WESTERN-BLOT实验

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western-blot实验方法

western-blot实验方法1、试剂耗材的准备：（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：（2）10 ×丽春红染液：（3）TBS 缓冲液：（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。

（7）底物显色液ECL，4℃避光保存，现用现配。

（8）显影液和定影液用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。

室温避光存放。

2、实验步骤：（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。

（2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。

（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃预冷备用，冷却装置于- 80 ℃冰箱冷冻备用）。

（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。

用纯水冲洗膜2 次。

浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。

海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。

（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。

按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。

将膜与凝胶对齐。

用玻璃棒赶走气泡。

（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。

放入电转槽中。

使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。

（9）将电转槽放在冰水盒中。

将预冻的冷却装置放入槽内。

缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。

（10）盖好盖子，接上电源。

根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。

维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项

WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。

如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。

实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。

0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。

小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。

用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。

westernblot法

Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。

蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。

凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。

转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。

免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。

数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。

二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。

蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。

在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。

在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。

在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。

在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。

总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。

在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。

Western-blot法

W e s t e r n-b l o t法(总19页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--一。

免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。

免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。

它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。

典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。

免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

图1 免疫印迹法原理示意图第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移。

将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位。

将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。

常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。

阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。

Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧

常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进行分装后保存于-20 ℃冰箱中。

Westernblot实验技术

Western blot试剂配制1. 30%丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。

这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

2. 10%SDS：称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。

贮存液保存于室温。

3. 10%AP（过硫酸铵）：称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。

4. 1.5MTris-HCl：称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。

5. 0.5MTris-HCl：称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。

6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.330.3g Tris 15.15g Tris187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液10g SDS 5g SDS8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)2g SDS10ml 甘油超纯水定容到50ml。

Western blot实验步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）原理
• 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）是蛋白质分析过程中最常用的技术。
• 蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在 PAGE 中加入阴离子去污剂 SDS, SDS 将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS 将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的 SDS 量，而 SDS 与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比，即迁移率决定于蛋白质分子量大小。因此利用 SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 5. 10×电极缓冲液：称取Tris 30g、甘氨酸144g，加入10％SDS 100ml，定容至 1000ml, pH8.8
• 6. 2X样品缓冲液:甘油2ml（或称取蔗糖2g ），加入10％SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、 ß －巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。 • （加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子, 可以自由通过凝胶孔径, 所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时, 即可停止电泳）
• 蛋白质样品在上样电泳前均需变性。

western blot实验实验步骤

western blot实验实验步骤
Western blot实验步骤如下：
收集蛋白样品：使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。

然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

SDS-PAGE凝胶配制：参考一些文献资料进行配制。

样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

上样与电泳：将处理后的蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

Western-blot_试验技术

溶解蛋白策略
• 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。 • 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。 • 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 • 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。 • 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。
实验步骤
• • 配胶制胶先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用，拔去梳子。上样，所有上样孔均加样，没有样本，用上样缓冲液代替。 100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳结束。
仪器与设备
• • • • • • 低温超速离心机（Eppendorf公司）分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司）电泳仪（Bio-Rad 公司）垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司）硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
配制试剂
• 10×电泳Buffer 称取Tris-base 30.3克 glycine 144克加去离子水，定容至1000ml SDS 10克 1.5M Tris.HCl PH 8.8 称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8 称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml 转膜缓冲液称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml，临用前加200ml甲醇 10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。

(最新整理)westernblot详解

蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至
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20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵
①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。
②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
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具体情况依照说明书
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灌分离胶：用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶，灌胶速度须缓慢，避免产生气泡灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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二配制浓缩胶
准备物品：移液枪烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱）， TEMD（4度），SDS（常温）
制作标准曲线（插入表格）
检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝 +95 l

western blot实验方法

Western blot1 提蛋白[裂解液：碧云天RIPA裂解液（强）; 产品编号：P0013B 蛋白酶抑制剂：PMSF(100mM)；产品编号：ST506]※裂解样品的所有步骤都需在冰上进行贴壁细胞：弃掉培养液，用冷PBS洗2-3遍，将残留液体尽可能吸干。

按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入RIPA裂解液（使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的终浓度为1mM，混匀）。

裂解液与细胞充分接触，冰上孵育后用细胞刮刮取。

4℃，10000-14000g离心15分钟，将上清吸至另一干净EP管。

2 测定蛋白浓度[碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）；产品编号：P0010S]酶标仪测定波长：570nm标准曲线：X轴浓度Y轴吸光度3 蛋白样品保存：避免反复冻融，分装后-80℃冻存4 SDS-PAGE(1)装板，梳子下1cm处做标记(2)根据目的蛋白分子量大小配适当浓度分离胶，灌胶至标记处，再沿板均匀加入约1ml 70%乙醇。

分离胶（下层胶）：国产1.0mm 板一块分离胶体积约7ml※灌胶前将所有组分混匀(3)胶凝后（通常室温条件下30min内凝；胶浓度偏低或室内温度偏低的条件下胶凝聚时间延长；长时间不凝则考虑组分未混匀或AP等可能失效）将乙醇倒掉，滤纸吸干，勿碰到胶。

然后加上层胶，快满时插梳子，补胶。

浓缩胶（上层胶）：4%(总体积3ml)已配好的胶可用保鲜膜包好4℃短期保存，但可能会出现加样孔皱缩。

30%丙烯酰胺：丙烯酰胺 29g N-亚甲双丙烯酰胺 1g 定容至100ml, 溶解过滤，4℃避光保存。

1.5M Tris-Hcl(pH 8.8): Tris 18.171g 100ml, 调 pH至8.8ddH2O0.5M Tris-Hcl(pH 6.8): Tris 6.05g 100ml, 调 pH至6.8ddH2O10% SDS：SDS 10g, ddH2O 定容至100ml。

10% AP: AP 0.1g, ddH2O 1ml, 溶解后分装（每份约一次用量），-20 ℃冻存。

Western blot实验步骤

硝酸纤维素膜（NC 膜）的预处理：转移缓冲液湿润膜；
硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力地结合在一起。
从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，最大的蛋白结合量可达80-150μg/cm2。
• PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
• 带正电的尼龙膜(目前已不用)；
• 蛋白结合于膜的作用力为非共价键的疏水力、静电力
Western blot（免疫印迹）
Western blot是20世纪70年代末和80年代初，在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的一种广泛应用于蛋白质检测的分子生物学技术。它是将蛋白质凝胶电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测技术。与 Southern、Northern杂交方法类似，但Western Blot被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，它具有直观、特异、灵敏（pg)的优点，且可进行蛋白质的定性及半定量分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）原理
• 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是蛋白质分析过程中最常用的技术。
• 蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在PAGE 中加入阴离子去污剂SDS, SDS将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的 SDS量，而SDS与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比，即迁移率决定于蛋白质分子量大小。因此利用 SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。

完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。

抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。

n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

westernblot实验报告

westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。

本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。

一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。

首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。

接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。

二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。

2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。

3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。

4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。

5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。

6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。

7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。

三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。

首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。

其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。

此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。

Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。

通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。

此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。

然而，Western Blot也存在一些局限性。

首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。

Western blot 实验技术

最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。
二抗与底物反应显色•辣根过氧 Nhomakorabea物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法
朱珊丽老师的结果
1 2 3 4 M Mr 1 2 3 4
Fig 1.SDS-PAGE and Western blot analysis for the CT-MOMP multi-epitopes protein
达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应
转膜
硝酸纤维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ）
特殊要求下的选择目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
三、免疫染色 1．转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2．TBS洗膜1-2次，10min/次。 3. 加一抗孵育，37 ℃或室温孵育1h。 4. TBS洗3次，10min/次。 5．加HRP标记的抗体，室温1h 。 6．TBS洗3次，10min/次。 7．NC膜再转入DAB显色液中，避光反应，待显色反应
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色
【器材】
转移电泳仪，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀，手套
【试剂】
1．一抗 2．二抗：HRP标记的IgG 抗体 3．转移buffer：Tris 3.03g，Gly14.4g，甲醇200ml，加

WB-Western Blot实验步骤及讲解

Western Blot
概念
通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。
分类
➢ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
蛋白提取步骤
为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。
1. 于-20℃冰箱取出蛋白裂解液及PMSF等，常温下溶解；BCA测试盒、5×Buffer置冰上备用；将已高压消毒的匀浆器及弯镊置冰上冷却备用；开启低温离心机调至4℃ 备用、烤箱调至37℃备用。
2. 组织样本于冰上冻融后，称取适量组织（约30-50mg）放入匀浆器中，准确记录所夹取组织重量。
蛋白提取步骤
5. 上述裂解液于低温离心机内离心，12000rpm×15min，4℃。 6. 离心完成后，小心取出离心管，可见液体分成3层，上层为白色脂肪层，中层为澄清蛋白质溶液，下层为组织沉淀，用适当量程的移液枪小心吸取中间层蛋白溶液于1.5mlEP管中，记录所吸取体积（ul）。注意：宁可少吸不可多吸！
实验步骤
5、一抗孵育根据目的蛋白选择对应的一抗及合适的稀释比例，用封闭液对抗体
进行稀释。一抗孵育条件：4℃冰箱，过夜（＞12h）。
建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书，了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。
实验步骤
6、洗涤一抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15 min或4次×10 min 。
选择二抗抗体取决于一抗抗体的种属来源。例如，如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体，二抗抗体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克隆抗体，二抗抗体必须是抗兔的抗体。

Western_blotting

3. 显色反应
ECL超敏发光液
辣根过氧化物酶在过氧化氢存在的条件下催化鲁米诺，生成一种不稳定的中间产物，当其衰变时即可发光。
二抗结合漂洗后，加入ECL超敏发光液，避光发光3-5分钟。
曝光
发出的光可使标准X-光片感光，产生较易识别的图像。
发光3-5分钟后，将膜夹如透明薄膜中，置于曝光夹（感光屏）中曝光3min左右，然后进行显影液显影，定影液定影（和洗照片是一样的）
方法一: 直接法
优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
抗原抗体反应
方法二: 间接法
优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗
结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择
免疫印迹的基本步骤
➢ 蛋白质样品的制备 ➢ 蛋白质的SDS-PAGE电泳 ➢ 蛋白质的膜转移 ➢ 封闭与抗原抗体反应 ➢ 显色（显影）反应
实验流程
样品收集制备 SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白
剥胶并电转移
封闭
一抗4℃孵育过夜第二天，二抗37℃孵育1小时，显影曝光
条带灰度分析定量
蛋白质样品的制备
1. 电转移相关问题：滤纸、胶、膜之间的大小。滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成断路。膜必须随时保持湿润（干膜法除外）。系统降温
2. 抗体的性质影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。
常见问题及解决办法
3 .样品中待检测蛋白质的含量采用目前的技术，浓度低至0.1ng的蛋白亦可被检出 4. 背景问题非特异性条带的来源一般有两种：一种是由于制剂中存在的非特异抗体产生的背景条带，另一种则是由于特异性抗体与含有与待测抗原类似表位的多肽发生的交叉反应 ① 弥散性高背景：可能原因是二抗产生,解决办法:缩短二抗孵育时间；用高浓度的蛋白质来吸附二抗（二抗内加3％BSA）；使用另外的二抗；缩短一抗和二抗的孵育时间；延长每次清洗时间。

western blot 实验原理

western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。

Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。

蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。

2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。

在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。

3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。

转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。

4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。

通过此步骤可以减少假阳性的可能性。

5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。

抗体将与目标蛋白质特异性结合。

6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。

这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。

7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。

Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。