动物病原学实验(动药专业)

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实验三、培养基的制备
实验三、培养基的制备
一、 目的要求： 1、 掌握基础培养基制备的原则和要求; 2、 掌握一般培养基的制备过程及PH的测定 二、 实验材料:（略） 三、 操作方法： 1、普通肉汤的制备：按量称取→加热溶解→调PH →过滤→分装→灭菌→菌检 分别称取牛肉膏 5g 蛋白胨10g NaCl 5g 磷酸氢二钾1g 蒸馏水1000ml 置铝锅内加热溶解，取5ml肉汤于试管内，用0.1N NaOH校PH至7.4-7.6，并根据其用量计算所配培养 基需用的1N NaOH量，调PH， 测好PH后，取500ml肉汤至量筒，余下的倒入大烧杯 用滤纸过 滤，分装10根短试管，余下的装入盐水瓶。 2、普通琼脂培养基的制备：称取琼脂→肉汤内溶化→分装试管→灭菌→菌检 将量筒内的500ml肉汤倒入铝锅，加入10g琼脂条，加热溶解，加热中搅动，用纱布棉花过滤，分装 长试管10管，余下装入盐水瓶。 以上培养基分装完毕，捆扎好，每组做标记。 3、将分装好的培养基扎口后高压灭菌（121℃，20-30分钟）。 4、菌检 四、作业： 1、 制作培养基时应注意哪几点？为什么高压灭菌前需调PH稍高些？ 2、 测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时，采用0.1N NaOH溶液，而将全部肉汤培养基调至 PH7.6 时，却改用1N NaOH溶液，为什么？ 3、 普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途？
一 目的要求
1、掌握基础培养基制备的原则和要求 2、掌握一般培养基的制备过程及PH的测 定
二 培养基的种类及用途
1、固体培养基：分离培养、纯培养、保 存菌种 2、半固体培养基：细菌运动 3、液体培养基：观察细菌的生长状况、 保存菌种
三、培养基制作的注意事项
1、细菌生长所需的营养物质 2、盛器均需无菌，不含抑菌物 3、必须符合生长要求 PH 4、要过滤，应为半透明或透明 5、制好后需高压灭菌
四、培养基制备的一般过程
按量称取→溶解→调PH→过滤 →分装→灭菌→菌检
五、PH测定方法
1、 以空试管取5ml溶解的肉汤，用1ml 滴管吸0.1N NaOH，滴定，边滴边测 PH，PH7.6时，计量NaOH用量。算出 实际用量。 2、改用1N NaOH调PH7.6。
基础培养基制备
• • • • • 1、配方： 牛肉膏5克 蛋白胨10克 NaCL5克 磷酸氢二钾1克 蒸馏水1000ml 2、按量称取→溶解→调PH→过滤 →分装10根短管→灭菌→菌检
1、玻片的处理：旧玻片有油，用95%酒精擦洗，然后在酒精灯上灼烧
2、细菌抹片的制备：抹片 根据所用材料不同，抹片的方法也有差异。 （1）固体培养物 用经酒精灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水1-2环于清洁 无油脂的载玻片中央，再勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，涂抹成直 径为1-1.5cm大小的均匀的抹片。 （2）液体培养物 可直接用灭菌接种环勾取细菌培养物1-2环，涂抹于玻片上即 可。但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。 （3）组织涂片 用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压 印或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。 （4）无论何种方法切忌涂片太厚，否则不利于染色和观察。
一、目的要求
1。掌握细菌抹片的制备方法 2。掌握几种常用的染色方法和技 术及无菌操作技术 3。巩固显微镜的使用，了解细菌 的染色特性、形态
二、材料
1、大肠杆菌：斜面、肉汤 金黄色葡萄球菌：斜面 炭疽杆菌：斜面 2、革兰染色液、美兰染色液 3、载玻片、接种棒、酒精灯等
三、制片及染色步骤
取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色干燥镜检
1。甲醇固定3 ’，时间长短均可 2。姬姆萨液足量30 ’或数小时至24h， 水洗 3。吸干镜检
（三）瑞氏染色法
抹片干燥无需固定，直接滴加染色 液 1-3 ’，再加等量中性蒸馏水， 轻轻混匀，续染15 ’，水洗，吸干 镜检
（四）美兰染色法
1。固定好抹片加上足量染液2-3 ’ 2。吸干镜检
注意事项
实验四
一、目的要求
细菌的分离培养及移植
1、 掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法 2、 使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落
二、实验材料
1、培养基：普通琼脂平板 每人2块 普通琼脂斜面、普通肉汤 每人各1支 2、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面、大金混合肉汤、感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的小白鼠 3、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、记号笔
四、常用的几种染色方 法
1、革兰氏染色法 2、姬姆萨染色法 3、瑞氏染色法 4、美兰染色法
（一）革兰氏染色法
1。草酸铵结晶紫染色1-2’，水洗 2。革兰氏碘液媒染1-2’，水洗 3。95%酒精脱色约30’’-1’，水洗 4。沙黄水溶液复染10 ’ ’-30 ’ ’，水洗 5。吸干，镜检
（二）姬姆萨染色法
一、目的要求
1、掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法 2、使被检材料适当稀释，以求获得独立单在 菌落
实验材料
• 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面
• 大肠杆菌金黄色葡萄球菌混合肉汤 • 实验动物：感染了大肠杆菌金黄色葡萄球菌的小白鼠 • 培养基：普通琼脂平板、斜面、
二、需氧分离培养方法
1、平板划线分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用） 2、芽胞需氧分离培养法：80℃ 15－20分钟 杀死 不耐热细菌，再接种至平板 3、化学药品分离培养法：抑菌作用
• 接种完毕标明细菌、日期、自己的记号， 试管置37℃，恒温箱培养24小时（平板倒 置），第二天下午抽时间看培养结果。
作业
• • 1、何谓纯培养？分离纯培养的目的何在？ 2、在挑取固体培养物上的细菌作平板划 线时，为什么每次都要将接种环上剩余的 细菌烧掉？ 3、为什么要把培养皿倒置培养？
三、需氧分离培养方法：
1、 平板分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用） 2、 芽胞需氧分离培养法：80℃ 15－20分钟 杀死不耐热细菌 3、 化学药品分离培养法 4、 实验动物分离培养法
四、实验内容：
1、 平板划线法（组织→平板）、（金+大）肉汤→平板，每人二块 2、 肉汤培养（斜面→肉汤），每人一支，（大）斜面→肉汤 3、 斜面移植（斜面→斜面），每人一支，（金）斜面→斜面 接种完标明细菌、日期、自己的记号，置37℃，恒温箱培养24小时（平板倒置），第二天抽时间看培养结果。
动物病原学实验
潘子豪
进入实验室的注意事项
1 穿工作服 2 书本等物品放入抽屉 3 树立无菌概念 4 不能抽烟、吃零食 5 爱护公物，注意节约
一、目的要求： 1、了解显微镜的简单构造原理 2、学习掌握油镜的使用技术 3、观察细菌的基本形态 二、实验材料：普通光学显微镜 、香柏油、二甲苯、擦镜 纸、 标本玻片:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、枯 草杆菌、炭疽杆菌 三、普通光学显微镜的基本结构 四、几种显微镜的简单原理 1、暗视野 2、相差 3、荧光 4、电子 五、油镜的识别及使用和原理 六、使用完毕显微镜及标本片的处理 七、作业： 1、普通显微镜与油镜使用上有何区别？ 2、绘出你所观察到的细菌形态。
杀菌作用 鉴别作用
4、实验动物分离培养法：本种动物或小鼠
三、实验内容
• 1、平板划线法（金黄色葡萄球菌+大肠杆菌肉 汤→平板），每人一块，小鼠肝脏→平板，每 人一块 2、肉汤培养（斜面→肉汤），每人一支，大 肠杆菌斜面→肉汤 3、斜面移植（斜面→斜面），每人一支，金 黄色葡萄球菌斜面→斜面
• •
标记
3、固定 （1）目的: 1)、除去抹片上的水分，使菌体蛋白附着在载玻片上 ，以防染色过程中被水冲掉。 2)、使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强。 3)、能杀死抹片中的部分微生物。 （2）方法： 1)、火焰固定 将已干燥的抹片菌膜向上，以钟摆速 度在酒精灯火焰上通过数次（以不烫手背为宜）。 2)、化学固定 加数滴甲醇于玻片上，固定2-3分钟， 自然
琼脂培养基的制备
测好PH后，取500ml肉汤至量筒， 余下的倒入大烧杯，把量出的 500ml再倒入锅中，称量10g琼脂， 边加热边搅动，看一下水位，补足 水分。 琼脂完全溶解后以棉花沙布过滤， 分装10根长管。
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作业
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1、制作培养基时应注意哪几点？为什么 高压灭菌前需调PH稍高些？ 2、测较少量肉汤培养基的酸碱度至 PH7.6时，采用0.1N NaOH溶液，而将 全部肉汤培养基调至PH7.6时，却改用1N NaOH溶液，为什么？ 3、普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么 用途？
四、油镜的识别及使用原理
1 光圈调最大 2 标本上滴加香柏油0.5-1滴 3 转换油镜头浸入油滴中
五、使用完毕显微镜及标本片的处理
油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头和玻片擦拭干净 如油渍已干，须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶液拭去油渍， 再用干擦镜纸拭净镜头
作业
1。普通显微镜与油镜使用上有何区别？ 2。绘出你所观察到的细菌形态
• 1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开 • 2、涂片不宜太厚，涂布时宜轻不宜重 • 3、保持无菌操作，试管开塞回塞前，管口 消毒 • 4、接种棒使用前后一定要在火焰上彻底灼 烧灭菌，挑菌前待接种棒冷却后才用
作业
1。根据实验体会，你认为制备染色标本时应 注意哪些事项？ 2。在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和 炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性还是阴 性菌？ 3。作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ 其染色成败关键一步是什么？
实验一 显微镜的构造和使用 及细菌形态结构的观察
普通光学衍射
分为光学显微镜和电子显微镜。 光学显微镜又分为单式和复式。
• 使用前侧面注视，调节粗焦轮（物镜距玻片5mm）； • 双目注视时，反时针调节粗焦轮，可见模糊镜像，顺时针 调节细焦轮； • 每旋转一周粗焦，镜筒升降10mm，细焦0.002mm，先 低倍后高倍； • 低倍使用时下降聚光器，高倍使用时上升聚光器。光线充 足使用平面镜，光源不足使用凹面镜； • 使用高倍前先使用低倍选择目标视野，转移镜头换高倍， 重新调节亮度。更换玻片时，重新低倍开始； • 使用完毕后，仔细擦拭，一切归位。
变形杆菌
鞭毛特殊染色
枯草杆菌，革兰氏染色
枯草杆菌，芽胞简易染色
葡萄球菌，革兰氏染色
大肠杆菌，革兰氏染色
破伤风梭菌，芽胞染色
实验二 细菌抹片的制备方法、 染色及显微镜观察
实验二 细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察
一、 a) b) c) 二、 三、 四、 1、 目的要求： 掌握细菌抹片的制备方法 掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术 巩固显微镜的使用，并了解细菌的染色特性、形态 材料：炭疽杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌斜面，大肠杆菌肉汤 制片及染色步骤：取干净玻片→抹片→干燥→固定→染色→干燥镜检 常用的几种染色方法 革兰氏染色法
（1） （2） （3） （4） （5）
草酸铵结晶紫染液1-2分钟，水洗 革兰氏碘液媒染1-3分钟，水洗 95%酒精脱色30秒-1分钟，水洗 沙黄水溶液复染10-30秒，水洗 吸干，镜检
2、 姬姆萨染色法 （1） 甲醇固定3分钟，时间长短均可 （2） 姬姆萨液足量30分钟或数小时至24小时，水洗 （3） 吸干，镜检 3、 瑞氏染色法 抹片干燥无需固定，直接滴加染液1－3分钟，再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15分钟水洗，吸干镜检 4、 美兰染色法：甲醇固定3分钟， 加上足量染液2－3分钟，水洗，吸干镜检 五、作业： 1、 根据实验体会，你认为制备染色标本时应该注意哪些事项？ 2、 在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性菌还是革兰阴性菌？ 3、 作革兰氏染色时，涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？
五、作业 1、 何谓纯培养？分离纯培养的目的何在？ 2、 在挑取固体培养物上的细菌作平板划线时，为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉？ 3、 为什么要把培养皿倒置培养？
1、 平板划线法（组织→平板）、 （金+大）肉汤→平板，每人二块
2、 肉汤培养（斜面→肉汤），每人 一支，（大）斜面→肉汤
3、 斜面移植（斜面→斜面），每人 一支，（金）斜面→斜面