SDS-PAGE电泳注意事项
蛋白质SDS-PAGE电泳注意事项
匀浆:1.匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。
2.SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。
3.所有操作尽量在冰上进行。
4.94C水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事先要打开升温）。
5.PMSF是有毒试剂，处理时注意。
6.操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。
7.热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到4C,即可。
8.离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。
9.SDS,DDT,PMS是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。
制胶：10.APS和TEME是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30%。
11.玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。
12.丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。
（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。
）13.1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm勺玻璃板用白色条带封底。
（封紧以防漏胶）14.凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。
15.样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。
一般要5-10分钟。
而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。
16.点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。
（点在边上时，跑出的带是斜的）17.点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。
18.开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。
19.电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）20.脱色时，尽量多次进行换水。
21.上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10卩g-50卩g,，一般V 15卩I.22.做胶时，凝胶时间控制在25min。
梳子不能歪来歪去。
23.上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。
24.制胶时，在加APS前尽量不要搅拌，加入APS后可以轻轻搅拌，不要产生气泡。
注意：温度，时间，光照，APS和TEMEDfE会对凝胶产生影响。
SDS-PAGE电泳常见问题及解决
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法2Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
Q：样品如何处理？A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
sds电泳脱色技巧
sds电泳脱色技巧
SDS-PAGE电泳染色脱色时间较长，如果急于看结果，可以采用以下方法：
1. 将胶转移到适当大小的玻璃平皿中，倒入考马斯亮蓝染色液，液面能覆盖胶面即可，然后用另一平皿盖住表面，放入微波炉中加热，一见沸腾，立即停止，然后放在摇床上摇5分钟左右即可，这样的染色效果很好。
2. 脱色也可采取相同的方法，只不过把考马斯亮蓝染色液换成脱色液，脱色时可以多摇几分钟，多换几次脱色液，效果很好。
采用上述方法需要注意在微波炉中加热时间不可太长，一沸腾立即停止加热，否则容易将染色液渐出。
此外，还有其他一些技巧：
1. 可以在45℃左右的水浴中进行染色和脱色，时间会缩短。
2. 用乙醇和乙酸配脱色液，然后加热脱色，很快的，可加热到马上要沸腾为止。
3. 用蒸馏水洗胶，并放在微波炉里加热。
只是要掌握好时间，时间太长而蛋白的含量又比较低的话，容易脱过了。
4. 加入甲醇-乙酸脱色液后，将其直接放到微波炉里加热一分钟，然后放几张干净的tissue进去（把它叠成条状，沾在脱色皿边上就OK啦！不要和胶混在一起），能吸去很多染料，加快脱色。
以上方法仅供参考，可以根据实际情况选择合适的方法。
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。
非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。
然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。
3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。
一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。
2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。
3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳注意事项sds是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中重新加入还原剂和sds后，分子被裂解成多肽链，裂解后的氨基酸侧链和sds融合成蛋白-sds胶体，所带的负电荷大大少于了蛋白原有的电荷量，这样就消解了相同分子间的电荷差异和结构差异。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
共聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺生成而变成，催化剂生成的常用方法存有两种：化学生成法和光生成法。
化学生成以过硫酸铵（ap）为催化剂，以四甲基乙二胺（temed）为快速剂。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由ap催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为ph6.7的tris-hcl。
分离胶是由ap催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为ph8.9tris-hcl。
电极缓冲液是ph8.3tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种ph值使不连续体系形成了凝胶孔径、ph值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
sds－共聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于纯化过程中纯度的检测，提纯的蛋白质通常在sds电泳上要只有一条拎，但如果蛋白质就是由相同的亚基共同组成的，它在电泳中可能会构成分别对应于各个亚基的几条拎。
上样缓冲液的作用：形成sds-蛋白复合物，使其带负电；sds和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。
sds促进作用：回去蛋白质电荷、离解蛋白质之间的氢键、中止蛋白分子内的亲水性促进作用、回去多肽卷曲，除了并助溶剂的促进作用。
2.sds-page电泳凝胶中各主要成分的作用（1）铀与拆分胶凝结的优劣轻易关系到电泳顺利是否，与促凝剂及环境密切相关。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳知识讲解
S D S-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。
一、原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。
本实验采用垂直板状不连续系统。
所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。
1．样品的浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。
在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。
SDS-PAGE电泳
2.实验器材：
垂直板电泳装置 电泳仪 脱色摇床 移液枪 滤纸 大培养皿
垂直板电泳装置
电泳槽（1）、电泳架、灌胶架（2）、灌胶架夹（3）、橡胶垫（4）、 长玻璃板（5）、短玻璃板（6）、样品梳（7）、加样器（8）。
三.实验步骤
1. 安装制胶模具。
2. 分离胶的制备与加入：按规定的比例制备分离胶；将分离胶充分混
SDS-PAGE
杨兵
主要内容：
一、SDS-PAGE简介 二、实验试剂与器材 三、实验步骤 四、注意事项
一.
SDS-PAGE（简介）
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ： 什么是聚丙烯酰胺凝胶？ 加入SDS的作用？ SDS-PAGE的用途？ SDS-PAGE分离蛋白质的原理？ SDS-PAGE的优缺点？
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作 图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下 进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
分子量范围与凝胶浓度的关系
丙烯酰胺浓度（%） 15 10 7.5 线性分离范围（kD） 12～43 16～68 36～94
5.0
57～212
4. SDS-PAGE分离蛋白质的原理
二.实验试剂与器材
1.试剂： (1) 30%丙烯酰胺 (2) 10%SDS (3)分离胶缓冲液:3.0mol/L Tris-HCl pH 8.8 (4)浓缩胶缓冲液: 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 (5) 10%过硫酸铵(APS)溶液 (6) 四甲基乙二胺(TEMED) (7) 上样缓冲液:Tris-HCl、 SDS、溴酚蓝、甘油、 2-巯基 乙醇 (8) 电极缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液） (9) 染色液:甲醇、水 、冰乙酸 、考马斯亮蓝R250 (10) 脱色液:甲醇、水 、冰乙酸
SDS-PAGE电泳、westernblotting过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE 电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
SDSPAGE操作方法要点
SDS-PAGE教程1 SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 g去污剂结合。
当分子量在15 KDa到200 KDa 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K – bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE [Laemmli法]这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。
现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。
你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！SDS-PAGE各试剂配制方法30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。
sds page凝胶电泳步骤
sds page凝胶电泳步骤以SDS-PAGE凝胶电泳步骤为标题的文章SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测量方法，其步骤包括蛋白质样品的制备、样品加载、电泳运行、染色和图像分析等。
本文将详细介绍SDS-PAGE凝胶电泳的步骤及相关注意事项。
一、蛋白质样品的制备准备要分离的蛋白质样品，并将其加入样品缓冲液中，以使蛋白质溶解并保持其天然构象。
样品缓冲液通常包含Tris-HCl缓冲液、甘油、SDS和β-巯基乙醇等成分，用于维持样品的pH值和还原环境，使蛋白质完全展开。
二、样品加载将制备好的蛋白质样品加载到凝胶孔中。
通常使用微量吸管或微量注射器将样品缓冲液缓慢地注入凝胶孔中，确保样品完全进入凝胶中。
三、电泳运行将已加载样品的凝胶板放置在电泳槽中，确保凝胶完全浸泡在电泳缓冲液中。
然后将电泳槽连接到电源，并设置合适的电压和电流参数。
根据需要，可以选择常规电泳或快速电泳。
在电泳过程中，蛋白质样品会在凝胶中被电场推动，根据其分子大小和电荷不同，被分离成不同的带状条带。
较小的蛋白质分子迁移速度较快，而较大的蛋白质分子迁移速度较慢。
四、染色电泳结束后，需要对凝胶进行染色以可视化蛋白质带状条带。
常用的染色方法有银染色和Coomassie蓝染色。
银染色对蛋白质敏感性高，但操作繁琐；而Coomassie蓝染色操作简单，但对蛋白质敏感性相对较低。
五、图像分析通过使用分析软件或图像扫描仪，将染色后的凝胶图像数字化，并进行分析。
可以测量蛋白质带状条带的相对迁移距离和相对强度，进而确定蛋白质的分子大小和相对丰度。
在进行SDS-PAGE凝胶电泳实验时，还需要注意以下事项：1. 准备工作确保操作台和仪器干净，并准备好所需的试剂和设备。
避免在实验过程中发生交叉污染。
2. 样品加载在加载样品时，应避免空气泡和溢出。
确保样品均匀地加载到凝胶孔中，以获得清晰的带状条带。
3. 电泳运行条件根据蛋白质样品的大小和分离需求，选择合适的电压和电流参数。
蛋白质的SDSPAGE电泳
无法分析疏水性蛋白质
02
SDS-PAGE电泳主要适用于分析带有强负电荷的蛋白质，对于疏
水性蛋白质，其分离效果可能不佳。
对样品要求高
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为了获得准确的电泳结果，需要确保样品的纯度和浓度，这可
能需要耗费较多的时间和精力。
感谢您的观看
THANKS
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丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺： 用于制备凝胶的交联剂。
过硫酸铵和TEMED （N,N,N',N'-四甲基乙二 胺）：促进凝胶聚合。
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考马斯亮蓝染料：用于染色 蛋白质条带。
03 电泳技术
聚丙烯酰胺凝胶的制备
制备凝胶前的准备
配制凝胶溶液
清洗玻璃板、准备试剂和工具，确保实验 环境干净整洁。
脱色
染色完成后，将凝胶从染色液中取出 ，进行脱色处理，以去除背景颜色， 使蛋白质条带更清晰可见。常用的脱 色液有乙醇和醋酸。
结果观察与解读
观察
通过观察凝胶上的蛋白质条带，可以判断蛋白质的大小、数量和浓度等信息。
解读
根据蛋白质条带的颜色深浅、迁移率和电泳行为等特征，可以对蛋白质的性质 进行初步判断。
根据所需的浓度和孔径大小，准确称量丙 烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，加入适量的水 和缓冲液，混合均匀。
灌制凝胶
聚合凝胶
将凝胶溶液倒入玻璃板间的凹槽中，确保 没有气泡和缝隙，然后插入梳子以固定凝 胶。
将灌制好的凝胶放入恒温箱中，保持一定 的温度和时间，使凝胶聚合。
样品处理与加样
01
02
03
样品准备
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当的稀释和变 性处理。
实验步骤
样品制备
将待测蛋白质样品与SDS和β-巯基乙 醇混合，使蛋白质完全变性并带上等 量的负电荷。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意.
3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。
电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。
当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。
所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。
5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。
这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。
这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。
双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。
sds-page凝胶电泳
6. 样品及标准品的准备：标准品按说明书进行处理， 样品加入ddH2O溶解后，再加入SDS上样缓冲液。 7. 加样电泳（每孔加样15μl）。 8. 卸下玻板，剥离凝胶放在器皿内，切去一角作为 方位标记。 9. 染色：用至少五倍体积染色液浸泡凝胶，于平缓 摇摆平台上室温1h左右。 10.脱色：用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，至 蛋白质条带清晰
凝胶由分离胶和浓缩胶组成： 上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效 应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度， 使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层， 大大提高了分辨率。 下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应， pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳 动速度主要决定于分子量。
SDS-PAGE
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决 于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二 烷基磺酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。
因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
注意事项
（1）聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套。 （2）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，防 止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。 （3）梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需 水平。
（4）微量注射器（加样器）上样时, 注射器不可过低, 以防刺破胶体；也不可过高 , 样品下沉时易发生扩 散，溢出加样孔。 （5）剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
SDSPAGE电泳过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行,而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集,最常用的就是SDS－PAGE电泳技术,关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS十二烷基硫酸钠, SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合;当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式：logMW=K-bX,式中：MW为分子量,X 为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量;Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响A：在SDS－PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris－HCL 缓冲系统,浓缩胶是,分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统;在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低；而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动;由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带;当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离;所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素;Q：样品如何处理A：根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理;1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT或Beta 巯基乙醇后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离;一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样;2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象;100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺,并在室温保温30min;3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1％SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用;Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择,分离胶选择,选择tris－HCL系统,具体作用后面介绍；TEMED与AP：促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠SDS：阳离子去污剂,作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠; Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率;建议做法：待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用;忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶;一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺;2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103;Q：“微笑”两边翘起中间凹下形带原因A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中;处理办法：待其充分凝固再作后续实验;Q：“皱眉”两边向下中间鼓起形带原因A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净;处理办法：可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡;Q：为什么带出现拖尾现象A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的;处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长,重新配制；降低凝胶浓度;Q：为什么带出现纹理现象A：主要是样品不溶性颗粒引起的;处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂;Q：什么是“鬼带”,如何处理A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端有时在浓缩胶中的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶;但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用; 处理办法：在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化;Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象;主要与缓冲液和分离胶的浓度有关;处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度;Q：为什么电泳的条带很粗A：电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因;处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确；适当降低电压；Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢A：这种现象一般初学者易出现;比如电压50v以上,可电流却在5mA以下;主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路;包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉比如倒胶用的橡胶皮;处理办法：电泳槽正确装配即可;Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗A：这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响;前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的;聚丙烯酰胺凝胶电泳作用：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸;作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应;它有两种形式：1非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开;而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质;该技术最初由Shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小可以忽略电荷因素;作用SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构;而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂;在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异;SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,于连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率;浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带;当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸;电泳开始后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子;蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中;电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层;此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关;补充信息聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGEPolyacrylamde gel electrophoresis聚丙烯酰氨凝胶电泳,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术;聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成;催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法;化学聚合以过硫酸铵AP为催化剂,以四甲基乙二胺TEMED为加速剂;在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构;PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应;不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳;不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成;浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为的Tris-HC1;分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为 Tris-HC1;电极缓冲液是 Tris-甘氨酸缓冲液;2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素;过程蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素;如果加入一种试剂使电荷因素消除,那电泳迁移率就取决于分子的大小,就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量;1967年,Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠SDS具有这种作用;当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇,SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原;由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量, 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别,SDS与蛋白质结合后,还可引起构象改变,蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样,约为18A,这样的蛋白质—SDS复合物,在凝胶中的迁移率,不再受蛋白质原的电荷和形状的影响,而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷,所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离;因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量;当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式：logMW=K-bX,式中：MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量;SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测,纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带,但如果蛋白质是由不同的亚基组成的,它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带;SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度,一般只需要不到微克量级的蛋白质,而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况,这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的;常见问题及分析1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响在SDS－PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统,浓缩胶是,分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统;在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低；而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动;由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带;当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离;所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素;2. 样品如何处理根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理;1还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT或Beta巯基乙醇后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离;一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样;2带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象;100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺,并在室温保温30min;3非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1％SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用;3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择,分离胶选择,选择tris－HCL系统,TEMED与AP：AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠SDS：阳离子去污剂,作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠;4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率;建议做法：待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用;忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶;一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺;一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103;5.“ 微笑”两边翘起中间凹下形带原因主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中;处理办法：待其充分凝固再作后续实验;6. “皱眉”两边向下中间鼓起形带原因主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净;处理办法：可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡;7. 为什么带出现拖尾现象主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的;处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长,重新配制；降低凝胶浓度;8. 为什么带出现纹理现象主要是样品不溶性颗粒引起的;处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂;9. 什么是“鬼带”,如何处理“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端有时在浓缩胶中的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶;但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用;处理办法：在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化;10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象;主要与缓冲液和分离胶的浓度有关;处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度;11. 为什么电泳的条带很粗电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因;处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢这种现象一般初学者易出现;比如电压50v以上,可电流却在5mA以下;主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路;包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉比如倒胶用的橡胶皮;处理办法：电泳槽正确装配即可;13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响;前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的;14. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事通常胶在30MIN-1H内凝;如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效;APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色; 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶;15. 电泳时间比正常要长可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高;电泳相关溶液的配置：1、30%丙稀酰胺混合溶液100ml：称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺,用水溶解定容到100ml,过滤,4摄氏度保存一个月;2、5×SDS电极缓冲液：称取Tris ,甘氨酸,SDS 加dH2O定容至100 0ml;3、2×样品缓冲液10ml：甘油2ml,溴酚蓝,1MTris·Cl1ml巯基乙醇,1 0%SDS 4ml;4、染色液的配制1000ml:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取%考马斯亮蓝R250 ,再将其一一加到1000ml锥形瓶中,用蒸馏水加以补足至1000ml;加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250,甲醇或者乙醇,蒸馏水,乙酸;充分混匀后进行过滤,收集滤液备用;当过滤速度变慢时要更换滤纸,快速过滤完,不可隔夜以免影响染色效果;5、脱色液1000ml:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中,待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用;收集液的SDS-PAGE分析：1、取20ul收集液,加入5×样品缓冲液5ul,在80℃水浴锅中煮5min;分离胶配方Resolving Gel 10ml6%8%10%12%15%H2O30% acryl amide mix454x resolving-gel buffer20% SDS20% APSTEMED浓缩胶配方10mlH2O ml30% acryl amide mix ml8x stacking-gel buffer ml20% SDS ml20% APS mlTEMED ml2、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶,安装好电泳仪,在槽中加入电极缓冲液;3、按一定顺序在加样孔中加入样品;4、打开电源将电压调到80v,待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止;5、将凝胶小心取下放入容器中,加入染色液,用摇床摇2－3h6、待条带清晰后倒出染色液,加入脱色液过夜7、将脱色液倒掉,在灯箱下观察8、用数码相机拍照,分析;。
SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15kDa到200kDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法要点
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质含量实验注意事项
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质含量的实验注意事项如下：
1. 实验器材的清洁：ACr和BIs是神经性毒剂且对皮肤有刺激作用，配制贮液、配胶、灌胶操作时，要戴上医用乳胶手套或指套，避免与皮肤接触。
只要细心操作，一般不会引起损伤。
2. 严谨操作：SDS-PAGE 测定分子量有误差，不可完全信任。
有必要时，应同时作标准曲线。
并且SDS—PAGE 测定分子量有10%误差，不可完全信任。
3. 注意个人安全：在实验过程中请注意个人安全，避免直接接触化学试剂。
以上就是用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质含量的注意事项，如果您对实验步骤有疑问或者想了解更多信息，请咨询专业人士。
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SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。
注意问题
1.样品处理
上样缓冲液的作用：形成SDS-蛋白复合物，使其带负电；SDS和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。
SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，还有助溶剂的作用。
2. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用
（1）浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
3. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径
待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
4. .“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
5. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
6. 带出现拖尾现象
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
7. 带出现纹理现象
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
8. 溴酚蓝不能起到指示作用
实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。
主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
9. 电泳的条带很粗
电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；10. 电泳电压很高而电流却很低呢
比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。
主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。
包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
11.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳影响
一般对电泳不会有太大的影响。
前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
12. 凝胶时间不对，或慢或快
通常胶在30MIN-1H内凝。
如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。
APS 应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。
如果凝的太快，可能是APS和TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
13. 电泳时间比正常要长
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
14. 分离胶加上后为什么要立即加水
加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
注意：SDS-PAGE电泳关键在于胶是否制得均匀平整，当然这跟灌胶用的模具和方法有一定关系。
加入TEMED和过硫酸铵后丙烯酰胺开始聚合，但是过硫酸铵易被氧化，所以操作要迅速，而且最后要液封，保证模具内不漏气才能使胶聚合的很好。
同时不要把制胶用的玻璃板中间压太紧，这样会使中间的胶偏薄，水封时要小心加入水不要剧烈扰动胶层，使某些地方的胶被稀释，总之一句话确保胶的各部分电阻率均匀，这样跑出的条带才不会歪掉。
制胶水平比较好的胶从胶板上取下后应该是平整的，而不是某些地方翘起。