用测试片法快速检测金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法Revised as of 23 November 2020金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
食品中金黄色葡萄球菌定量检测能力验证
金黄色葡萄球菌测试片 Baird-Parker 平板
金黄色葡萄球菌测试片 Baird-Parker 平板
金黄色葡萄球菌测试片
10-1 ＞ 200 ＞ 200 ＞ 200 ＞ 200 ＞ 200 ＞ 200 ＞ 200
稀释度 10-2 10-3
29
0
总之，此次食品金黄色葡萄球菌定量检测能力验证极大丰富了检 测人员的检测经验。实验中对培养基进行前期培养不仅便于观察，还 有助于计数。如检测中检出阳性样品可结合 Baird-Parker 平板计数等 多种检测方法对检测结果进行佐证，这样检测的结果才会更加准确。
33
2
22
3
21
0
35
2
38
3
34
2
10-4 结果（CFU/g）
0
3.1×103
0
2.7×103
0
2.1×103
0
2.2×103
0
3.5×103
0
3.8×103
0
3.4×103
Baird-Parker 平板 ＞ 200 39
3
0
5 金黄色葡萄球菌测试片 ＞ 200 29
2
0
Baird-Parker 平板 ＞ 200 27
3
0
6 金黄色葡萄球菌测试片 ＞ 200 66
7
0
Baird-Parker 平板 ＞ 200 69
7
0
7 金黄色葡萄球菌测试片 ＞ 200 31
5
0
Baird-Parker 平板 ＞ 200 29
5
0
8 金黄色葡萄球菌测试片 ＞ 200 17
金黄色葡萄球菌的致病性及检测技术
谢谢观看！
此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
检测与诊断
标本采集
采自不同感染部位的各种标本，包括血液、脑脊液、穿刺液；痰液、脓液、创伤分 泌物、尿液、粪便和呕吐物等。
直接涂片镜检
直接涂片检查在正常情况下呈无菌状态的体液标本如血液、脑脊液、穿刺液等，若有 检出革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列、无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm的球菌。即具有 重要的临床价值。
显色培养基A计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，36℃±1℃培养24 h， 按说明书判读，可疑菌落做补充实验（血浆凝固酶试验，目标菌落血浆凝固酶试验为阳 性）。 显色培养基B计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，36℃±1℃培养24 h， 按说明书判读，可疑菌落做补充实验（滴加1 mol/L盐酸，目标菌落有透明圈）。
鉴别实验
一、血浆凝固酶试验
血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌所产生的，与其致病力有关的一种侵袭性酶，其作用 是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬。 血浆凝固酶分为结合型和游离型。前者结合在细菌的细胞壁上，能直接作用于血浆中的 纤维蛋白原，使之转化为纤维蛋白，环绕菌体而形成凝块。而游离型血浆凝固酶则在产 生后被分泌到菌体外，不能直接作用于纤维蛋白原，但可以激活血浆凝血酶原，使之转 化成凝血酶，后者再作用于纤维蛋白原使其转化为纤维蛋白。 具体的测量方法也因此分为玻片法和试管法两种。
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺 血和坏死 b.杀死白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞
c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌 体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关
食品中金黄色葡萄球菌检验 GBT4789.10-2010
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定性方法
2003版
结 果 判 定
划线Baird-Parker平板：
§菌落直径为2mm～3mm ； §颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外 层有一透明圈； §用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非 脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈；
§长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产 生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥；
方法的注意事项
�
使用前，如Baird－Parker平板表面有水珠，可放 在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的 水珠消失。 如样液不易吸收，可将平板放在36℃±1℃孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿， 再培养。
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Baird-Parker法
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计算
统一了样品的处理程序 增加了计数要求 选择20—200cfu菌数的平板
ml 无 加 10 10ml 菌水溶解
于37°C 下进行孵育 24小时
Baird Parker 琼脂 + RPF 与平板表面计数法的比較
g样品 + 225 ml 稀释液 25 25g 225ml
第一天
第二天
BPA+RPF BPA
阅读結果 ) (无需确认 无需确认)
挑可疑菌落 酶试验 进行凝固 行凝固酶试验
第三天
确认结果
MPN法
� � � � � �
依据
AOAC 987.09 FDA BAM 2001 德国 DIN EN ISO 6888-3:2003 SN0172-92标准 台湾检验方法 欧美国的一些产品的卫生标准要求
图 1 Baird －Parker 平板法检验程序 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌Baird Baird－ Parker平板法检验程序
实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
食品中微生物的检测-金黄色葡萄球菌检验
免疫学方法
抗原制备
从金黄色葡萄球菌中提取特异性抗原，制备 成免疫原。
抗体制备
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过凝集 反应、沉淀反应等方法检测样品中的金黄色
葡萄球菌。
抗原抗体反应
将免疫原注射到动物体内，刺激机体产生特 异性抗体。
结果判定
根据反应结果判断样品中是否含有金黄色葡 萄球菌。
分子生物学方法
食品中微生物的检测-金黄 色葡萄球菌检验
目录
• 引言 • 金黄色葡萄球菌概述 • 样品采集与处理 • 微生物学检测方法 • 理化检测方法 • 结果分析与报告 • 质量控制与实验室安全
01
引言
目的和背景
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是一种常见的食品污染源，可引起食物中毒，对公众健康构成威胁。因此，检测食品中的金黄 色葡萄球菌对于保障食品安全具有重要意义。
适量性
根据检测方法和目的，采 集适量样品，以满足检测 需求。
样品保存与运
低温保存
样品应尽快放入低温环境 （如4℃冰箱）中保存，以 减缓微生物的生长速度。
避免反复冻融
尽量避免样品在保存过程 中反复冻融，以免影响微 生物的存活和检测结果的 准确性。
快速运输
样品在运输过程中应保持 低温，并尽快送达实验室 进行检测。
04
微生物学检测方法
传统培养法
增菌培养
将液体样品接种到选择性增菌液 中，于适宜温度下培养一定时间 ，使金黄色葡萄球菌得以增殖。
鉴定
通过观察菌落形态、革兰氏染色 、血浆凝固酶试验等生化特征进 行鉴定。
01
02
样品处理
取适量食品样品，进行均质化处 理，得到均匀一致的液体样品。
03
04
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
3M Petrifilm(TM)金黄色葡萄球菌检验测试片的评价-论文
第５ ０卷 （ 总第 １ ８ ２期 ）
董健等 ： ３ Ｍ Ｐ ｅ ｔ ｒ ｉ ｉ ｆ ｌ ｍ Ｍ 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检验 测 试 片 的评 价 Ｔ
５ ７
＝ ｝ ｝ Ｅ 号 ２ ０ １ ３ — ０ ３ 一 Ｋ Ｈ、 ２ ０ １ ３ — ０ ４ 一 Ｋ Ａ、 ２ ０ １ ２ — ０ ９ 一 Ｋ Ｃ， ３ Ｍ
检测试剂盒评价方法》 要 求 ， 对 ３ Ｍ Ｐ ｅ ｔ ｒ ｉ ｉ ｆ ｌ ｍＴ Ｍ 金
黄 色葡 萄球菌 检 验测试 片进行 了评 价实 验 。以评 估 其 在食 品卫生 检测 中的准 确性 和适 用 性，研 究 建立 检验测 试 片评价 模 型。
１ 材 料和 方法
１ ． １ 检 验测 试 片
食
品 与 发 酵 科 技
Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
第 ５ Ｏ卷 （ 第 ４期 ） Ｖ ｏ １ ． ５ ０ ， Ｎｏ ． ４
３ Ｍ Ｐ ｅ ｔ ｒ ｉ ｉ ｆ ｌ ｍ Ｔ Ｍ 金黄色葡萄球菌检验测试 片的评价
５ ８
食 品 与 发 酵 科 技
２ ０ １ ４ 年第４期
Ａ Ｔ Ｃ Ｃ １ ５ ４ ４ ２铜 绿 假单 胞 菌 （ 阴性 对 照菌 株 ） ， 将 活化 后 的各 菌 株接 种 于 营养 肉汤 中 ， ３ ７ ℃混 合 培 养 １ ８ —
２ ４ ｈ。
通常 不是正 态分 布 的 ，将计 数结 果转 化成对 数形 式
中图 分 类 号 ： Ｔ Ｓ ２ ０ ７ ． ３
文 献标 识 码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ６ ７ ４ — ５ ０ ６ Ｘ（ ２ ０ １ ４ ） ０ ４ — ０ ０ ５ ６ — ０ ０ ０ ５
第三节 金黄色葡萄球菌检验
血平板
BP平板
36± 1℃ 24hr
镜检 营养肉汤
36± 1℃ 24hr
血浆凝固酶 实验
36± 1℃ 6hr
报告结果
定量 检测
（MPN法）
25g样品+ 225ml 生理盐水
梯度稀释
选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤
36± 1℃ 48hr
将有生长的管划线接种
选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片
36±1℃ 判读 24±2h
只有典型紫红色菌落 没有菌落
除典型紫红色菌落外其他 颜色的菌落 加入确认反应片， 36±1℃，培养1~3h 有粉红色菌晕的菌落计数 为金黄色葡萄球菌
将所有紫红色菌落计数 为金黄色葡萄球菌 报告
• 金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显 色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄 色葡萄球菌的生长有很强的选择。金黄色葡萄 球菌在测试片上生成为暗紫红色的菌落，可以 直接完成鉴定和计数。
• 兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好； • 可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。 • 一般用含10%氯化钠的大豆肉汤增菌或 7.5%氯化钠肉汤增菌。
生物学特性—生化特征
• 所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的 菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。 • 产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶 菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白， 例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和 多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂 蛋白质，并释放脂肪酸；
分布
• 在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动 物的排泄物中都可找到。
• 作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和 动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的 皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受 其污染的机会很多。
金黄色葡萄球菌的检测与控制
3M PetrifilmTM 测试片
生化特性
金黄色葡萄 中间型葡萄球菌 球菌 猪葡萄球菌 其它
凝固酶 凝集因子 脱氧核糖核 酸酶 色素 丙酮 溶血作用 甘露糖发酵 产酸 (厌氧)
+
+
+/-
-
+
+ + + + +
+/+ +/-
+ -
+/+/+/+/-
使用方法——STX(定量方法)
3M PetrifilmTM 测试片
3M PetrifilmTM 测试片
肉制品
火腿，腊肠，热狗
色拉
火腿，鸡肉，土豆
高淀粉含量的糕点等 乳制品
奶酪
检测起因
加工食品中的污染：杜绝金黄色葡萄球菌 污染因素：
皮肤，嘴，鼻
手或手臂伤口 咳嗽，打喷嚏 表面污染食品的沉淀 卫生或温度控制不力
3M PetrifilmTM 测试片
葡萄球菌简述
3M PetrifilmTM 测试片
毒素
葡萄球菌肠毒素
食品引发疾病的最主要原因 之一; 能在没有微生物的情况下存 在; 当金黄色葡萄球菌污染了牛 奶和乳制品、肉等，在温度 条件适宜时，经过8～10小时 即可产生相当数量的肠毒素
检测起因
食品中的葡萄球菌中毒
肉
牛肉，猪肉，家畜
＊ 如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干 燥，直到平板表面的水珠消失。
涂布后，将平板静置 10 min，或将平板放在培养箱 36 ℃±1℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培 养箱，36 ℃±1 ℃培养，45 h～48 h。
金黄色葡萄球菌
处数
修改人/日期
批准人/日期
肉食品加工有限公司化验室
作业指导书
文件编号
LC/CEC-07
版本/修订
A/0
页码
共4第1页
标题：金黄色葡萄球菌3MPetrifilmTM测试片法
1.范围：
执行GB/T4789.37-2008标准
本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的计数方法。
本标准适用于各类食品中金黄色葡萄球菌的计数。其中第一法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品；第三法适用于肉及其制品、奶制品。
LC/CEC-07
版本/修订
A/0
页码
共4第2页
标题：金黄色葡萄球菌3MPetrifilmTM测试片法
3.9.3MPetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片、金黄色葡萄球菌确认片和压板.
3.10.250ml聚苯乙烯稀释瓶
3.11无菌剪子、镊子
4.检验程序：金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片法
3.设备材料和试剂
3..1恒温培养箱.36℃±1℃.
3.2冰箱2℃—5℃
3.3恒温水浴箱。
3.4天平:感量0.1g
3.5振荡器。
3.6无菌吸管：0.1ml(具0.01ml刻度)
3.7精密PH试纸.
3.8.50ml无菌试管
修
改
记
录
修改标记
处数
修改人/日期
批准人/日期
肉食品加工有限公司化验室
作业指导书
文件编号
5.7金黄色葡萄球菌测试片计数的报告：培养时间一到应立即计数，可目测或使用放大镜辅助计数。选择菌落在15～150之间的稀释度，两张测试片菌落数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样片中金黄色葡萄球菌，以CFU/g（CFU/ml）表示。
金黄色葡萄球菌检验原理
金黄色葡萄球菌检验原理
金黄色葡萄球菌检验的原理是通过培养和鉴定来确定细菌是否为金黄色葡萄球菌。
具体步骤如下：
1. 培养：将样本在含有富含营养物质的培养基上进行培养。
金黄色葡萄球菌在常见的琼脂培养基上能够快速生长并形成典型的黄色菌落。
2. 鉴定：通过一系列的生化反应和特征性实验来确认细菌的身份。
金黄色葡萄球菌一般具有以下特征：
- 革兰氏染色：呈阳性，即菌体呈紫色。
- 非运动性：无鞭毛或鞭毛不活跃。
- 产生黄色色素：金黄色葡萄球菌能够产生一种特殊的黄色色素，使得菌落呈现金黄色。
3. 确认：通过进一步的检测，如凝胶酶试验和DNA鉴定等，来进一步确认菌株是否为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可以引起多种感染，如皮肤感染、呼吸道感染和食物中毒等。
通过对其进行准确快速的检验可以帮助医生进行针对性治疗和控制传播。
快速检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素型的研究进展
株能够产两种或两种以上的肠毒素。金葡菌毒素是一种 外毒素 ， 具有耐热性 ， 是结构相似的一组可溶性蛋 白质， 由多个无分枝的多肽链组成。除了 Ａ Ｂ ｃ ｃ型又按等 、、（ 电点不同分为 ｃ 、：ｃ ） Ｅ共 ５ 已被鉴定的血清型 ，ｃ 、，Ｄ、 种
染菌 ， 以其存在范 围广、 致病性强而广受人们关注。 目
前， 我国仍使用传统方法对乳中的金葡菌进行检测， 因检
测周期长而加大了生产成本 ， 因此 ， 开发准确性高、 检测 周期短的检测方法显得尤为必要。以下着重介绍了一些 快速检测金葡菌及其毒素型方法的研究进展。
２ １ Ｐ ｔｆｍ Ｒ Ａ 检 测 法 ． ｅ ｉｌ Ｓ ｒ ｉ Ｐｔｆｍ Ｒ Ａ Ｃ ｕｔ ｅ ｉ Ｓ ｏｎ ｎｌ
”ｌ 该检 ｌ 驯
进行了检测 ， 该方法的标准曲线的相关性都达到了 ０９ ．８ 以上， 研究结果表明实时定量 Ｐ Ｒ的检测限为 ８ ｕ ｍ ， Ｃ ３ｅ ／ Ｌ ｆ 实时 Ｐ Ｒ引物和探针的设计是保证特异性的重要环节。 Ｃ 张红河等 选择 Ｆ ｍ 、Ｅ ｅ Ｂ Ｓ Ａ和 Ｓ Ｄ基 因分别作 Ｅ
外， 还有 Ｆ Ｈ、、、 、 Ｎ及 Ｓ 、 ＩＪＬ Ｍ、 Ｔ一１ ８种新型肠毒 共
素 ” ， 中 Ａ型肠毒素毒力最强 ， 其 人体摄入 １ ／ ｇ ｇ ｋ
即能引起 中毒 ， 以 Ａ型肠毒素引起 的食物 中毒最 常 所
见， 相比之下 ， Ｄ型毒力较弱 ， 人体摄人 ２ ｇｋ 才引起 ５ ／ｇ 中毒 …。除了常见的呕吐、 腹泻腹痛等 急性 中毒症状
ａｔｎ（ Ｃ ， ｄＰ ＲＷ ｏｔ ｓｄｆ ｓｙｎ ｅｅｔ ｏｏｉ ｆ ｔ ｈｌ ｏｃ ｌ ｕ． ｃ ｏ Ｐ Ｒ） ａ Ｃ ａ ｍ ｓｙｕｅ ｒ ａｉｇｔ ｎｅ ｔ ｎｏ ａ ｙ ｃ ｕ ａ２ｓ ｉ ｎ ｓ ｌ ｏ ａ ｓ ｈ ｒ ｘ Ｓｐ ｏ ｓ １ ｃ ＂ ｅ
金黄色葡萄球菌实验标准操作程序
金黄色葡萄球菌实验标准操作程序岗位名称检验员执行人员检验员技能要求掌握实验技能监控人员检验员监控频率实验过程检验方法对照试验作业条件在无菌室内操作作业步骤1、超净工作台与无菌室紫外灯照射半小时，通风半小时后进入无菌室操作；2、样品用75%酒精喷洒后放入传递窗，在无菌室操作台按顺序摆放后再用75%酒精均匀喷洒；3、操作前手用75%酒精消毒，剪样前用酒精棉球擦拭样品表面；4、固体和半固体样品：称取25g样品，放入225ml生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1:10的样品匀液。
5、液体样品：用微量移液器吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶中（瓶内置适量的无菌玻璃珠），充分混匀，制成1:10的样品匀液。
6、用1mL微量移液器吸取1:10的样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入含有9ml 灭菌生理盐水试管内（吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振荡试管混匀或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使混匀，做成1:100的稀释液。
7、按上述操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌枪头。
8、第一方法根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2-3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4m接种量分别加入3块Baird-Parker琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
9、在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 ℃±1℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 ℃±1 ℃培养，45 h～48 h。
10、典型菌落计数和确认10.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。
食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法比较研究
食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法比较研究作者：曹建平韩丹王健来源：《安徽农业科学》2015年第08期摘要：[目的] 探求一种适应食品微生物实验室检验要求的快速准确的方法。
[方法]比较研究Baird-Parker平板法、MPN法、科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基法和PetrifilmTM测试片法这4种定量方法对金黄色葡萄球菌的选择性、灵敏度和在食品中的应用。
[结果]试验显示，4种方法检测金黄色葡萄球菌选择性良好；MPN法、显色培养基法和纸片法灵敏度比Baird-Parker平板法稍高；4种方法应用在食品检测中，金黄色葡萄球菌检出率无显著差异。
因此可选择显色培养基和PetrifilmTM测试纸片法作为日常检验的辅助手段，以提高检测灵敏度、缩短检验周期。
[结论] 研究可为食品检测方法的研究及应用积累一定的经验，为今后金黄色葡萄球菌的检测工作提供一定参考。
关键词：金黄色葡萄球菌；定量检测方法；比较研究中图分类号：S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-242-02金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于葡萄球菌属，是一种重要的病原菌，是典型的革兰氏阳性菌，有较强的抵抗力。
金黄色葡萄球菌营养要求不高，且有高度的耐盐性，容易污染肉类、水产品、乳品等食品，在世界各个国家中，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占较大比例[1-2]，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已成为世界性的公共卫生问题。
目前关于食品中金黄色葡萄球菌的定量检测方法主要有Baird-Parker平板计数法[3]、MPN 计数法[3]、测试纸片法[4]、显色培养基计数法等。
其中Baird-Parker平板计数法和MPN计数法为国标法的第二法和第三法，但两者都存在耗时、工作量大的缺陷，很难适应现在快速检验要求；测试纸片法、显色培养基计数法检测周期短、工作量小，已经得到了很多机构的认可。
金黄色葡萄球菌检验与计数,GB4789.10-2016及纸片法-JW
金黄色葡萄球菌的肠毒素
金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一 种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因 为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大 量肠毒素而导致的。
近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株 在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能 产生两种或两种以上的肠毒素。
肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的 肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水， 难溶于有机溶剂。
分离培养基
Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚 碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能 促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色 和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也 能促进金黄色葡萄球菌的生长。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑 凸起、湿润，直径约2~3mm，颜色呈灰色到 黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在 其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似 有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和 透明圈的非典型菌落。
血浆凝固酶试验
挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落 1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂 小斜面，36℃±1℃培养18 h～24 h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再 加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL～0.3mL，振 荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半 小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将 试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积 大于原体积的一半，判定为阳性结果。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色， 有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、 表面光滑，周围有透明的β溶血环。
血平皿上的形态
血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素， 因此在血平板上产生明显的溶血环。
典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而 突起，圆形，不透明，表面光滑，菌落周围 有完全透明溶血环。
金黄色葡萄球菌检验与计数1
• 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌 菌株的肉汤培养物作为对照。 • 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5mL BHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复实 验。
结果报告
• 如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄 色葡萄球菌 。 • 报告在25g（mL）样品中检出或未检出 金黄色葡萄球菌。
培养特性： • 易培养，对营养要求不高，在普通培养基 中生长良好。 • 需氧或兼性厌氧。 • 最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。耐 盐性强，在含10～15%的氯化钠培养基中仍 能生长，可用于筛选菌种。 • 在普通营养琼脂平板上培养18～24ｈ，可 形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可 产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于 水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养 中。
petrifilmtm测试片法检验程序25gml225ml稀释匀质10倍系列稀释选择适宜稀释度的样品匀液各取1ml分别加入纸片362h判读没有菌落只有典型紫红色菌落将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌除典型紫红色菌落外其他颜色的菌落加入确认反应片36培养13h有粉红色菌晕的菌落计数为金黄色葡萄球菌报告金黄色葡萄球菌petrifilmtm测试片含具有显色功能经改良的bairdparker培养基对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择
Baird-Parker平板，血平板
36±1℃ 血平板18~24h， Baird-Parker平板18~24h 或45~48h。 观察溶血 BHI肉汤和营养琼脂小斜面 血浆凝固酶试验
涂片染色
报告
Baird-Parker琼脂平板
•金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约 2~3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外 层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无 混浊带和透明圈的非典型菌落。
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。