第四章 基因克隆的载体
常用的克隆载体
第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作原理 第三章 基因疫苗抗原基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构建 第五章 基因疫苗制备第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素第九章 基因疫苗安全性第十章 细菌病基因疫苗第十一章 病毒病基因疫苗第十二章 寄生虫病基因疫苗第十三章 肿瘤基因疫苗第十四章 控制动物生长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
其中，质粒是目前应用最为广泛的克隆载体。
下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。
（一）质粒特性质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。
有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。
有的质粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。
质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。
例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。
质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。
质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。
根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类型。
严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。
质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA（ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。
质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。
实验室常利用这些理化特性鉴定和纯化质粒。
基因工程：第四章1
第四章基因克隆载体1. 定义：携带外源基因进入受体细胞的这种工具称为载体( Vector)载体的本质是DNA 。
2. 在基因工程中所用的载体，主要有5类:⑴质粒(Plasmid)⑵噬菌体 (phage)的衍生物⑶柯斯质粒(Cosmid)⑷单链DNA噬菌体M 13(5)动物病毒3. 理想的载体应具备的条件：(1) 具有自我复制能力(2) 有适宜的限制酶切位点，最好是对多种常用的限制酶有单一切点，并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上(3) 具有一个或几个选择性遗传标记(4) 分子量较小，在受体细胞内有较多的拷贝数⑸可携带足够长度的外源DNA片断，并能有效的转化至宿主细胞中(6)容易从宿主细胞中分离纯化4.1质粒载体4.1.1质粒的一般生物学特性1. 质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
它广泛存在于细菌细胞中，在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。
在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。
质粒分子的大小为1~200kb，它可以“友好”地“借居”在宿主细胞中，依靠宿主细胞的现有体系进行自身复制，并将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达；同时质粒也提供给宿主细胞一些抗性、免疫性。
2. 质粒的类型(1) F 质粒：又叫F 因子或性质粒(sex plasmid), F +、F -。
F + F -时，染色体标记低频转移，F 因子高频转移F 质粒可以整合到染色体上，同步复制(这种菌株在与F -菌株杂交时，比F +所产 生的遗传重组频率要高103倍)，称为Hfr 菌株(高频菌株)Hfr F -时，染色体标记高频转移，F 因子低频转移F 因子从染色体脱离下来时，往往会带有染色体片断，这种带有染色体片段的F 因子称为F'因子。
(2) R 质粒：也称抗药性因子。
R 质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此中抗性通常能转移到缺乏该质粒的受 体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
基因工程载体
二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
基因工程-第四章
（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
基因克隆载体名词解释
有关“基因克隆载体”的意思解释
有关“基因克隆载体”的意思解释如下：
基因克隆载体是指用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA分子。
基因克隆载体能够承载外源DNA片段（目的基因）并将其带入受体细胞，帮助目的基因在受体细胞中稳定遗传和表达。
基因克隆载体的基本元件包括启动子、编码区和终止子等，这些元件能够控制基因的表达。
基因克隆载体通常具有松弛的复制子，能够带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
除了基因克隆载体，还有一种表达载体，其除了具有基因克隆载体的基本元件外，还应具有转录/翻译所必需的DNA顺序，如转录因子、转录激活蛋白等，以实现目的基因的有效转录和翻译。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
基因工程的质粒载体
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
四、基因克隆载体(一)
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒
因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬 菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 我复制。 柯斯质粒（cosmid）
cos位点 cos site-carring plasmid 质粒
二、柯斯质ห้องสมุดไป่ตู้载体的特点
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，不易 于检测：因此如用柯斯质粒制备基因文 库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间。现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
第三节 柯斯质粒(cosmid)
一、柯斯质粒（cosmid）概述
1、定义：是由λ噬菌体与质粒（plasmid）共同构 建而成的杂合载体。 2、柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的cos位点:使其可被包装蛋白识别包装； 质粒的复制起点：使其在宿主细胞中可自主复制。
另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列， 质粒中的抗性标记基因（如：AmpR，TetR），以 及酶切位点（EcoRⅠ、HindⅢ）。
四、柯斯质粒作载体的优、缺点
1、优点： 可携带外源基因大， 30～44.5 kb 。
(整理)质粒特性
第四章基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。
它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②R质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。
质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。
其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。
凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。
二．质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。
第四章 基因克隆的质粒载体(共118张PPT)
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法
(3)微量碱变性法
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%；
2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量 的细菌染色体易断裂成线性片段，而质粒 DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态 ；
3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱 基中，导致链的解旋；而且形成的EB- DNA复
的一个重要特征。
正超螺旋(positive supercoil)
盘绕方向与DNA双螺旋方同相同
负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反
4. 作为克隆载体质粒的条件
适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括
三种共同的组分： 复制子
选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数
菌中生存.
2.质粒的生物学特征
只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。
自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的
线粒体中都发现有质粒的存在。
质粒绝大多数是环形双链的DNA
但也存在有线形质粒 、RNA质粒（酵母的杀伤质粒）
质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有一些 质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随染色体 的复制而复制,称为附加体。
乎都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持
１５－２０个拷贝。
质粒就其复制方式而言分为两类：
严紧型（stringent plasmid) 每个寄主细胞中仅有１－３份的拷贝。
松弛型（relaxed plasmid) 每个寄主细胞中仅有１０－６０ 份的拷贝。
(整理)基因克隆的质粒载体
基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较 详尽研究的主要有质粒、质粒和 质粒。
①质粒又叫因子或性质粒（ ）m 它们能够使寄主染色体上 的基因和 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且 通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的 抗菌素抗性能力。
③ 质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成 的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死 的蛋白质。
第一节 质粒的一般生物学特性一、质粒细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝 大多数的质粒都是由环形双组成的复制子（图 ）。
Q 大肠杆菌质粒分子的结构示意图质粒是细菌染色体外能够自我复制的环形双链的DNA 分子.编码抗菌素抗性基因的 质粒叫R 质粒，大部分质粒是可以转移的，但也存在着不能够转移的质粒 环形质粒分子 环形染色体DNA大肠杆菌细胞质粒分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
环形双链的质粒分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形（），这样的通常呈现超螺旋的构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环（）N此即构型；3若质粒经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子l ），通称构型（见图—l。
(a) (b)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图由于琼脂糖中加有嵌入型染料漠化乙锭.因此, 在紫外线照射下DNA电泳条带呈橘黄色。
（a）道中的SC DNA走在凝胶的最前沿.OC DNA则位于凝胶的最后边Mb）道中的LDNA是经核酸内切限制醉切割质粒之后产生的.它在凝胶中的位置介于OC DNA 和SC DNA 之间在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
EMBL3和EMBL4的限制性酶切位点（23Kb）
4、λgt体的限制性酶切位点
末端，可作为β-半 乳糖苷酶融合蛋白表达； 可用抗体探针筛选 • 蓝白斑筛选 • 温度敏感诱导表达
3、比较pGEM和pUC18/19
• 含有噬菌体的启动子，可合成RNA
• 用途：
杂交探针
体外翻译
体外剪切反应
4、T载体 • pMD18-T Vector 高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体，由pUC18载体改建而成 • 在 pUC18载体的MCS位点处的Xbal和Sal识别 位点之间插入EcoRV识别位点， 用EcoRV进行 酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。 • 大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在 PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性
噬菌粒图解及克隆位点
• 超感染
• 如何保证子代病毒正链DNA主要来自噬菌粒基
因组？
噬菌粒中含有来自野生型M13 DNA的基因间隔区
辅助噬菌体（M13K07）基因组中带有来自M13载体
的基因间隔区
第五节 真核细胞用载体
• 穿梭载体（shuttle vectors）
在原核细胞中复制扩增；
在真核细胞中扩增、表达
• 基本条件：
①原核基因的复制其始序列和筛选标记 ②真核基因的复制其始序列和筛选标记 ③启动子序列
④转录终止和polyA加入的信号序列
⑤限制性内切酶位点
通用的酵母表达载体
重组体借助Aox1的5’及3’区序列整合入宿主细胞
两种典型的酵母（Pichia）表达载体pPIC3和pPIC3K
第六节 人工染色体
• 溶源 寄主细胞仍然存活着并持续地进行细胞分裂， 不产生子代噬菌体颗粒 • 溶菌 寄主细胞因裂解而致死，释放出许多噬菌体颗 粒
λDNA限制图谱
2（5-24Kb）
3、EMBL系列载体构建基因组MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ
• 裂解基因中的琥珀突变
• UAG UAA
琥珀型 赭石型
amber ochre
UGA
乳白型
opal
• 无义突变（nonsense）
使蛋白质长度提前终止，引起多肽长度变化
• 抑制基因 编码生成突变的tRNA（反密码子突变或其它位臵突 变），识别无义密码子，但携带氨基酸。
• 某些载体的宿主菌带有一个或者两个很强的琥 珀突变抑制基因 SupE 在UAG密码子的位臵上加上谷氨酰胺 SupF 在UAG密码子的位臵上加上酪氨酸 注意这些琥珀突变抑制基因的作用不能互相代替
5、E.Coli的表达载体
• 表达载体和克隆载体的主要区别：
强启动子和终止序列
• E.Coli：SD序列
真核生物基因在原核生物E.Coli中表达 • 转录 • 翻译
• 翻译后修饰
• 诱导表达和分泌表达
PBV221限制性内切酶图谱（30 ℃ / 42℃ ）
信号肽
一般特征： 含13-26个氨基酸残基，
在或靠近其N端有
一至多个带正电荷的 氨基酸， 在中部为由10-15个氨基酸 （大部或全部是疏水性的）
组成的疏水核
pTA1529质粒含大肠杆菌phoA基因的启动子和信号肽序列
第二节 λ噬菌体载体
1、λ噬菌体的特性 • 48.5 Kb 线性双链DNA
• 在病毒颗粒内线性，两端单链互补被称作
cos末端(cos end) • 一旦进入细胞，两个cos末端就会迅速相互结 合，形成有缺口的环状基因组，细胞的DNA连 接酶可以修补该缺口
• 主要不足之处： 易产生外源DNA片段的部分缺失，且外源 DNA越大其缺失频率越高，一般情况下其有效 的最大克隆能力仅1500bp
3、噬菌粒（phagemid）： 带有丝状噬菌体复制起点的质粒 • 可容纳较长的外源DNA片段（约10Kb）
• 在具有ColE1复制起点及抗生素选择标记的质 粒上加上单拷贝的丝状噬菌体主要基因间隔区
• 大容量
减少构建和筛选的重组克隆数 多轮筛选
• λ噬菌体载体容量有限
当噬菌体基因组DNA的长度大于野生型λ噬菌体基因 组的105%或小于野生型λ噬菌体基因组的78%时，其存 活力剧降
第三节 粘质粒载体
• 柯斯质粒载体（35-45Kb） cos site-carring plasmid 带有粘性末端位点（cos）的质粒
• 单独都不能产生有活性的β-半乳糖苷酶
两者结合在一起，才能形成有功能的β-半乳糖 苷酶（α互补） • lacZ’内，具有一段多克隆位点序列（MCS） 在正常情况下，插入到MCS的外源DNA片段， 都会阻断α-肽链的合成，因此含有重组质粒载 体的克隆是无色的，它可以与含有非重组质粒 载体的克隆形成的蓝色“背景”明显地区别开 来
pUC18/19质粒的多克隆位点
• 多克隆位点
• 筛选标记
• 拷贝数
α互补
• 分子量
乳糖操纵子模型
• IPTG
非代谢诱导物
• Xgal（无色） β-半乳糖苷酶
半乳糖+5-溴-4-氯靛蓝（深蓝色） β-半乳糖苷酶Xgal显色反应检测法 • 质粒 编码β-半乳糖苷酶氨基末端（ α –肽段）
• 宿主细胞 编码缺陷型β-半乳糖苷酶（失去正 常的氨基末端）
2、BAC（细菌人工染色体，bacterial artificial chromosome） 3、PAC（P1-derived artificial chromosome）
4、MAC（哺乳动物人工染色体，mammalian artificial chromosome）
YAC克隆示意图
各种克隆载体的比较
氯霉素、壮观霉素
• ColE1复制起点质粒的复制调控
• 质粒的不相容性
利用同一复制系统的不同质粒不能稳定共存的现象
带pMBI（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所 产生的转录物的方向及其粗略大小
质粒不亲和现象图解
2、比较pBR322和pUC18/19
pBR322质粒限制性内切酶图谱
pUC18/19质粒的限制性内切酶图谱
1、YAC（酵母人工染色体，yeast artificial chromosome）
在酵母细胞中克隆外源DNA大片段的克隆体系，由酵
母染色体中分离出来的DNA复制其始序列（ARS，自
主复制序列）、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组
成的能自我复制的线性克隆载体
• 主要缺点：易出现嵌合体 不 Nhomakorabea定 不容易与酵母自身染色体相分离
• 复制
RF 200个拷贝/细胞 1000个子代噬菌体颗粒/ 每个细胞每个世代
2、 M13噬菌体载体
• 丝状噬菌体的所有基因均为必需基因，
外源基因放在哪里？ 基因间隔区 基因Ⅱ与基因Ⅳ 基因Ⅷ与基因Ⅲ
重组操作
双链DNA
单链DNA
可用于DNA序列分析和位点特异性突变的研究
M13mp18和M13mp19载体的限制酶切图
使用双cos位点载体c2RB进行的粘质粒克隆
第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒
1、 M13噬菌体的特征 • M13、f1和fd长度为6.4Kb，单链环状DNA分 子（正义DNA基因组） • 仅有的病毒基因组90%以上都编码蛋白质，10 个基因中大多数仅以数个核苷酸相隔，仅有两 个较长的基因间隔区。
第四章 基因克隆的载体
• 载体基本条件： 自我复制
限制性内切酶位点
筛选标记
• 克隆载体/表达载体
表达载体含有启动子和终止序列
第一节 质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 第三节 粘质粒载体
第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒
第五节 真核细胞用载体
第六节 人工染色体
第一节 质粒载体
1、一般特性
• 双链闭合环状 • 松弛型质粒/严紧型质粒