3双向电泳技术

第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
常规聚丙烯酰氨凝胶电泳原理
• 圆盘状、垂直、平板电泳； • 垂直、水平电泳：同一块胶板可以同时分离数个样品， 重复性好于圆等，显示已分离的各个组分； • 在连续缓冲系统中，分离取决于蛋白质的电荷密度； • 在不连续缓冲系统中，分离取决于蛋白质的大小、形 状。
• 稳定、连续、线性（非线性）pH梯度的建立； • 载体两性电解质：电场中通过两性缓冲离子建立 pH梯度； • 固相pH梯度：缓冲基团共价键合在截止上成为凝 胶介质的一部分，建立pH梯度，分辨率比前者高。
一、基本原理
1、等电点
• 蛋白质氨基酸侧链，在一定pH的溶液中可解离而带
电荷；
• 蛋白质所带净电荷：蛋白质所有氨基酸残基上所带 正负电荷总量； • 在低pH时，蛋白质带净电荷是正（+）； • 在高pH时，蛋白质带净电荷是负（-）；
第三章 双向电泳技术
蛋白质组研究的三大主要技术：
• 双向电泳技术——基本核心 • 质谱技术——关键 • 计算机图像分析与大规模数据处理技术（生物信 息技术）——保障
第一节 蛋白质电泳的基本原理
• 在电池作用下，带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的 粒子向正极移动。 • 电泳：带电粒子向着与其电性相反的电极移动现象。 • 蛋白质上一种两性电解质，在一定pH条件下，可解离成 带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电荷相反的电极 泳动。
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
常规聚丙烯酰氨凝胶电泳原理
• PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的区带电泳；
• 在恒定、非解离的缓冲液系统中分离蛋白质；
• 在电泳中，保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互
作用和生物活性；（优点）
• 根据分子量不同，迁移率不同，测定分子量。
需要反应液与空气隔绝，加激活剂钱，进行超声脱气。
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
常规聚丙烯酰氨凝胶电泳原理
优点： • 电渗作用小，不易和样品相互作用；
• 聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度网孔结构，
有比较好的机械性质；
• 在一定范围内，聚丙烯酰胺凝胶，对热稳定、无色透
明、易观察； • 丙烯酰胺比较纯，可以精致减少污染
• 分辨率高：不连续凝胶电泳的分辨率，高于醋酸纤维素膜、琼
脂糖电泳。
第二节 蛋白质等电聚焦电泳

原理
• 利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同， 在一个稳定、连续的、线性的（或非线性）pH梯 度中进行蛋白质的分离和分析。
分辨率高 重复性好 样品容量大 操作简便迅速
一、基本原理
等电聚焦的关键
第一向：等电聚焦
第 一 向 ： 等 电 聚 焦
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
第 二 向：
SDSPAGE
+
pH 3 pH 7.5 pH10
电 泳
charge
– size
二、载体两性电解质pH梯度 等电聚焦电泳
缺点：
重复性很难控制：合成的载体两性电解质，是通过复 杂的过程得到的； pH不稳定：载体分子量小，水合正离子而引起电渗流， 载体分子向负极移动；
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
SDS-PAGE 凝胶浓度选择
• 概念：
在支持介质中，放入载体两性电解质，在电场
中构成连续的pH梯度，是蛋白质或其他具有两性电
解质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定
的目的。
二、载体两性电解质pH梯度 等电聚焦电泳
应具备的条件：
• 在等电点处必须有足够的缓冲能力：蛋白质两性电解质，
影响pH，必须有足够的缓冲能力；
• 必须有足够高的电导：以便有一定的电流通过，切导电均匀，
和甲叉双丙烯酰胺有类似的聚合行为。 固定干胶条（IPG）： 由基质和聚丙烯酰胺形成一个整体，由酸性和碱 性集团与聚丙烯酰胺以梯度式共价键连接，产生 pH梯度。
三、固相pH梯度等电聚焦电泳 IPG-IEF
固相pH干胶条制作：
把固相pH梯度胶，灌到塑料支持膜上； 洗胶，出去凝胶上的催化剂和未聚合的单体，以免对
• 泳动速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量、颗粒
大小和性状。 • 蛋白质种类不同，其等电点不同，因此可通过电泳技术对
蛋白质进行分离、纯化。
第一节 蛋白质电泳的基本原理
影响电泳速度的因素：
• 电场强度
• 缓冲液pH
• 缓冲液离子强度
• 电渗
• 焦耳热
第一节 蛋白质电泳的基本原理
分类： 按支持物的物理性质
一、基本原理
2、聚焦效应
• 混合蛋白质样品，电场中连续pH，经过电泳，蛋白
质移动到等电点，停止移动。
• 等电聚焦：按等电点的大小，生物分子在pH梯度的 某一相应位置进行聚焦的行为。 • 等电聚焦中蛋白质区带的位置，与蛋白质分子的大 小、形状无关，由泳的pH梯度分布和蛋白质pI决定。
• 等电聚焦可以使蛋白质分离、纯化和浓缩。
• 分辨率高。
一、基本原理
3、等电聚焦的分辨率
• 提高电场强度；
• 使用窄pH范围；
• 电泳过高产生热，使蛋白质变性、甚至烧胶； • 电场强度受到一定限制； • 载体两性电解质等电聚焦的分辨率：0.01-0.02 pH 单位； • 窄的pH范围时，可达到0.0025-0.001 pH单位。
二、载体两性电解质pH梯度 等电聚焦电泳
• 还原SDS电泳 • 非还原SDS电泳 • 带有烷基化作业的还原SDS电泳
分类
• 连续电泳
• 不连续电泳
分类
• 圆盘电泳
• 平板电泳：水平、垂直
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
SDS-PAGE 影响因素
• 溶液中单体浓度：单体与蛋白质结合的重量比1:4或1:3， 保证二者充分结合，消除蛋白质分子的电荷差别； • 二硫键是否完全被还原：二硫键被破坏，蛋白质分子 解聚，SDS才能与蛋白质结合，二硫苏糖醇（DTT）浓 度2%-3%、β-巯基乙醇浓度4%-5%；
• 光聚合：催化：核黄素、需要痕量氧，一般制备大孔胶。
第一节 蛋白质电泳的基本原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 有效孔径 • 总浓度：聚丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺，小于2.5%， 胶几乎为液体，筛大分子；总浓度大于30%，既硬又脆， 筛小分子。
第一节 蛋白质电泳的基本原理
聚丙烯酰胺凝胶优点
• 机械强度高，弹性好，透明，无电渗作用，吸附作用极小； • 化学性质稳定，与待分离物质不起任何化学反应； • 样品不易扩散，用量少，其灵敏度可达10-6； • 凝胶孔径可调节：可根据被分离物的分子量选择合适的浓度；
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
常规聚丙烯酰氨凝胶电泳原理
影响凝胶聚合的因素：
• 试剂的纯度：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺纯度选择电泳级
别，过硫酸铵先用现配，否则潮解失去催化活性；
• 凝胶的浓度：根据需要选择浓度，浓度大易破碎、浓度低
凝胶稀软，不易操作；
• 温度和氧气：温度高聚合快，氧使聚合反应终止，聚合时
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
SDS-PAGE 影响因素
• 缓冲系统的选择：在样品蛋白稳定的pH范围，不与SDS 发生相互作用的缓冲液都可以使用；
SDS-Tris-磷酸缓冲液：分辨率好； 咪唑缓冲液：比磷酸缓冲系统导电性低速度快一倍； SDS-脲：低分子量蛋白质样品、高分辨率； SDS不连续缓冲系统：蛋白质亚基分子质量、纯度测定； Tris-硼酸盐缓冲系统：氨基酸组成或氨基酸序列测定； Tri-甘氨酸系统：使用最多。
三、固相pH梯度等电聚焦电泳 IPG-IEF
优点：
分辨率高； pH梯度稳定；
注意事项：
温度：控制在20-30℃，提高蛋白 质溶解性 电压：梯度上升；低压涨胶充分 吸收蛋白；电压逐步上升，至最 高，是蛋白质在电场充分运动， 达到其等电点的位置。
重复性好；
加样量大； 干扰小。
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
SDS-PAGE 原理
• 去污剂（SDS十二烷基苯磺酸钠） • 还原剂（DTT二硫苏糖醇）能使半胱氨酸残基之间的二 硫键断裂，保证蛋白质分子与SDS充分结合。
• 在蛋白质溶液中，加入足够多的SDS和还原剂，蛋白质
分子解聚成多肽链； • 解聚后，氨基酸侧链与SDS充分形成蛋白质-SDS复合物；
•滤纸及其他纤维膜电泳 •凝胶电泳 按支持物的装置 •粉末电泳 •平板式 •线丝电泳 •垂直式 按pH连续性 •圆盘式 •连续pH电泳 •非连续pH电泳
第一节 蛋白质电泳的基本原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 聚丙烯酰胺聚合：单体丙烯酰胺（Arc）、交联剂N,N’-甲 叉双丙烯酰胺（Bis），有自己有存在时聚合成为凝胶。 • 化学聚合：催化剂：过硫酸铵、加速剂：四甲基乙二胺 （TEMED），形成三维网状结构。
为了防止电泳过程中pH梯度的衰变，电流降低达最小而 恒定时，尽快结束等电聚焦； pH梯度测定：
Rotofer制备的电泳→分管测定收集液； 凝胶电泳→ 分段切割凝胶测定； 薄层电泳→微电极检测。
三、固相pH梯度等电聚焦电泳 IPG-IEF
利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生
保持pH梯度不变；
• 分子质量小：便于与被分离物质用透析或凝胶过滤法分开； • 化学组成应不同于被分离物：不干扰测定； • 应不与分离物质反应或使之变性。
二、载体两性电解质pH梯度 等电聚焦电泳
应具备的条件：
两性电解质的等电点，介于两个很近的pH之间时，它的 等电点解离度大，缓冲能力强，电导系数高。
第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电压
SDS-PAGE 原理