SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

pH6.8
5%
Gly- Gly-
Gly- Gly-
Gly- Gly-
蛋白质离子
Cl- Cl- Cl-
Cl- Cl- Cl-
Cl- Cl-Cl-
快慢离子的产生 高的电压梯度
pH8.8
10%
Pr-运动加速 浓缩效应
实验原理
• 分子筛效应
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97)
pH6.8
5% Gly- Gly- - Gly Gly Cl Cl- -Gly Cl- -
蛋白质离子
Gly-GlyGly-Gly-
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动
- - - Cl - Cl -Cl Gly Cl Cl- -Cl Gly Gly Gly Gly Gly
pH8.8
10%
分子筛效应
实验原理
• 分子筛效应
主要离子
氯离子 甘氨酸蛋白质离子 甘氨酸解离增加
加入分离胶溶 液 pH 8.8

封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
制备浓缩胶(浓缩胶)
样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
分离胶 pH 8.8
样品处理
Sample buffer
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
实验流程
配胶
配分离胶(下胶)
配浓缩胶(上胶)
样品制备
电泳（1.5~2h） 染色（20min） 脱色（30min~2h） 分析
实验过程
1.装配装置
BG-verMINI型迷你垂直电泳槽 (北京百晶)
实验过程
2.凝胶配制
下胶(分离胶)10% H2O 30%Acr-Bis Buffer (含SDS) 10%APS TEMED 3.9ml 3.3ml (1.5M Tris-Cl pH8.8) 2.6ml 200ml 10ml
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
PH6.8
Cl-
Gly-
Cl-
GlyCl-
PH8.8
Pr为什么带负电
加样缓冲液
巯基乙醇 断二硫键 断化学键
C N
H3C
SDS
SO4Na
带负电荷
SDS：Pr=1.4:1 促沉 甘油
二硫键
溴酚兰 Tris
氨基酸侧链
盐键
疏水作用 氢键
?
实验原理
• 浓缩效应
分离胶 pH 8.8
Staking gel
Separating gel
电流路径
负极 凝胶 正极
外槽
——
内槽
——
外槽
实验过程
5. 染色、脱色 A. 染色20分钟
考马斯亮兰R250
B. 脱色30分钟至2小时
蛋白质的染色方法
• 氨基黑
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
• 考马斯亮兰R-250，G250
G250测定蛋白含量
6-2 整块胶分离的条带太宽
主要是未浓缩好的原因
处理办法： • 适当增加浓缩胶的长度； • 保证浓缩胶贮液的 pH 正确 （6.7） ； • 适当降低电压；
7. “鬼带”
“鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会 出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知 条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过 程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子 重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子 量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目 标条带有相同的免疫学活性， WB 反应中可见其能与目 标条带对应的抗体作用。
Bradford法
• 考马斯亮蓝G250染色法
• 此法根据蛋白质与染料相结合的原理设计 的。
• 与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应 迅速而稳定。 • 反应化合物在595nm处有最大光吸收值 • 灵敏度25 mg/ml~200 mg/ml
注意各方法适用条件—范围
SDS Triton Tween -X100 20,60,80
Aprotinin 抑肽酶
丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶
胰蛋白酶及糜蛋白酶
Pepstatin 抑肽素
天冬氨酸蛋白酶
定量方法
• • • • 紫外吸收法 BCA法 Lowry法 Bradford法
以双缩脲为基础的方法
1. BCA法 bicinchoninic acid 二奎啉甲酸法
以双缩脲为基础的方法
2. lowry法 folin酚法 磷钨酸和磷钼酸 钨蓝、钼蓝 BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍 0.005 - 0.10 mg/ml
*Acr有神经毒 性
上胶(浓缩胶)5% 3.4ml 0.83ml (1M Tris-Cl pH6.8) 0.68ml 100ml 10ml
TOTAL
10ml
5ml
制备分离胶(下胶)
出现明显界面时， 分离胶凝聚完成 （ 10~20min）
倒出水或正丁醇， 并用加样枪/滤纸 吸干
封水或饱和 正丁醇溶液
实验原理
迁移率=
蛋白质移动的距离 脱色后的胶长 染色前胶长 指示剂移动的距离
pH6.8
5%
pH8.8
10%
• 分子筛效应
实验原理
染色前
迁移率=
“蛋白质移动的距离”
指示剂移动的距离
L1 X L3
L2 X L4
染色后
L1
Lx
L4
蛋白质的带在哪呢？ L3
L2
PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.
处理办法： 在加热煮沸后， 再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇， 以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来 阻止还原剂的氧化。
谢谢!
附：蛋白质的提取与定量方法
• 蛋白质提取
• 不同来源，不同的方法
提 取 原 则
• 细胞的破碎 • 合适的裂解液 • 一般在冰上进行 • 加入适当的蛋白酶抑制剂
5% 5%
EDTA
DTT -巯基 乙醇
1mM 1mM
BCA
5%
10mM
Bradf 0.1% ord
0.1%
0.06%
5mM 1M
选择蛋白质定量方法时应考虑
• 实验对测定所要求的灵敏度和精确度；
• 蛋白质的性质；
• 溶液中存在的干扰物质；
• 测定所花费的时间等。
+
HN CH2 NH C O H2C CH
H2C
CH C O HN CH2 NH C O
H2C
CH
(
H2C
CH )n C O
H2C
CH C O HN CH2
(
H2C
CH )n C O NH2
H2C
CH C O HN CH2 NH C O
(
H2C
CH )n C O NH2
n决定了交联度 与浓度一起决定孔径的大小 蛋白质是29：1 核酸是19：1
• 银染
敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳
H2C H2C CH C O NH2
CH C O
过硫酸铵是催化剂
TEMED是加速剂
H2C
聚 合 原 理
*Acr有神经毒 性
CH C O NH2 H2C CH C O NH2 H2C CH C O NH2 H2C CH C O NH2
H2C CH C O HN CH2 NH C O H2C CH
Marker 97 66 44 29 20
14
Tanon-1600数码凝胶图像分析系统
GIS 1D 图像分析软件(Ver. 4.00)
诱导前后蛋白表达差异
IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。
1为诱导前，2～6分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。
电泳过程中的不正常现象 1 “微笑”现象
主要离子
PrGly- Gly-
PrGly- GlyCl- Cl- Cl-
PrGly- GlyCl- Cl-Cl-
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
pH6.8
Cl- Cl- Cl-
快慢离子的产生 高的电压梯度
pH8.8
Pr-运动加速
实验原理
• 浓缩效应
主要离子
氯离子 甘氨酸离子 (pI 5.97)
哺乳类细胞的裂解液-RIPA
• 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), • 150 mM NaCl, • 1% NP-40（乙基苯基聚乙二醇，常用非离 子性去垢剂 ）, • 0.1% SDS
蛋白酶抑制剂
抑制剂 靶蛋白酶
PMSF 苯甲基磺酰氟
EDTA
丝氨酸蛋白酶
金属蛋白酶
Leupeptin 亮肽素
指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，主要是由于凝胶的中
间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
2 皱眉现象
由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶 和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的 凝胶聚合不完全 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
(
H2C
NH2
NH C O
CH )n C O NH2
H2C
CH
(
H2C
CH )n C O NH2
H2C
CH
实验原理
1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移 动，这种现象称为电泳。
电荷
分子大小
分子形状
实验原理
• 浓缩效应
主要离子
PrCl-
PrClGlyGlyCl-GlyCl-
ClGly-
PrClGly-
1. 2. 3. 4. SDS - mercaptoethanol Sample buffer bromophenol blue 金属浴(100℃)中15min Glycerol
SH s s
SH
上样及电泳
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
加入样品
浓缩胶 pH 6.8
开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚 蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
Gly- Gly-GlyCl- Cl- ClGly-Gly-GlyCl- Cl- ClGly-Gly-GlyCl- Cl-Cl-
无快慢离子 Pr-根据分子量运动
pH8.8
10%
分子筛效应
实验原理
• 分子筛效应
lgMw
lgMw=-bx+K
pH6.8
5%
电泳迁移率
pH8.8
10%
Pr Mw在11.7-165Kd
3 “拖尾”现象 样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大
解决办法： 加样前离心 选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液 加增溶试剂 降低凝胶浓度
4 “纹理”现象 样品中的不溶性颗粒引起的
解决办法： 增加溶解度 离心除去不溶性颗粒
5 偏斜现象 电极放置不平行或加样位置偏斜引起
6-1 某一条泳道条带太宽 加样量太多或者加样孔泄露引起