中国明对虾大颚器的组织学及孕酮和雌二醇的检测

收稿日期:2005204218;修订日期:2006208222资助项目:国家攀登计划B 类项目(编号:PDB62221);上海市教委重点学科建设项目(Y 1101)资助作者简介:蔡生力(1957—),男,浙江临安人;教授;主要从事海洋生物繁殖与发育生物学通讯作者:蔡生力,T el :021*********,E 2mail :slcai @sh 研究简报中国明对虾大颚器的组织学及孕酮和雌二醇的检测蔡生力1　赵维信1　杨丛海2(1.上海水产大学生命科学与技术学院,农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海　200090;2.中国水产科学院黄海水产研究所,青岛　266071)DETECTION OF PR OGESTER ONE AN D ESTRADIOL ,AN D OBSERVATION OFHISTOLOG Y IN THE MAN DIBU LAR ORG AN OF SHRIMPF ENN EROPENAEUS CHIN ENSISC AI Sheng 2Li 1,ZH AO W ei 2X in 1and Y ANG C ong 2Hai 2(1.The K ey Laboratory o f Aquatic G enetic Resources and Aquacultural Ecology (AGRA )Certificated by the Ministry o f Agriculture ,Shanghai Fisheries University ,Shanghai 200090;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute ,Chinese Academy o f Fisheries Sciences ,Qingdao 266071)关键词:中国明对虾;大颚器;组织学;孕酮;雌二醇K ey w ords :Fenneorpenaeus chinensis ;Mandibular organ ;Histology ;Progesterone ;Estradiol中图分类号:Q173 文献标识码:A 文章编号:100023207(2007)022******* LeR oux 于1968年首次描述了甲壳动物十足类的大颚器,并认为它与Y 2器官是两个不同的腺体,Byard 等[1]在研究了美洲龙螯虾(Homarus americnus )大颚器的超微结构后指出,甲壳动物大颚器是类似于昆虫咽侧体的内分泌器官。

Hin 2sch [2—5]研究了蜘蛛蟹(Libinia emarginata )大颚器的结构和功能,指出该器官与甲壳动物的蜕皮和生殖均有密切联系。

Lau fer [6]利用气、质联用仪发现甲壳动物大颚器分泌甲基法尼脂(Methyl fanes oate MF ),并认为该激素与甲壳动物繁殖有关。

此后,国内外学者在该领域的研究兴趣日增,对各种甲壳动物大颚器的组织结构、超微结构及其生理功能尤其是其分泌MF 的功能作了大量的研究[7—11]。

国内赵维信[12,13]、李胜[14]研究了克氏原螯虾(Procambarus clarkii )大颚器的超微结构及其在卵巢发育阶段的组织结构变化,并检测了不同发育阶段卵巢和大颚器的孕酮含量及其变化。

其后,赵维信和陆剑峰[15]又报道了中华绒螯蟹(Ericheir sinensis )的大颚器的激素生物合成与性早熟的关系。

早在20世纪80年代初,Y udin [16]就发现蓝蟹(Callinectessapidus )大颚器的超微结构具有两种不同类型的光面内质网,一种为网结状(anastom osing reticulum )光面内质网(SER ),另一种为管状光面内质网(tubular endoplasmic reticulum ,TER )。

因此他推测,蓝蟹的大颚器可能合成1种以上不同类型的激素。

C ouch [17]在美洲龙螯虾的大颚器中检测到了孕酮和雌二醇的存在,而且孕酮的含量在卵巢发育前后阶段均较稳定。

笔者在本试验进行的同期,对中国明对虾(Fenneropenaeus chi 2nensis )的肝胰腺、卵巢和血淋巴细胞进行了孕酮和雌二醇的检测,发现在卵黄发生前期和初级卵黄发生期,三种组织中的孕酮和雌二醇均能检测到,而在卵巢未发育期和次级卵黄发生期,这两种激素在各组织中的水平都较低或检测不到[18]。

上述研究已涉及到甲壳动物大颚器与激素的合成以及类固醇激素与卵黄生成之间的关系。

第31卷第2期水生生物学报V ol 131,N o 122007年3月ACT A HY DROBIO LOGIC A SINIC AMar 1,2007中国明对虾是我国重要的海水养殖种类,有关它的养殖、病害防治等研究近几年开展得较多,但有关它的内分泌学方面的知识至今我们所知仍很少。

本研究目的是确定中国明对虾大颚器的位置,观察该器官细胞组织的显微结构和超微结构,并用放射免疫方法检测该器官在不同卵巢发育阶段孕酮和雌二醇的存在情况,进而探讨它的生理功能。

1　材料与方法1.1　样品采集和固定　样品采集分两次,第一次于1998年9月从青岛流亭镇对虾养殖场采集卵巢未发育个体,体长范围10—11cm。

第二次于1999年3月,从青岛沙子口市场采购,体长范围15—20cm(海区捕捞亲虾)。

根据卵巢发育情况[18],将亲虾分为卵黄发生前期、初级卵黄发生期、次级卵黄发生期。

将卵巢未发育期和初级卵黄发生期的两种对虾大颚器(各2尾)在解剖镜下取出,一部分固定于Davision溶液,按Bell[19]方法进行染色、切片和组织学观察。

另一部分用3%的戊二醛溶液固定用于电镜制片观察。

另将4种不同卵黄发生期的对虾(各5尾)大颚器取下研磨、抽提等处理后作孕酮和雌二醇检测。

1.2　孕酮和雌二醇检测　在解剖镜下,将四个不同卵黄发育阶段的对虾大颚器取下(每个阶段所测样品虾5尾,10个大颚器作为1份样品,检测时设两个平行),用组织研磨器研碎,加1m L乙酸乙酯混匀后置于1.5m L塑料离心管中。

将上述样品置于4℃冰箱过夜,3000r/min离心10min后,吸取上清液后再加乙酸乙酯重复离心一次,合并两次离心上清液,置于56℃水浴中蒸干,然后加1m L0.1%明胶磷酸缓冲液(G P BS),涡旋混匀,放置-20℃低温冰箱备用。

孕酮和雌二醇放射免疫测定试剂盒购于卫生部上海生物制品研究所,测试方法基本参照试剂盒说明书操作[13,18]。

1.3　数据统计分析　利用方差分析(ANOVA)检验不同卵黄发生阶段大颚器孕酮和雌二醇含量的差异显著性,p<0.05为显著性水平,并用Q检验比较各组之间的差异显著性。

2　结　果2.1　大颚器位置中国明对虾大颚器位于大颚器的背面,大颚几丁质肌腱的基部,左右各一(图1)。

由于该器官周围包被着大颚肌,肉眼不易观察到。

2.2　组织学观察大颚器外围组织为大颚肌(MS),器官整体似长椭圆形(图版Ⅰ21),中段肌腱(TE)另侧略内凹(图版Ⅰ22)。

腺体周围有一层结缔组织形成的膜包被,一边紧接肌腱组织,另一边结缔组织膜(C M)较明显,有丰富的血淋巴细胞分布其中,外缘是一层上皮细胞(EP)(图版Ⅰ22,);大量的腺体细胞呈不规则的卵圆形,数个细胞排列成束,形成小叶状,轮廓明显,血淋巴细胞(HC)通常分布于小叶边缘。

卵黄发生阶段的腺体细胞明显肥大,胞内可见大小不等的空泡(图版Ⅰ23)。

图1　大颚及大颚器位置Fig.1　Sketch of the location of the mandibular organ而卵巢未发育的腺体细胞排列紧密,空泡很少(图版Ⅰ25)。

大颚器的细胞核较大,形状多样,嗜碱性强,着色深,卵巢未发育的腺体细胞表现尤为突出。

另外还可观察到典型的甲壳动物大颚器腺细胞—多核仁细胞(PNC)(图版Ⅰ23,Ⅰ24)。

邻近腺体组织,有一由成团的神经纤维细胞(neural tract cell NT C)组成的神经纤维末端,核大且染色很深(图版Ⅰ24)。

从神经细胞紧邻大颚腺体分布这一组织结构推测大颚器可能受神经激素的调节。

2.3　超微结构观察典型的大颚器细胞近椭圆形,细胞核(N)形状多态,核仁沿核膜内缘分布(图版Ⅱ21)。

细胞质中具丰富的光面内质网(SER)、线粒体(M)、高尔基体(G)等细胞器(图版Ⅱ2126)。

同一细胞内可观察到很典型的两种类型的光面内质网,一种形态为网结状的光面内质网(SER),另一种为管脊状光面内质网(TER)(图版Ⅱ2122)。

管脊状内质网又特化成三种形态:平行排列的堆积状管脊内质网(sTER)(图版Ⅱ2Ⅰ),有的特化为同心圆形的涡状管脊内质网(wTER),形态类似线粒体(图版Ⅱ26),还有一些散落分布在细胞不同部位的碎片状管脊内质网(bTER)(图版Ⅱ27)。

腺体细胞内线粒体特别丰富,并且经常成团分布,线粒体内多为管状脊,方向不定(图版Ⅱ23,Ⅱ25)。

在高尔基体周围可见染色很深的类脂肪体颗粒(图版Ⅰ)(图版Ⅱ24)。

腺体细胞邻近血淋巴细胞处,质膜明显内陷,以增加腺细胞与血淋巴细胞之间的接触面(图版Ⅱ2 7)。

血淋巴细胞形态各异,有的核特别大,染色很深,异染色质(HC M)几乎占据了整个核(图版Ⅲ21)。

多数血淋巴细胞形状狭长,核占据了细胞的主要空间,在明显可见的血淋巴细胞管中,细胞狭长,而在血窦处细胞变短,显示血淋巴细胞在运行中形态多变的可能性(图版Ⅲ25,Ⅲ26)。

腺体细胞质内邻近高尔基体和内质网处,可观察到许多电子密度低的大小不一的空泡,并有由小变大的发展趋势。

这一类细胞的光面内质网等细胞器明显少,显然这些结构与细胞产物的积聚和分泌相关(图版Ⅱ24,Ⅲ22)。

此外,大颚器的超微结构还可观察2期蔡生力等:中国明对虾大颚器的组织学及孕酮和雌二醇的检测291到其他一些特化的结构,如类粗面内质网(RER 2L )(图版Ⅲ23,Ⅲ24),形态上颇似网结状内质网或涡状内质网,但在较高放大倍数下,可见内质网上有众多类核糖体颗粒,其形态和功能尚待阐明。

2.4　孕酮和雌二醇含量不同卵巢发育阶段的中国明对虾大颚器的孕酮和雌二醇含量变化很明显。

在卵巢未发育阶段,两种激素都检测不到。

而进入卵黄发生前期,两种激素的含量都达到了高峰(106.5±15.2,22.5±11.2pg/个器官),在初级卵黄发生阶段,含量仍较高为(94.0±9.7,17.4±10.3pg/个器官),与前一阶段的差异不显著(p >0.05)。

而进入次级卵黄发生阶段,两种激素含量均显著下降,孕酮含量仅为23.1±9.1pg/个器官,与前两个阶段相比,差异极显著(p <0.01),而雌二醇则检测不到(图2)。