IEF-SDS PAGE双向电泳技术

双向电泳

一、材料

样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH

二、试剂

SDS-PAGE所需试剂

1、30％Acry-Bis (w/v)

29.2％Acry 29.2g

0.8％Bis 0.8g

加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配

2、10％的SDS贮液(w/v)

RT保存，因SDS在4℃会析出

3、Tris-HCl buffer

①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer

100ml含Tris 18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存

②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：

50ml 含Tris 6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存

4、TEMED

以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存

5、10％AP

1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置

6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存

终浓度

Tris碱3g 250mM

Gly（25.05）14.4g 250mM

SDS 1g 0.1% (192mM)

加水至1L，可不调PH

7、甘油液4℃31ml

丙三醇 5.5ml

DDW 25.5ml

8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）

总体积100ml 终浓度

甲醇Methanal 45ml 45%

水45ml

冰醋酸10ml 10%

R250 0.25g 0.1%

改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇）

100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。

9、脱色液

7.5ml的冰醋酸

5ml的甲醇

加水至100ml

或者用含有少量NaCl的清水进行脱色

IEF 试剂

10、一向裂解液Lysis buffer ，-80℃贮存

总体积MW 10ml 终浓度

urea 60.06 4.2042g 7M 硫脲(thiourea) 76.12 1.5224g 2M CHAPS 614.89 0.4g 4%

DTT 154.25 0.108 70mM Amphylyte PH3~9.5 200μl

Tris-base 121.14 0.048456g 40mM

临用前加EGTA (100mM) 400μl 4mM PMSF(100mM) 200μl 2mM

11、一向管胶覆盖液Overlay buffer ，-80℃贮存

Lysis buffer 稀释一倍即可

12、上下槽电泳液（现配）

上槽阴极液（20mM的NaOH）：10ml 1M的贮液加水至500ml 下槽阳极液（10mM的H3PO4）：5ml 1M的贮液加水至500ml 注：若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换

13、平衡缓冲液：一向管胶之后的balance buffer

2% SDS

10%甘油

5%β-巯基乙醇/DTT

62.5mM的Tris-HCl (PH6.8)

微量溴酚蓝

100ml 200ml 终浓度SDS 2g 4g 2%

甘油10ml 20ml 10% β-巯基乙醇/DTT 5ml/1.54g 10ml/3.08g 5% Tris-base 0.757125 1.51425 62.5mM

14、固定液

50%的甲醇+10%的乙酸

15、一向管胶配方

14~15cm*4 14~15cm*8 尿素 1.152g 2.304g

DDW 160μl 320μl 10% NP-40 160μl 320μl

30%Acry-Bis 400μl 800μl 甘油液744μl 1488μl

Amphylyte

PH4~6 18μl 36μl PH6~8 18μl 36μl PH3~9.5 36μl 72μl

10%APS 3.2μl 6.4μl

TEMED 0.8μl 1.6μl

16、分离胶40ml 18*16*0.1cm (1块)

胶浓度12.5% 12.8% 13%

DDW 12.4ml 12.13ml 11.87ml 30% Acry-Bis 16.8ml 17.07ml 17.33ml

1.5M PH8.8 Tris 10ml 10ml 10ml

10% SDS 400μl 400μl 400μl 10% AP 400μl 400μl 400μl TEMED 16μl 16μl 16μl

17、5% 浓缩胶 3.2ml 18*1.5*0.1cm (一块)

H2O 1.84ml

30% Acry-Bis 0.536ml

1M PH6.8 Tris 0.8ml

10% SDS 0.032ml

10% AP 24μl

TEMED 4μl