自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。

反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。

需要自己配置的其他物品：

除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览：

产品概述：

特异性：TUNEL 反应优先标记凋亡产生的DNA 链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑

制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA 链断裂

实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA 链断裂可能缺失或不完全。空间位阻，

如细胞外元件可能阻止TdT 到达DNA

断裂处。两种情况均能产生假阴性。

假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA 片段

DNA 链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生

假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查

凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，

细胞形态评估是一项重要的参数

样本：细胞离心涂片和细胞涂片

在chamber slides 上培养的黏附细胞 冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本 分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透 检测次数：一个试剂盒50T

步骤和所需材料：

1 流程图：

2 样品准备

黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片

需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS）

Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2

Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph ，新鲜配制

Permeabilisation solution 渗透液：%Triton1）X-100溶于%柠檬酸钠溶液

中，新鲜配制

步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。

组织部分

福尔马林-包埋组织

福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。如用蛋白酶K，不含核酸酶，浓

度、孵育时间和温度应按组织类型优化

注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K，因其经检测不含核酸酶，

核酸酶可导致假阳性。

另外3中替代方法在下表中描述（step 2）

需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中）

Washing buffer：PB S

蛋白酶K，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于10mM Tris/HCL

中，]

替代处理方案

※渗透溶液：%Triton1）X-100，溶于%柠檬酸钠的，新鲜配制

※胃蛋白酶*（%%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白酶*，HCL，不含核

酸酶

※0.1M柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射

步骤：下表描述了用蛋白酶K（不含核酸酶）和3中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的方法

冰冻组织处理（略）

3 标记草案

开始之前

准备TUNEL反应混合液：每一对管子（小瓶1：酶溶液，小瓶2：标记溶液）足以用于50ul

反应体系的10张片子，和2个50ul标记溶液的阴性对照。

注意：TUNEL反应混合液应于用前临时配制，不能储存。TUNEL

需准备的其他试剂：微球菌核酸酶或

DNase I，重组，级别1*

黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案

需准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS

湿盒

Parafilm石蜡封口膜或盖片

困难组织标记草案（略）

信号转换

需要准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS

湿盒

Parafilm石蜡封口膜或盖片

DABA底物或POD替代底物

光镜镜检封固剂

4. 附件：

Troubleshooting