IEF-SDS PAGE双向电泳技术
双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用
双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用家蚕（Bombyxmori）是蚕类动物，是家养和蚕桑人类居住地区诸多蚕类中最重要的家畜，因其十分多样的蛋白质，被广泛用于分离及分析研究，如比较微生物的蛋白质组成和药物研究。
双向电泳法（SDS-PAGE）是一种用于分离家蚕蛋白质的广泛应用的方法。
它可以分离家蚕的多种蛋白质，以精确的分子量为结果，以其灵活的分离能力为科学家们提供研究机会。
原理双向电泳法（SDS-PAGE）是一种流动态电泳法（IEF），它可以分离不同大小的蛋白质。
它主要是利用电流来分离，譬如蛋白质悬浮液或者凝胶中的物质可以被电流所吸引，并被向前或向后推进，最终形成各个分离峰，从而实现按不同分子量进行电泳分离。
家蚕蛋白质的电泳分离可以通过添加一种叫做聚脂酰胺的表面活性剂。
聚脂酰胺可以在原有的和电流的作用下，使蛋白质在家蚕蛋白质电泳分离过程中变得更加稳定，从而提高分离的效率。
过程家蚕蛋白质的双向电泳分离一般以室温下进行。
蛋白质悬浮液或凝胶放入电泳室，连接电极，然后开启电源，开启正负电流，使每个组分移动不同的方向，这样便能有效地进行分离，最后得到家蚕蛋白质的分离曲线。
家蚕蛋白质电泳后，蛋白带的形态可以通过遗传自动染色法来确定，并利用紫外分光光度计来检测它们的浓度。
在染色过程中，可以将家蚕蛋白带的形态和分子量相匹配，从而确定它们的分子量。
优势双向电泳法（SDS-PAGE）利用它的灵活性，可以分离出家蚕蛋白质的多种组分，精确的分子量，并根据它们的浓度、形态及分子量进行精确分离。
它具有高灵敏度，分离过程快捷，可以进行大量分离，节省时间，实验简便，操作安全，分离的结果准确。
它的分离能力与其他传统的分离方法相比具有明显的优势，可以更好地满足实验室的日常需求。
缺点家蚕蛋白质电泳分离中，双向电泳法（SDS-PAGE）不是完美的。
它只能分离出家蚕蛋白质的一部分，并不能分离出所有种类的蛋白质，可能会遗漏一些重要的分子，还可能会出现分离的结果不准确的情况，因此使用双向电泳法进行分离时，需要进行大量的核酸和蛋白质分析，以更准确的分析出家蚕蛋白质的组成成分。
双向电泳技术流程
Analytical Load (silver staining)
10~100ug/125ul 50~200ug/185ul 100~300ug/300ul
Preparative Load (Coom staining)
200~500ug/125ul 250~1000ug/185ul
样品制备
• 样品的纯化
蛋白样品的纯化
样品进行纯化的试剂盒 ReadyPrep 2D Clean-up Kit:去除盐分及其他杂质 ReadyPrep Reduction-Alkylation Kit:显著提高碱性蛋白分辨率
ReadyPrep 2-D Kits
样品中DNA的去除
• DNA/RNA等可以同蛋白质形成超大分子量 的复合物，从而影响蛋白质的电泳分离。 • 一般在用40mM Tris溶液裂解细胞时，加入 DNA消化酶，即可有效去除DNA。 • 量：1ml溶解液中加入150~300U的内切核酸 酶，室温反应20min即可。
高不溶性蛋白的分离：主要还是要增加蛋白质 的溶解度，采用顺序抽提法进行。
亚蛋白质组样品的制备
主要是应用超速离心技术和顺序抽提法将总蛋白质 组分成不同的蛋白质组亚群，再用适当的蛋白溶解 液溶解，以降低样品的复杂性、提高分辨率。常用 方法为： 1、用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成 分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解，这不仅大 大减少样品的复杂性，而且展示出的蛋白质可确定 其亚细胞定位。该法需要专业仪器，有时会出现假 阳性。
ddH2O
Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use
IPG pH Range 3-10 4-7 3-6 5-8 7-10 Bio-Lyte Ampholyte (stock) range 3/10 4/6 5/7 3/5 4/6 5/8 7/9 8/10 Bio-Lyte Ampholyte (stock) Conc.(w/v) 40% 40% 40% 40% 40% 40% 40% 20% Sample Solution Volume Per 5ml 25ul 12.5ul 12.5ul 25ul 12.5ul 25ul 12.5ul 25ul Sample Solution Volume Per 50ml 250ul 125ul 125ul 250ul 125ul 250ul 125ul 250ul
蛋白质双向电泳简介
IPG 胶的水合及上样
2-DE 样品
水合溶液
IPG 胶条支架
水合溶液：
8M
尿素
2%
NP-40 或 CHAPS
2%
IPG缓冲液 (两亲性电解液)
0.28% DTT
微量 溴酚蓝
IPG 胶条 定位
水合目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：
待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度
IPG 胶条的平衡
平衡液 6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗
SDS-PAGE均一胶各成分用量
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
步骤
样品制备 胶条水合 等电聚焦 聚焦后胶条平衡 第二相SDS-PAGE 分离蛋白质的检测与匹配分析
通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂 的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可 用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基 质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂 尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以 打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型 或两性去污剂以破坏疏水交互作用。
在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白 质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解 性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质 变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基
因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰 双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂 类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导 致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制 备的药剂必须与等电聚焦兼容。
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
双向电泳的全套实验步骤及其注意事项
双向电泳的全套实验步骤及其注意事项本手册向您提供双向电泳实验过程中从样品制备、IEF电泳、胶条平衡、SDS-PAGE、凝胶染色脱色、胶内蛋白质点的切取、胶内胰酶消化以及质谱样品的制备等全部实验步骤，为您的实验提供全流程的帮助。
细胞样品的一般处理步骤1. 吸出培养液，用胰酶消化或细胞刮子收获细胞。
2. 加入PBS溶液，1500ｇ离心10分钟，弃上清。
重复3次。
3. 加入5倍体积裂解液，或按1×106细胞悬于60～100ｕｌ裂解液中混匀。
4. 液氮中反复冻融3次。
5. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。
6. 15,000转，4℃离心15分钟。
7. 收集上清，分装分装后冻存于－70℃。
组织样品的一般处理步骤1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。
2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。
3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。
4. 15,000转，4℃离心20分钟。
5. 收集上清，分装后冻存于－70℃。
双向电泳中溶液配制水化上样缓冲液（I）：尿素8M 4.805gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液（II）：尿素7M 4.2g硫脲2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液（III）：尿素5M 3.0g硫脲2M 1.52gCHAPS 2% 0.2gSB 3-10 2% 0.2gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
双向电泳实验操作流程
双向电泳实验操作流程机器型号：GE第一向：等电聚焦（IEF）1．对样品的要求：IEF能否成功主要取决于样品状态和离子强度，一般蛋白制备采用Trin-HCl 为缓冲液，加等渗蔗糖。
根据染色方法和胶条的长度决定上样量，一般是20μg/mL -1mg/mL。
考马斯亮蓝染色较银染需要较大的上样量。
2．IEF准备注意事项：DTT和IPG现用现配，由于DTT是还原剂，长时间放置易氧化，所以可以选择干物质使用。
DTT的作用是和尿素配合打散蛋白质结构，CHAPS为碱性去垢剂，和SDS作用相似，溶解尿素时温度不可超过37℃，因为超过37℃蛋白质会发生氨甲酰化，尽量在生产日期一年内使用。
清洗IEF胶条槽时用专用清洗剂，原液清洗或2%浓度浸泡清洗。
3．上样：胶条使用前20min从冰箱（4℃）中取出。
上样可以采用水化上样或者使用上样杯（先水化，后上样），上样杯上样适用于极性等电点蛋白质，水化12h后，在电泳槽上样。
以水化上样为例：先将250μL样品和水化液（需要当天配制）混合物加到胶条槽里，然后从尖端（阳性端）撕掉保护膜（带IO号），将胶条支持膜向上，胶面向下，用配用镊子夹住平端放入胶条槽中，注意不要产生气泡，用覆盖油覆盖，盖上盖子。
说明：放入胶条槽中的胶条上的字应该顺向能够读出，说明胶条放的对，如果读不出来，说明放反了。
在电脑软件中设置操作参数：水化上样分为被动上样（就是这种浸泡状态维持约16h）和主动上样（加电压30V，大约需要10h）。
上样后即可进行IEF电泳。
注意每种胶条最大的电流不能超过50μA。
一般是30V电压水化12h，然后200V、500V、1000V各1h，最后用8000V电压电泳至结束。
4.胶条的平衡：平衡液制备时先将SDS在加热的条件下溶解于水中，SDS溶解后冷却至20℃左右，在加入尿素充分溶解，然后加甘油混匀成水溶液。
将该水溶液分成两份，每份15mL，分装到两个平衡管中，其中一个管中加DTT，另一个管中加IAA，DTT可以打开蛋白的二硫键，防止在聚焦时形成的氧化导致在第二向拖尾，尿素、甘油可以降低电离效应，使胶条可以很好的转入第二向，IAA可以将去除DTT。
双向电泳技术研究进展
双向电泳技术研究进展摘要：双向电泳(two dimensional electrophoresis , 2-DE)技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段，是蛋白质组学研究的三大核心技术之一。
本文主要从双向电泳技术的发展，主要操作步骤及其面临的主要挑战等方面对改技术的研究进展进行综述。
关键词：双向电泳；研究1.双向电泳技术的发展蛋白质双向电泳源于1975年O,Farrell. Klose.Scheele 对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究。
它首先根据样品中蛋白质等电点不同进行等电聚焦(IEF)作为第l向，然后再按照蛋白质分子量大小不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)作为第2向，经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点，从而得到样品的蛋白质表达图谱。
根据双向电泳中第l向等电聚焦方法的不同，双向电泳主要分为2个主要类型，ISO-DALT(等电点一道尔顿)IPG．DALT ( 固相pH梯度一道尔顿)双向电泳。
1.1 ISO-DALT双向电泳技术传统的ISO-DALT双向电泳中，首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的DH值梯度，两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。
通常采用圆柱状电泳，IEF凝胶制备在圆柱型玻璃管中，可以将样品加在未凝固的凝胶溶液中，也可在凝胶凝固后在玻璃管顶端加样，然后进行等电聚焦，通常在50～100V电压下聚焦1～2 h，让样品进入IEF胶条，然后在200 ～400V或更高电压下进行聚焦，直到电流接近零时为止。
等电聚焦结束后取下凝胶柱，向玻璃管中凝胶与管壁间注水，将凝胶条吹出，用缓冲液平衡凝胶条，主要目的是充分打断多肽链间及多肽链内部的二硫键并使其与SDS充分结合，然后将胶条用琼脂包埋于第2向电泳的凝胶板中，进行第2向SDS-PAGE，SDS-PAGE 可以使用均一的分离胶浓度，也可采用不连续梯度胶或者连续梯度胶。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
质谱鉴定双向电泳蛋白
百泰派克生物科技质谱鉴定双向电泳蛋白双向电泳即双向凝胶电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，以实现更精确的鉴定。
百泰派克生物科技提供双向电泳获得的兴趣蛋白的质谱鉴定服务。
双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis），也称作双向凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis）或二维凝胶电泳，缩写为2-DE或2-D电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
双向电泳是等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和SDS-PAGE的结合。
蛋白质混合物在二维凝胶上，首先根据pH值对蛋白质进行等电聚集电泳分离，之后根据蛋白质分子大小进行SDS-PAGE分离。
双向电泳完成后，将凝胶进行染色即可得到一个蛋白质二维分布图。
常用的染色技术有考马斯亮蓝染色、银染、负染和荧光染色。
双向电泳中，通过在电泳时在一条泳道上添加已知相对分子质量的一系列标准蛋白质，可以对样品中的蛋白质的相对分子质量进行估算。
质谱鉴定双向电泳蛋白通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，从而实现目标蛋白的精确鉴定。
对于Coomassie Blue，SYPRO Ruby以及Silver stain染色的样品，均可通过质谱进行蛋白的鉴定。
但是，银染的样品有可能会与质谱分析不兼容，推荐使用以下产品或者实验步骤进行银染实验：ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)；Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)。
此外，用于质谱鉴定的银染样品不要进行脱色处理。
双向凝胶电泳技术
双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其 分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双 向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。 由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品， 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物 学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
细胞处理： 细胞处理： 对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组 分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。 组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融 等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，仅需经过 稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。
等电聚焦 等电聚焦是20世纪60年代建立的蛋白质分离技术， 基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同，在 一个稳定的、连续的pH梯度中进行分离和分析。IEF具有 分辨率高（0.01pH单位）、抵消扩散作用、可使浓度较低 的样品达到高度浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分 子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯 度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度 （Carrier ampholytes pHgradients）和固体pH梯度 （Immobilized pHgradients）。前者是在电场中通过两 性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质 的一部分，分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式 的不同，IEF可分为管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。 聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长在第二向SDS-PAGE分离前，必须要平衡IEF胶。主要 目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介 质，使分离蛋白质与SDS能完全结合，保持蛋白质的巯基 呈还原状态，避免发生重氧化，确保在SDS-PAGE过程中正 常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处，净 电荷为零，若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDSPAGE分离，蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中 正常迁移。胶条平衡包括两个简单的步骤，每步10-15分 钟，第一步是将IEF胶在375mmol/L Tris-HCl Ph8.8缓冲 液（含2%SDS、1%DTT或6mol/L尿素和30%甘油）中浸泡1015分钟，尿素和甘油是用于缓冲电渗效应，提高蛋白质从 第一向到第二向的转移率。第二步用5%碘乙酰胺替代还原 剂DTT的375mmol/L Tris-HCl pH8.8缓冲液，其他组分及 相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱 氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫键。此外，碘乙酰 胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT，否则自由DTT在第二 向SDS-PAGE胶迁移，会产生点条纹的假象。为减少酰胺基 组的烷基化，最好在pH8-9之间进行还原和烷基化。
蛋白质双向电泳
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。
这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。
这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。
一、血清样本的制备血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。
而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。
②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。
③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。
④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。
⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。
⑥以大约6500×g离心5分钟。
⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。
⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。
二、组织和细胞样本的制备裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。
1. 破碎细胞的方法细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。
因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。
蛋白质电泳常用的几个实验
蛋白质电泳常用的几个实验
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE是研究蛋白质分子量和纯度的常用方法。
在电泳前,蛋白质样品需要加入SDS(十二烷基硫酸钠)和还原剂,使蛋白质变性并带上负电荷。
在电场作用下,蛋白质按照分子量的大小进行分离。
2. 等电聚焦电泳(IEF)
IEF是根据蛋白质的等电点(pI)进行分离。
样品先在一维pH梯度凝胶条中进行电泳,然后再在二维SDS-PAGE凝胶中按分子量进行分离。
这种二维电泳可以同时分析蛋白质的pI和分子量。
3. 免疫印迹(Western Blot)
免疫印迹是在电泳基础上进行的蛋白质检测方法。
将电泳分离后的蛋白质转移到一层膜上,然后用特异性抗体与目标蛋白质结合,最后通过显色反应检测目标蛋白质的存在和相对丰度。
4. 毛细管电泳(CE)
CE是一种高分辨率的微量分离技术,可以分析各种生物大分子,包括蛋白质。
由于使用毛细管作为分离介质,所以只需要很少量样品。
CE 操作简单,分离效率高。
5. 凝胶电泳移动度偏移分析(GEMSA)
GEMSA是研究蛋白质与核酸相互作用的方法。
先将蛋白质与核酸混合,然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
由于结合了核酸后,蛋白质的电荷和构象发生改变,导致电泳迁移率发生偏移。
以上是一些常用的蛋白质电泳实验,它们在生物化学和分子生物学研究中发挥着重要作用。
双向电泳
优点
1.上样简单 2.解决了样品杯上样时常出现的样品 沉淀问题 3.在等电聚焦前蛋白质样品已经完全 进入胶条，可缩短聚焦时间 4.提高蛋白上样量
主动或被动上样：3种方式 方式一
方式二
方式三
搭盐桥
先让胶条吸胀1h，再覆盖2-3ml矿物油， 然后水化至少11h 。
等电聚焦程序的设置
操作步骤
上样 水化 设置等电聚焦程序，开始水化 和聚焦
上样方法：主动上样、被动上样、 样品杯上样
样品杯上样: 难以操作，人为影响大， 尽量不选择
主动上样、被动上样：样品在溶胀过程 中，被均匀吸收到整个胶条
1.含有高浓度的DNA、RNA、或其它大分子、如纤 维素 2.含白蛋白的血清样品 3.用碱性范围IPG胶条时，例如PH7-10 4.含有高浓度的糖蛋白
三、胶条平衡
作用： 蛋白质二硫键的还原及半胱氨酸残 基的烷基化 样品与SDS结合 时间： 2×（10-15）分钟 （第一步：DTT 第二步：碘乙酰胺）
IPG胶条的转移及琼脂糖封胶液的包埋 两种方法
四、第二向分离：SDS- PAGE
仪器
Mini-PROTEAN 3 System 适用于7cm IPG胶条, 1-2块胶
提供高通量的电泳平台 半导体冷却平台精确控温，10 -25℃ 提供高电压（内置10,000V高压电源）
ReadyStrip IPG Strips
5 种长度(7cm,11cm,17cm,18cm,24cm) 短 胶条电泳时间短，适用于方法优化；长胶条电 泳时间长，能予以最好的蛋白分辨率和更高的 上样量。
THE END
IEF-SDS PAGE双向电泳技术
双向电泳一、材料样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH二、试剂SDS-PAGE所需试剂1、30％Acry-Bis (w/v)29.2％Acry 29.2g0.8％Bis 0.8g加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配2、10％的SDS贮液(w/v)RT保存，因SDS在4℃会析出3、Tris-HCl buffer①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer100ml含Tris 18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：50ml 含Tris 6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存4、TEMED以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存5、10％AP1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存终浓度Tris碱3g 250mMGly（25.05）14.4g 250mMSDS 1g 0.1% (192mM)加水至1L，可不调PH7、甘油液4℃31ml丙三醇 5.5mlDDW 25.5ml8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）总体积100ml 终浓度甲醇Methanal 45ml 45%水45ml冰醋酸10ml 10%R250 0.25g 0.1%改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇）100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。
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双向电泳
一、材料
样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH
二、试剂
SDS-PAGE所需试剂
1、30％Acry-Bis (w/v)
29.2％Acry 29.2g
0.8％Bis 0.8g
加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配
2、10％的SDS贮液(w/v)
RT保存，因SDS在4℃会析出
3、Tris-HCl buffer
①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer
100ml含Tris 18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存
②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：
50ml 含Tris 6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存
4、TEMED
以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存
5、10％AP
1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置
6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存
终浓度
Tris碱3g 250mM
Gly（25.05）14.4g 250mM
SDS 1g 0.1% (192mM)
加水至1L，可不调PH
7、甘油液4℃31ml
丙三醇 5.5ml
DDW 25.5ml
8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）
总体积100ml 终浓度
甲醇Methanal 45ml 45%
水45ml
冰醋酸10ml 10%
R250 0.25g 0.1%
改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇）
100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。
9、脱色液
7.5ml的冰醋酸
5ml的甲醇
加水至100ml
或者用含有少量NaCl的清水进行脱色
IEF 试剂
10、一向裂解液Lysis buffer ，-80℃贮存
总体积MW 10ml 终浓度
urea 60.06 4.2042g 7M 硫脲(thiourea) 76.12 1.5224g 2M CHAPS 614.89 0.4g 4%
DTT 154.25 0.108 70mM Amphylyte PH3~9.5 200μl
Tris-base 121.14 0.048456g 40mM
临用前加EGTA (100mM) 400μl 4mM PMSF(100mM) 200μl 2mM
11、一向管胶覆盖液Overlay buffer ，-80℃贮存
Lysis buffer 稀释一倍即可
12、上下槽电泳液（现配）
上槽阴极液（20mM的NaOH）：10ml 1M的贮液加水至500ml 下槽阳极液（10mM的H3PO4）：5ml 1M的贮液加水至500ml 注：若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换
13、平衡缓冲液：一向管胶之后的balance buffer
2% SDS
10%甘油
5%β-巯基乙醇/DTT
62.5mM的Tris-HCl (PH6.8)
微量溴酚蓝
100ml 200ml 终浓度SDS 2g 4g 2%
甘油10ml 20ml 10% β-巯基乙醇/DTT 5ml/1.54g 10ml/3.08g 5% Tris-base 0.757125 1.51425 62.5mM
14、固定液
50%的甲醇+10%的乙酸
15、一向管胶配方
14~15cm*4 14~15cm*8 尿素 1.152g 2.304g
DDW 160μl 320μl 10% NP-40 160μl 320μl
30%Acry-Bis 400μl 800μl 甘油液744μl 1488μl
Amphylyte
PH4~6 18μl 36μl PH6~8 18μl 36μl PH3~9.5 36μl 72μl
10%APS 3.2μl 6.4μl
TEMED 0.8μl 1.6μl
16、分离胶40ml 18*16*0.1cm (1块)
胶浓度12.5% 12.8% 13%
DDW 12.4ml 12.13ml 11.87ml 30% Acry-Bis 16.8ml 17.07ml 17.33ml
1.5M PH8.8 Tris 10ml 10ml 10ml
10% SDS 400μl 400μl 400μl 10% AP 400μl 400μl 400μl TEMED 16μl 16μl 16μl
17、5% 浓缩胶 3.2ml 18*1.5*0.1cm (一块)
H2O 1.84ml
30% Acry-Bis 0.536ml
1M PH6.8 Tris 0.8ml
10% SDS 0.032ml
10% AP 24μl
TEMED 4μl
三、实验步骤
蛋白质样品制备
1、收集冻存的细胞至1.5ml以称重的eppendof管中
2、离心1000rpm 5min
3、弃上清，吸干液体后称重，得到细胞样品质量
4、按每μg/3μl的量加入lys液和1/10的ase
5、混匀后冰浴超声40min~50min
6、4℃放置30min~1h使细胞充分裂解，蛋白溶解
7、临上样前0~2℃266g/min 离心30min
8、测蛋白浓度，分装
第一向：等电聚焦电泳（IEF）
1、管胶的配置：按照试剂所示将各成分溶解于5或10ml的玻璃小烧杯中，搅拌至urea
完全溶解，最后加入TEMED＆APS轻轻搅拌混合均匀（注意搅拌温度不能超过脲
的分解温度37℃）。
2、灌胶：将上次做完2D的1st管泡酸。
使用前捞出，自来水/蒸馏水冲洗，80℃烘干
备用（确保管内干燥无水分）。
APS新购一瓶12ml，先分装1ml至离心管中，原瓶
用封口膜封好（体积占总胶体积的2%）。
在玻管14cm处标记，底部用封口膜封住，管子凉后用注射器罐胶，然后用正丁醇封顶，待胶凝。
3、预电泳：配置上下槽电泳缓冲液，上槽20mM的NaOH，下槽10mM的H3PO4，磷
酸先倒入下槽，NaOH待用（若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换）。
吸出管中正
丁醇，用DDW洗3次，拆除底部封口膜，用少量磷酸湿润管底以防气泡产生。
将
管安装至电泳槽上，上槽加入10μl覆盖液+NaOH至顶部溢出，NaOH倒入上槽，安装好电泳槽，开始预电泳，200V 15min ，300V 30min ，400V 45min 。
注：管子、平皿做好标记，表明处理组和对照组。
4、IEF电泳：预电泳结束后，将上槽电极缓冲液倒出，吸出管中上部液体，DDW洗3
次，上样：40μl样品+10μl覆盖液+NaOH至溢出，倒回NaOH，安装好电泳槽，
打开电源开始电泳，600V 14~18h ，800V 1~2h ，1000V 30min~1h 。
5、下胶及平衡：等电聚焦结束后，小心取下胶管洗净玻管表面电极液，将胶条从管中
脱出，DDW洗数次后，balance buffer 中平衡2次，10~15min/次（平衡前，也可用
12%的TCA固定胶条30min以上，清洗后平衡）。
第二向：SDS-PAGE
1、凝胶的制备：同SDS-PAGE，不用插Telfon梳子。
2、上样及电泳：同时拆掉二向胶的夹子和底部胶布，用针头小心将平衡后的一向管胶
移至平板上，再转移至二向胶的顶部，用0.5琼脂糖（用PH8.3的电泳缓冲液配置）封好，安装好电泳槽，倒入下槽电泳缓冲液，移至4℃冰箱中，带琼脂糖完全凝固（以防顶部的agorose未凝，buffer将管胶冲出）之后加入上槽电泳buffer，初始电压60V，待溴酚蓝跑出琼脂糖完全进入分离胶之后，将电压升至120V。
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