SDS-PAGE电泳注意事项
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SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。
强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测,纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带,但如果蛋白质是由不同的亚基组成的,它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。
注意问题
1.样品处理
上样缓冲液的作用:形成SDS-蛋白复合物,使其带负电;SDS和巯基乙醇使蛋白质解离,综上两点为了在电泳中,只根据分子量来分离。
SDS作用:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠,还有助溶剂的作用。
2. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用
(1)浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关。
3. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径
待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。
4. .“微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。
处理办法:待其充分凝固再作后续实验。
5. “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。
6. 带出现拖尾现象
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。
7. 带出现纹理现象
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。
8. 溴酚蓝不能起到指示作用
实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
9. 电泳的条带很粗
电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。
处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;10. 电泳电压很高而电流却很低呢
比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。
11.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳影响
一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。
12. 凝胶时间不对,或慢或快
通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS 应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。如果凝的太快,可能是APS和TEMED 用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。
13. 电泳时间比正常要长
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。
14. 分离胶加上后为什么要立即加水
加入分离胶后,立即覆一层双蒸水,一是为了使分离胶界面保持水平,用水就可以把它压平,使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
注意:SDS-PAGE电泳关键在于胶是否制得均匀平整,当然这跟灌胶用的模具和方法有一定关系。加入TEMED和过硫酸铵后丙烯酰胺开始聚合,但是过硫酸铵易被氧化,所以操作要迅速,而且最后要液封,保证模具内不漏气才能使胶聚合的很好。同时不要把制胶用的玻璃板中间压太紧,这样会使中间的胶偏薄,水封时要小心加入水不要剧烈扰动胶层,使某些地方的胶被稀释,总之一句话确保胶的各部分电阻率均匀,这样跑出的条带才不会歪掉。制胶水平比较好的胶从胶板上取下后应该是平整的,而不是某些地方翘起。