基适用性检查实验的一般要求2.1培养基适用性检查适用范围2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。
即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。
培养基适用性检查方法的验证.
培养基适用性检查方法的验证文件编号制订日期审核日期批准日期云南云科药业有限公司A：验证方案方案制订制订日期方案编号方案审核审核日期方案批准批准日期云南云科药业有限公司目录1．验证项目名称2．验证组织3．概述4．验证目的5．参照标准6．验证程序7．验证报告、评价及批准1．验证项目名称：培养基适用性检查方法的验证2．验证组织：姓名部门职务分工3．概述：通过验证以确认所采用的方法适合于培养基适用性检查。
根据培养基及菌的特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行培养基适应性检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
4．验证目的：细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适用性检查。
验证的目的是确认营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基适合细菌、霉菌及酵母菌数测定。
（确认所采用的方法适合于培养基适应性检查，为了保证检验结果的准确性，对现有的检验方法进行验证。
）5．参照标准：2010年版《中国药典》二部附录ⅪJ 计数培养基的适用性检查。
6.验证程序：6.1适用范围：适用于培养基适用性检查。
6.2被验证产品：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基。
6.3试验材料：6.4试验菌株：6.5合格标准：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
6.6验证方法：培养基在使用前应进行适用性的检查，通过对被检培养基上的菌落与对照培养基上的菌落比较，以确认所采用方法的可行性。
6.6.1菌液的制备：6.6.1.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
取上述营养肉汤新鲜培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7约为50～100cfu/ml的菌悬液备用。
培养基适用性检查规程
培养基适用性检查规程目的：建立一个培养基的灵敏度检查，确保培养基性能可靠。
范围：适用于微生物检验。
责任：微生物检验员。
依据：《中国药典》2010年版一部附录、2010版GMP实施指南规程：1.不应在同一无菌室内同时操作2个或2个以上菌株。
2.菌株传代次数不得超过5代（以菌种保存中心获及的冷冻干燥菌种为第0代）。
一、计数培养基的适用性检查1、菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在两小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
2、适用性检查取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml（50-100cfu）,分别注入无菌平皿中，立刻注入待检查营养琼脂培养基和对照营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备4个平皿（其中2个注入待检查营养琼脂培养基，另两个注入对照营养琼脂培养基）。
30-35℃培养48h，计数。
取白色念珠菌1ml（50-100cfu）,注入无菌平皿中，立刻注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基和对照玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备4个平皿（其中2个注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基，另两个注入对照玫瑰红钠琼脂培养基）。
23-28℃培养72h，计数。
3、结果判断若被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落数的70%，且菌落大小、形态两者一致，判断该培养基的适用性检查符合规定。
二、控制菌检查用培养基的适用性检查1.菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10-100cfu、每1ml50-100cfu和每1ml大于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录样品相关信息 基本信息主要仪器设备和试验耗材信息 主要使用的仪器设备 试验用培养基 试验用试剂 试验用菌种 试验环境 无菌室 洁净工作台 生物安全柜 试验方案 验证试验目的微生物限度检查方法草案 方法验证试验菌液制备计数培养基适用性检查控制菌检查用培养基使用性检查 供试液制备 方法验证菌落计数方法验证试验 控制菌检查方法的验证方法验证结论供试品微生物限度检查结果 样品相关信息 基本信息（三批）1 1.12 2.1 2.2 2.3 2.4 3 3.1 3.2 3.3 4 4.1 4.25 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.15.5.2 5.6 6 1 1.12主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备2.2试验用培养基2.2.1对照培养基2.2.2试验用培养基2.3试验用试剂2.4试验用菌种3试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
3.1无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
3.2超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录3.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录4试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过lOOOcfu,霉菌和酵母菌总数不得过lOOcfu，大肠埃希菌不得检出。
大肠埃希菌
Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。
用4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠埃希菌，检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole 试验为阳性或阴性即可报告结果。
原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶（GUD）。
MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色的反应强，易于观察。
通常将MUG与靛基质试验结合，来检测大肠杆菌。
如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。
2．仪器、设备及用具2.1无菌室微生物检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。
2.2 净化工作台2.3 培养箱（36℃±1℃）。
2.4 高压蒸汽灭菌器。
2.5 显微镜（1500×）。
2.6 恒温水浴（45℃±1℃）。
2.8 离心机（500~4000r/min）。
2.9 电冰箱。
2.10 匀浆仪。
2.11 366nm紫外灯。
2.12 玻璃器皿、器具[参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.2]。
3．试液、指示液。
3.1 0.9%无菌氯化钠溶液。
3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
3.3 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液。
3.4 靛基质（Kovacs）试液。
3.5甲基红试液。
3.6 V-P试液。
3.7 革兰染色液。
3.8 中性红指示液。
3.9 亚甲蓝指示液。
3.10 溴麝香草酚蓝指示液。
3.11 酸性品红指示液。
3.12 曙红钠指示液。
4．培养基4.1 营养肉汤4.2 营养琼脂4.3 胆盐乳糖(BL)培养基。
微生物限度检查——培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验.
制作人：王丽娟 重庆医药高等专科学校
控制菌检查—— 培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
提纲
一、控制菌种类 二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验 三、对照试验
一、控制菌种类
耐胆盐革兰阴性菌
白色念珠菌
大肠埃希菌
控制菌检查项目 梭菌 沙门菌
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
1.控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检查用培养基包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应进 行培养基的适用性检查，检查项目包括培养基的促生长、抑制能力和指示特性。
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌 生孢Fra bibliotek菌2.检查方法的适用性试验 检查方法及流程同“微生物计数法适用性检查” 所用阳性对照菌液不同 结果判断不同：控制菌检查用培养基制药检出阳性对照菌即可判为无抑菌性
三、对照试验
阳性对照试验 • • • 目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜 操作：同供试品操作，仅加入了不超过100cfu的阳性对照菌 结果要求：应呈阳性 阴性对照试验 • • • 目的：检查操作环境、试验物品、操作技术是否无菌 操作：用稀释剂代替供试品，其余同供试品。 结果要求：应呈阴性
培养基适用性检查报告
培养基适用性检查报告1. 试验目的：对培养基性能的质量控制，以保证微生物检验的质量。
2. 适用范围：适用于细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基和控制菌检查用的培养基的适用性检查。
需检查的培养基包括成品培养基、由脱水培养基和按处方配制的培养基。
3. 试验内容：3.1 .计数培养基的适用性检查3.1.1. 菌种：大肠埃希菌[CMCC( B)44102]金黄色葡萄球菌[CMCC( B)26003]枯草芽抱菌[CMCC( B)63501]白色念珠菌[CMCC (F) 98001]黑曲霉[CMCC ( F) 98003]接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或琼脂斜面培养基中，33C培养24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂斜面培养基中，26C培养48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50〜100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，26C培养7天，加入4ml含0.05% ( ml/ml )聚山梨酯80的0.9%的无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱。
然后，用管口带有薄的无菌棉花吸出抱子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50〜100cfu的菌悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在 2~8C ，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2~8C ，在验证过的贮存期内使用。
3.1.3.适应性检查3.1.3.1.细菌计数用培养基适应性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml (50〜100cfu ),分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2个平皿，混匀，凝固，置33C 培养48小时，计数。
用被检培养基和对照培养基(若无对照培养基可用其他厂家生产的培养 基)按上述方法进行试验，并记录。
试验结果报告见表 1。
2010大肠菌群检查用培养基适用性检查记录
表：2.1—056 大肠菌群检查用培养基适用性检查记录1、适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
2、验证目的：培养基适用性检查试验目的是为了确定实验室所使用培养基、制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。
3、参照标准：《中国药典》2010年版、《中国药品检验标准操作规范》2010年版6、实验操作6.1、乳糖胆盐发酵培养基：新鲜配制10ml/支的对照胆盐乳糖培养基，121℃灭菌15min，备用。
取5支，分别接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，各2支，接种菌液1ml（不大于100cfu），另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作。
置30～35℃，培养18h、24h，分别观察结果。
6.2、乳糖发酵培养基：新鲜配制10ml/支的对照乳糖发酵培养基，121℃灭菌15min，备用。
取3支，接种大肠埃希菌2支，接种菌液1ml（不大于100cfu），另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作。
置30～35℃，培养18h、24h，分别观察结果。
6.3、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）：新鲜配制对照EMB琼脂培养基，121℃灭菌15min，冷却至60℃倾注平皿，35℃培养箱预培8h后备用。
取5个无菌EMB琼脂平板，分别涂布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各2皿，接种菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于30～35℃倒置培养。
被检培养基同法操作。
18h、24h分别观察结果。
6.4、麦康凯琼脂培养基：新鲜配制对照麦康凯琼脂培养基，121℃灭菌15min，冷却至60℃倾注平皿，35℃培养箱预培8h后备用。
取5个无菌麦康凯琼脂平板，分别涂布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各2皿，接种液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接种作为空白对照，涂布均匀后于30～35℃倒置培养。
被检培养基同法操作。
18h、24h分别观察结果。
培养基适用性检查验证方案
培养基适用性验证方案编制:审核:批准:1.验证目的：本次验证的目的是确认无菌检查、微生物限度检查、控制菌检查用培养基应进行培养基的适用性检查，符合灵敏度要求。
2.参照标准2010版中国药典二部附录：XII A无菌检查法和XI G微生物限度检查法。
3.验证项目无菌检查、微生物限度检查、控制菌检查用培养基的适用性检查。
45.前提条件确认5.1所有本次验证实施过程中用到的仪器都已经过计量并且在计量有效期内。
5. 2所有参与本次验证的公司人员均进行相关培训6.接受标准6.1.液体培养基促生长能力检査：被检培养基与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
6.2.液体培养基指示能力桧查：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。
6.3.固体培养基促生长能力检査：被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
6.4.固体培养基指示能力检査：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
6.5.培养基抑制能力检査：试验菌应不得生长。
6.6.无菌性检查：应不得有菌生长。
6・7・被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落平均数的 生长的菌落大小、形态特征应一致。
7. 验证实施7.1 •试验用仪器和物料所用培养皿、移液管、工器具均应严格按照相关的灭菌程序灭菌；生物安全柜、灭菌器、霉菌培 养箱、生化培养箱、水浴锅、电热鼓风干燥箱等。
72验证用培养基及试剂适用性检查:70%,且74测试菌悬液菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30〜35 ° C培养18〜24小时。
分别取上述新鲜培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50^100cful的菌悬液。
接种生抱梭菌至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35 C培养18〜24小时。
上述新鲜培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数lO^lOOcfu的菌悬液。
培养基使用性检查操作规程
培养基适用性检查操作规程编制人：日期：部门：微生物室审核人：日期：替代：批准人：日期：执行日期：1、目的建立一个培养基适用性检查操作规程。
2、适用范围微生物限度及无菌检查的成品培养基，由脱水培养基或按处方配置的培养基均应进行培养基适用性检查。
3、检验依据按2010年版《中国药典（一、二部）》附录无菌方法进行测试检查。
4、试验所需菌种大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌；黑曲霉。
5、标准规定5.1 无菌培养基使用性检查5.1.1 无菌性：每批培养基随机取不少于5支（瓶），经培养14天应无菌生长。
5.1.2 灵敏度：经培养对照管应无菌生长，试验管接菌小于100cfu均应生长良好。
5.2 微生物限度使用性检查5.2.1 细菌、霉菌和酵母菌计数检查取标准菌株大肠、金葡、枯草、白念、黑曲霉菌50～100cfu,分别接入于测试与对照培养基，经规定温度、时间培养，测试结果测试与对照培养基平均菌落数比不应小于70%。
5.2.2 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查取新鲜标准菌株大肠、金葡、铜绿假单胞菌制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养基进行促生长能力、抑制能力及指示能力测试，结果被测培养试验菌的生长反应情况与对照培养基一致。
（液体培养基应记录为生长良好/生长微弱/未生长；固体培养基应记录为符合xx菌特征/不符合xx菌特征）。
5.2.3 大肠埃希菌、大肠菌群检查取新鲜标准菌株大肠、金葡球菌制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养基进行促生长能力、抑制能力即指示能力测试，结果被测培养基试验菌的的生长反应情况应与对照培养基一致。
（液体培养基应记录为生长良好/生长微弱/未生长；固体培养基应记录为符合xx菌特征/不符合xx菌特征）。
5.2.4白色念珠菌、梭菌检查取新鲜标准菌株大肠、白念、生孢梭制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养进行促生长能力、抑制能力及指示能力测试，结果被测培养基试验菌的生长反应情况应与对照培养基一致。
控制菌检验方法验证
（七）控制菌检验方法验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查方法测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应该进行重新验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
1.验证用菌株大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B)44102】、验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌珠的生物学特性。
2.菌液制备接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35-37℃培养18~24小时;分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10~100cfu的菌悬液。
2.1阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。
方法同试验组，验证大肠埃希菌的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。
阴性对照菌不得检出。
2.2常规法大肠埃希菌取相当于1g木香顺气丸的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10~100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10~100cfu，35~37℃培养18~24小时，取出培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。
2.3进行3次独立平行试验。
回收率阳性菌培养时间菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数大肠埃希菌结果判断：以上试验菌回收不低于70%，则可按常规法进行控制菌检查。
结论：本品按中国药典2010版微生物限度检查，经方法适用性验证试验，结果可用平皿法进行细菌计数方法检验，用平皿法进行霉菌和酵母菌计数方法检验，用常规法进行控制菌检查。
检验者：校对者：。
培养基适用性检查验证方案
编号: AB/06-31-B培养基适用性验证方案计数培养基****药厂有限公司标题培养基适用性验证方案编号AB/06-31-B页码共5页、第1页执行200 年月日颁发部门GMP综合办公室分发部门行政管理办公室分发数起草人起草日期审核人审核日期批准人批准日期目录1. 概述 (2)2. 验证目的 (2)3. 验证的范围 (2)4. 验证人员及职责 (2)5. 验证程序和方法 (2)6. 验证可接受的标准 (3)7. 验证步骤 (3)8. 结果分析及评价： (4)9. 验证报告 (5)10. 建议 (5)11. 最准批准 (5)12. 所使用的记录 (6)1. 验证目的：细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。
本次验证的目的是确认营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基适合细菌、霉菌及酵母菌数测定。
2. 参照标准：2010版中国药典二部附录XI J微生物限度检查法。
3. 验证项目：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基的适用性检查。
4.验证小组人员及职责：4.1验证小组人员:4.2验证人员职责及要求4.2.1按验证方案及相关文件实施验证。
4.2.2认真观察并做好验证原始记录。
4.2.3对实施验证的结果负责。
4.3验证中各部门的职责4.3.1验证领导组职责4.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。
4.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
4.3.1.3负责验证方案的批准工作。
4.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。
4.3.1.5负责验证报告的批准工作。
4.3.2验证工作小组职责4.3.2.1负责验证方案的起草工作。
4.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。
4.3.2.3负责验证方案的实施。
4.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。
4.3.2.5参与验证结果的评价工作。
4.3.3质量部职责4.3.3.1负责公司验证日常管理工作。
4.3.3.2负责验证方案的审核工作。
4.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。
培养基适用性检查标准操作规程
培养基适用性标准操作规程第 1 页共4页1目的规范培养基适应性检查的标准操作。
2范围本规程适用于《中华人民共和国药典》2010年版二部规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检査。
3责任3.1本规程由质量保证中心主任指定人员起草。
3.2与本文件相关的部门负责人参与审阅，企业质量负责人批准本文件。
3.3质量控制中心负责具体实施本规程。
4内容4.1依据4.1.1《药品生产质量管理规范》（2010年修订）4.1.2《中华人民共和国药典》2010年版二部4.2试验用菌株及培养基4.3试验用仪器设备4.3.1恒温培养箱（30～35℃）、霉菌培养箱（23～28℃）、蒸汽压力灭菌器、净化工作台、电热干燥箱、恒温水浴锅、振荡器、电冰箱、天平4.3.2锥形瓶、培养皿（9cm）、量筒、试管及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）4.3.3接种环、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、火柴、记号笔、灭菌镊子、不锈钢药匙、白瓷盘。
4.4操作步骤4.4.1菌液的制备4.5.1.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24h。
取30～35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液，备用。
4.5.1.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，于23～28℃培养24～48h。
取于23～28℃培养24～48h的白色念珠菌新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液备用。
4.5.1.3 接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，于23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.05%（ml/ml)聚山梨酸酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml)聚山梨酸酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液备用。
大肠埃希菌检查法
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载大肠埃希菌检查法地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容大肠埃希菌检查法Escherichia Coli Test Method1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。
3.责任者QC化验员。
4.程序：4.1.简述4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。
埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。
大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。
在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。
大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。
为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。
MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。
培养基适用性检查
培养基适用性检查▪计数实验的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该内容的应用范围➢采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法➢标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限➢引入了对照培养基的概念➢判定的依据：回收率大于70％，且形态一致▪控制菌检查的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目➢采用标准菌种比较的判定方法➢根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法➢在检查中引入了涂布接种的概念1.概述培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。
计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。
培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。
微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。
2010《版中国药典》微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。
2、培养基适用性检查实验的一般要求2.1培养基适用性检查适用范围2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。
即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。
大肠埃希菌检查用培养基适用性检查验证方案
1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。
适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。
供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
2.验证目的：本次验证的目的是确认大肠埃希菌检查用的麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。
3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。
4.验证项目：麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的适用性检查。
5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。
如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。
7.验证小组人员及职责:7.2验证人员职责及要求7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。
7.2.2认真观察并做好验证原始记录。
7.2.3对实施验证的结果负责。
7.3验证中各部门的职责7.3.1验证领导组职责7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。
7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。
7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。
7.3.1.5负责验证报告的批准工作。
7.3.2验证项目小组职责7.3.2.1负责验证方案的起草工作。
7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。
7.3.2.3负责验证方案的实施。
7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。
7.3.2.5参与验证结果的评价工作。
7.3.3质量部职责7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。
7.3.3.2负责验证方案的审核工作。
7.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。
GB5750.12-2023-7.3大肠埃希菌检测(酶底物法)方法验证报告
方法验证报告项目名称：生活饮用水大肠埃希菌的测定（酶底物法）方法名称：《生活饮用水标准检验方法第12部分：微生物指标》GB/T 5750.12-2023 7.3酶底物法报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况 1.1 人员情况表1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况 表2使用仪器情况登记表1.3 检测用试剂情况表3使用试剂登记表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在温度18⁓26℃，湿度45%⁓65%的要求范围内，满足检测环境条件，实验室人员每天对环境条件进行监控。
另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。
2 实验室检测技术能力 2.1检测步骤2.1.1样品稀释检测所需水样为100ml。
若水样污染严重，可对水样进行稀释，取10ml水样加入到90ml无菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。
2.1.2定性反应将100ml水样加入100ml无菌稀释瓶中，加入2.7gMMO-MUG培养基粉末，混合均匀使之完全溶解后，放入36℃±1℃培养箱内培养24h。
2.1.3 10管法将100ml水样加入100ml无菌稀释瓶中，加入2.7gMMO-MUG培养基粉末，混合均匀使之完全溶解。
准备10支无菌试管，用无菌吸管分别从上述稀释瓶中取10ml水样加至各试管中，放入36℃±1℃培养箱内培养24h。
2.1.4试验数据处理2.1.4.1结果判读将水样培养24h后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28h 进行结果判读,超过28h后出现的颜色反应不作为阳性结果。
水样变为黄色同时有蓝色荧光判定为大肠埃希氏菌阳性，水样未变黄色而有荧光产生不判定为大肠埃希氏菌阳性。
2.1.4.2定性反应水样经24h培养之后如果颜色变成黄色，在暗处用波长366nm的紫外灯照射，如果有蓝色荧光产生判断为阳性，表示水中含有大肠埃希氏菌。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
.
1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。
适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。
供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
2.验证目的：本次验证的目的是确认大肠埃希菌检查用的麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。
3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。
4.验证项目：麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的适用性检查。
5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。
如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。
7.验证小组人员及职责：
7.1验证小组人员:
7.2验证人员职责及要求
7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。
7.2.2认真观察并做好验证原始记录。
7.2.3对实施验证的结果负责。
7.3验证中各部门的职责
7.3.1验证领导组职责
7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。
7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。
7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。
7.3.1.5负责验证报告的批准工作。
7.3.2验证项目小组职责
7.3.2.1负责验证方案的起草工作。
7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。
7.3.2.3负责验证方案的实施。
7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。
7.3.2.5参与验证结果的评价工作。
7.3.3质量部职责
7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。
7.3.3.2负责验证方案的审核工作。
7.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。
7.3.3.4负责检验仪器及检验方法的验证。
7.3.3.5负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。
7.3.3.6负责对验证人员的培训、考核工作。
7.3.3.7负责验证资料和报告的审核工作。
7.3.3.8负责验证文件回收、归档管理工作。
8.合格标准：
8.1被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；
8.2被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
9.验证实施条件
9.1验证方案培训：在验证实施前，应对参与验证的人员进行验证方案以及与验
证相关的文件进行培训，确保相关人员掌握了验证的相关要求与知识。
9.2微生物限度检测室：检验所使用的检测室应经过HVAC系统确认，并符合要求。
9.3检验用水：验证过程使用的纯化水其制备系统应经过确认并符合要求，纯化水质量应经过检验并符合《中国药典》2015年版二部的要求。
9.4检验仪器设备：验证涉及的检验仪器（设备）与检验方法，应经过技术监督局校验合格或者公司确认/验证合格。
9.5验证菌种：验证所使用的菌种，其种类与传代次数应符合《中国药典》的相关要求。
菌种情况见附件2:菌种确认。
10.验证过程
10.1菌液制备
取经30-35℃培养18-24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍递增稀释至10-6-10-8，约为≤100cfu/ml的菌悬液备用。
10.2实验操作
10.2.1麦康凯液体培养基：新鲜配制100ml/瓶的对照麦康凯液体培养基5瓶，121℃灭菌15min，备用。
取4瓶，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌各2瓶，接种菌液量0.1ml（≤100cfu）；另一瓶，不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作。
置42～44℃，培养24～48h，分别观察结果。
10.2.2麦康凯琼脂培养基（MacC）：新鲜配制对照MacC琼脂培养基，121℃灭菌15min，冷却至60℃倾注平皿，35℃培养箱预培8h后备用。
取3个无菌MacC琼脂平板，涂布接种大肠埃希菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌≤100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于30～35℃倒置培养。
被检培养基同法操作。
18h观察结果。
10.3.检查结果：见附件5：大肠埃希菌检查用培养基适用性检查结果
11.异常情况与偏差处理：当出现偏差时，应按《偏差处理管理规程》进行处理。
12.验证结果评定、结论与建议
验证小组组长负责收集各项验证、试验记录，根据验证、试验结果对验证效果进行综合评审，起草验证报告、做出验证结论。
对验证结果的评审应包括以下内容：
12.1验证试验是否有遗漏？
12.2
验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？
12.3验证记录是否完整？
12.4验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要进一步补充试验？
13.附件
13.1 附件1:验证实施条件确认 13.2 附件2:培养基确认 13.3 附件3:菌种确认 13.4 附件4:菌液浓度确定
13.5 附件5:大肠埃希菌检查用培养基适用性检查结果 13.6 附件6:验证结果审批表
附件1： 设施设备验证确认
确认结论：
确认人： 确认日期：
附件2： 培养基确认
附件3：
菌种确认
确认结论：
确认结论：
确认人： 确认日期：
确认人：确认日期：
附件4：菌液浓度确定
根据要求，菌数要控制在每1ml中含菌数在≤100cfu，因此，我们确定菌液制备浓度为：金黄色葡萄球菌: 大肠埃希菌：
附件5：大肠埃希菌检查用培养基适用性检查结果
表6:验证结果审批表。