SDS-PAGE电泳注意事项

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。

注意问题

1.样品处理

上样缓冲液的作用：形成SDS-蛋白复合物，使其带负电；SDS和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。

SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，还有助溶剂的作用。

2. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用

（1）浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

3. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径

待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

4. .“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

5. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

6. 带出现拖尾现象

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

7. 带出现纹理现象

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

8. 溴酚蓝不能起到指示作用

实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

9. 电泳的条带很粗

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；10. 电泳电压很高而电流却很低呢

比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

11.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳影响

一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

12. 凝胶时间不对，或慢或快

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS 应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

13. 电泳时间比正常要长

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

14. 分离胶加上后为什么要立即加水

加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

注意：SDS-PAGE电泳关键在于胶是否制得均匀平整，当然这跟灌胶用的模具和方法有一定关系。加入TEMED和过硫酸铵后丙烯酰胺开始聚合，但是过硫酸铵易被氧化，所以操作要迅速，而且最后要液封，保证模具内不漏气才能使胶聚合的很好。同时不要把制胶用的玻璃板中间压太紧，这样会使中间的胶偏薄，水封时要小心加入水不要剧烈扰动胶层，使某些地方的胶被稀释，总之一句话确保胶的各部分电阻率均匀，这样跑出的条带才不会歪掉。制胶水平比较好的胶从胶板上取下后应该是平整的，而不是某些地方翘起。